一种提取棉花的线粒体DNA的方法

提取植物DNA方法

提取植物DNA方法植物DNA的提取方法是将植物细胞中的DNA分离出来，以便进行进一步的研究。

以下是常用的植物DNA提取方法：1. CTAB法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种表面活性剂，可以溶解脂质，破坏细胞膜，从而释放DNA。

首先，将植物样品粉碎，加入CTAB缓冲液中并进行润湿，然后加入蛋白酶，破坏细胞膜。

接下来，加入CTAB-蛋白酶混合液，室温静置，使DNA与CTAB结合。

之后，将混合液经过苯酚-氯仿提取，将DNA从其他组分中分离出来。

最后，使用异丙醇沉淀法将DNA沉淀，洗涤并溶解。

2. 硅胶柱法：硅胶柱法适用于小规模提取和纯化植物DNA。

首先，将植物样品粉碎，加入提取缓冲液中，并加入蛋白酶进行细胞壁降解。

接下来，将溶有脂质的提取液加载到硅胶柱上，使用重力流动分离DNA。

然后，使用洗涤缓冲液去除残余的污染物。

最后，使用低盐缓冲液将DNA从硅胶柱上洗脱，并收集纯化的DNA。

3. 高盐法：高盐法适用于粗提植物DNA。

首先，将植物样品细碎，加入高盐缓冲液中，其中含有高浓度的盐和蛋白酶。

高盐浓度可以破坏细胞膜，并使DNA 从蛋白质中解离出来。

然后，使用异丙醇沉淀法将DNA沉淀，洗涤并溶解。

4. 快速提取法：快速提取法是一种高效和便捷的方式，适用于大规模提取植物DNA。

首先，将植物样品经过快速研磨处理，将DNA释放到提取缓冲液中。

然后，使用聚乙二醇或盐酸沉淀方法使DNA沉淀，然后洗涤并溶解。

这些方法在植物科学研究中被广泛使用。

在选择提取方法时，需要考虑样品量、样品类型、实验目的和所需纯度等因素。

植物DNA的提取方法的选择也可以根据实验室设备和研究经验进行调整，以获得满意的结果。

需要注意的是，植物样品在提取DNA之前需要进行适当的贮存和处理。

样品应在低温下保存，以保持DNA的完整性。

此外，处理样品时要避免污染和酶解，以确保提取的DNA质量。

植物dna提取方法

植物dna提取方法
植物DNA提取是从植物细胞中分离和纯化DNA的过程。

以下是一种常见的植物DNA提取方法，称为CTAB法（Cetyltrimethylammonium Bromide）：
1.材料准备：
(1)植物样品（叶片、根部、花粉等）
(2)CTAB缓冲液（含CTAB、EDTA、Tris-HCl、NaCl等成分）
(3)Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol 混合溶液
(4)高盐溶液（含NaCl）
2.样品研磨：将植物样品磨碎成细粉末状。

3.细胞破碎：将样品与CTAB缓冲液混合，加入适量的RNase，放
入65°C水浴中加热。

4.提取DNA：添加等体积的Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol混
合溶液，混合离心，将上清液转移到新的离心管中。

5.沉淀DNA：加入等体积的高盐溶液，混合后冷藏，待DNA沉淀。

6.洗涤：将上清液转移到新的离心管中，加入70%乙醇洗涤，离心，
将上清液倒掉，再次洗涤。

7.溶解：使用TE缓冲液溶解DNA，或直接使用水溶解。

8.质量检测：使用分光光度计或凝胶电泳等方法检测DNA的浓度
和质量。

以上步骤仅为一种常见的植物DNA提取方法，实际操作中可能根据实验目的、样品类型和实验室条件等进行适当的调整和优化。

线粒体DNA提取SOP

线粒体DNA提取SOP
一、蛋白酶K法
1、使用液氮将50mg新鲜组织样本研磨至粉末状；
2、转入1.5mL离心管中加入溶液A（4℃）1mL，冰浴中吹打分散后沉降大块沉淀；
3、4℃，1000r/min离心1min，分离颗粒细胞核和细胞碎片；
4、回收上清至新的1.5mL离心管，12000r/min离心10min；
5、弃上清，尽量去除干净；
6、加50uL蛋白酶K，55℃水浴2.5h，期间每隔15min轻轻混匀；
7、加水至500uL；
8、加入等体积的酚、氯仿、异丙醇抽提，轻柔上下翻转离心管15min；
9、1000r/min离心10min；
10、水相转移至新管并加入各500uL的氯仿和异丙醇，轻柔上下翻转离心管15min；
11、1000r/min离心10min；
12、水相转移至新管，加入2倍体积的冰乙醇沉淀，静置10min；
13、12000r/min离心2min，沉淀即为mtDNA；
14、70%乙醇清洗线粒体DNA，置于空气中自然干燥后加入适量TE液溶解，于4℃保存。

线粒体基因组测序策略和方法

一、为何需要针对线粒体基因组进行测序
线粒体基因组测序对于研究人类以及其它生物的遗传学具有重要意义。线粒体基因组具有独特的生物学特性，如母系遗传、高突变率等，因此对其进行测序有助于揭示物种演化和人类起源的奥秘。此外，线粒体基因组测序在医学和临床领域也有广泛的应用，如遗传疾病诊断、肿瘤发生机制研究等。
关键词
棉花线粒体基因组、测序、序列初步分析、进化、遗传多样性
内容大纲
1、棉花线粒体基因组的测序
2、测序数据的初步分析
引出实验设计 1、实验材料棉花品种：中棉所41 2、样品处理采集棉花幼叶，提iSeq X Ten进行测序，获得原始数据。
线粒体基因组测序策略和方法
目录
01 一、为何需要针对线体基因组测序策略制定
03
三、线粒体基因组测序方法
04 四、数据分析
05 参考内容
线粒体基因组测序是一种用于研究线粒体DNA序列的方法，它有助于揭示人类以及其它生物的遗传奥秘。线粒体基因组测序涉及到多个方面，包括策略制定、测序技术选择、测序深度设置、DNA提取、PCR扩增和数据分析等。本次演示将就这些方面进行详细阐述。
2、测序深度设置
测序深度是指单位时间内所获得的序列数据量。合理的测序深度能够保证测序结果的可靠性和全面性。在确定测序深度时，需要考虑研究目标、样本数量和实验成本等因素。对于线粒体基因组测序而言，一般要求较高的测序深度以保证突变的检测精度和覆盖率。
三、线粒体基因组测序方法
1、DNA提取
在进行线粒体基因组测序之前，首先需要从样本中提取出高质量的DNA。由于线粒体DNA含量相对较低，因此需要采用一些特异性引物或试剂盒来富集线粒体DNA。常用的DNA提取方法包括酚-氯仿抽提法、蛋白酶K消化法等。

植物提取dna的步骤及原理

植物提取dna的步骤及原理以植物提取DNA的步骤及原理为标题，本文将介绍植物提取DNA 的基本步骤以及相关原理。

植物提取DNA是指从植物细胞中分离出DNA分子的过程。

植物细胞中的DNA包含了植物的遗传信息，因此提取植物DNA对于遗传研究和基因工程具有重要意义。

下面是植物提取DNA的基本步骤：步骤一：准备样品需要选择一种适合的植物样品。

可以选择新鲜的叶片、茎段或种子作为样品。

样品应该尽可能新鲜，并且避免受到污染或损伤。

步骤二：打碎细胞将样品放入冰冻细胞研磨器中，加入研磨缓冲液，并用研磨器将样品研磨成细胞悬浮液。

研磨缓冲液中的盐和洗涤剂有助于破坏细胞壁，并释放细胞内的DNA。

步骤三：溶解细胞膜将研磨后的细胞悬浮液转移到离心管中，并加入含有洗涤剂的细胞裂解液。

洗涤剂能够破坏细胞膜，使DNA从细胞中释放出来。

步骤四：沉淀DNA将细胞裂解液置于高速离心机中进行离心，离心过程中，DNA会被沉淀到离心管底部形成一个白色的沉淀物。

离心后，将上清液倒掉，只保留沉淀物。

步骤五：洗涤DNA使用75%乙醇溶液洗涤DNA沉淀物，以去除离心过程中残留的盐和洗涤剂等杂质。

洗涤后，用吸管或微量移液器将乙醇溶液完全抽尽，避免干燥过程中DNA沉淀物溶解。

步骤六：溶解DNA将洗涤后的DNA沉淀物用适量的溶解液溶解，常用的溶解液包括TE缓冲液或纯净水。

溶解后的DNA溶液可以用于后续的实验操作，如PCR扩增、酶切等。

以上就是植物提取DNA的基本步骤，下面将简要介绍相关的原理。

DNA提取的原理主要基于细胞的破坏和DNA的溶解。

在打碎细胞的过程中，使用研磨缓冲液破坏细胞壁，释放细胞内的DNA。

细胞裂解液中的洗涤剂能够破坏细胞膜，使DNA从细胞中释放出来。

离心过程中，DNA分子由于其较大的分子量而沉淀到离心管底部，而其他细胞碎片和杂质则在上清液中。

洗涤过程中使用的乙醇溶液能够去除离心过程中残留的盐和洗涤剂等杂质。

最后，将DNA沉淀物溶解在适当的溶解液中，得到DNA溶液。

动物线粒体DNA提取的原理和方法

动物线粒体D NA 提取的原理和方法*X夏玉玲刘彦群鲁成X X (西南农业大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点实验室重庆 400716)摘要从动物线粒体的特征、线粒体的鉴定方法、提取线粒体D NA 各步骤等原理出发,比较了目前常用的几种提取线粒体D N A 的方法,提出动物线粒体D N A 提取的几点关键步骤,并提出一套优化的操作流程。

关键词线粒体线粒体D N A 提取方法线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。

它是细胞进行氧化磷酸化的场所。

线粒体基因组不仅是研究D N A 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。

线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。

由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索[1]。

动物线粒体D NA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[2]。

进行动物线粒体D NA 方面意义重大,现将线粒体D N A 的提取的原理和方法介绍如下:1 提取动物线粒体D N A 的原理1.1 线粒体的特征线粒体是由内外两层膜组成,外膜光滑,内膜向内回旋折叠,形成许多横隔。

线粒体中含有多种氧化酶,在此进行TCA 循环、呼吸连电子传递和氧化磷酸化等产能作用,并传递和储存所产生的能量,是细胞的动力工厂和生物氧化的主要场所。

线粒体的形状、大小、数目和组成,在不同生物、不同组织以及生活于不同条件下的细胞中变化很大。

线粒体的外型呈多样化,绝大多数类型细胞呈圆形、卵原形,也有呈杆状的。

其体积大小不等,一般直径比较一致,为0.5~1.0L m,长度为1~5L m,最长可达到7L m 。

线粒体的数目与生物种类、组织、细胞类型和细胞生理功能变化有关。

锥虫和有的真菌只有一个线粒体,大多数动物的肝脏细胞含有上千个线粒体,生殖细胞如卵母细胞可达到30万个线粒体,家蚕的每个后部丝腺细胞只有2~4个线粒体[13],而有的细胞根本没有线粒体;在细胞生命活动旺盛时,它的数量多,在衰老时,数量少,有时可能消失;新生细胞比衰老细胞或病变细胞的线粒体多。

棉花腺苷高半胱氨酸水解酶cDNA的克隆、表达及染色体定位

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(6): 958−964/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@基金项目: 国家自然科学基金项目(30471104); 国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2002CB111303); 教育部新世纪优秀人才项目(NCET-04-0500); 教育部111引智计划(B08025)作者简介: 佘义斌(1981−), 男, 江苏人, 硕士, 从事作物遗传育种研究; 朱一超(1980−), 男, 江苏人, 在读博士, 从事棉花遗传学研究。

** 同等贡献。

*通讯作者(Corresponding author): 郭旺珍。

E-mail: moelab@Received(收稿日期): 2007-08-15; Accepted(接受日期): 2008-01-15.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00958棉花腺苷高半胱氨酸水解酶cDNA 的克隆、表达及染色体定位佘义斌** 朱一超** 张天真郭旺珍*(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京210095)摘要: 腺苷高半胱氨酸水解酶是调节细胞内甲基反应的一个关键酶。

通过对高品质纤维陆地棉品系7235的棉纤维混合cDNA 文库随机测序, 得到一个棉花腺苷高半胱氨酸水解酶(编号: g073a03a,GhSAHH)的cDNA 序列。

该cDNA 序列长1 598 bp, 利用5′RACE 技术得到上游318 bp 的片段,序列拼接获得全长为1 916 bp 的cDNA 序列, ORF 为1 458 bp, 编码485个氨基酸, 其理论上的等电点p I ＝5.69, 分子量MW ＝53.2 kD 。

该基因在不同组织、器官中均表达, 在根、下胚轴和纤维发育早期优势表达。

根据Southern 杂交结果推测GhSAHH 基因在陆地棉基因组中为单拷贝。

棉花DNA提取方法

棉花DNA 提取方法DNA 提取采用CTAB 法(Paterson et al., 1993),并稍加修改，具体步骤如下：(1)将1g 冻叶(或鲜叶)放入预冷的研钵中，加入液氮研磨。

分2次加入5ml 新鲜配制的提取缓冲液(表3-2)，转入10ml 的离心管中，涡旋混匀，冰浴保存10min 。

10000rpm 离心20min (4°C),弃于沉淀中加入3ml 65 C 预热的裂解缓冲液(表3-3)，并用，涡旋混匀，65C 水浴30min ；加入3ml 氯仿：异戊醇(24： 1)混合液，翻转50次以上， 10000rpm 离心20min (15C)，将上清转入10 ml 的离心管中，加0.6 体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min ，10000rpm ，离心10min (RT )，弃上清，于沉淀中加入2 ml 70%的乙醇洗涤，并转入5 ml 的离心管中，10000rpm 离心5min 。

倒掉上清液，通风干燥 20min ；(4) 加2 ml TE 缓冲液溶解，65C 培养10〜30min ，加等体积的氯仿：异戊醇(24 : 1)，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min ， 10000rpm 离心 10min ；(5) 上清液转入5ml 离心管中，加0.1体积的3M 醋酸钠(pH 5.2)，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min ， 10000rpm 离心5min 。

弃上清液，加1 ml 70%乙醇洗DNA 小团，转入1.5 ml 的离心管中， 10000rpm 离心5min 。

弃上清液，自然通风干燥DNA 小团；(6) 加 200 l TE 缓冲液(10mM Tris/HCl(PH 8.0)，1mM EDTA(PH 8.0)，PH 8.0)溶解 DNA (4C ，30min 以上)，并保存。

(2)铜丝搅松(3)表3-2 DNA提取缓冲液配制Table 3-2 Extration solutions to extract DNA工作液Working Solution ml ml存储液Stock Solution0.35M Glucose34.68g 6.936g Glucose0.1M Tris.HCl5010.0 1.0M Tris.HCl(pH 8.0)5mM Na.EDTA5 1.00.5M EDTA(pH 8.0) 2% PVP10020.010% PVP 1%(V/V)P-Me5 1.0Liquid dd Water34068.0Total500ml100ml表3-3裂解缓冲液配制Table 3-3 Lysis solutions to extract DNA工作液Working Solution ml Ml存储液Stock Solution1.4M NaCl40.908g8.1816g Salt0.1M Tris.HCl5010 1.0M Tris.HCl(pH 8.0)20mM Na.EDTA2040.5M Na.EDTA(pH 8.0) 2%CTAB1002010% CTAB2% PVP1002010% PVP 1%(V/V)P-Me5 1.0Liquid dd Water22545Total500ml100ml。

利用BSA-Seq技术初步鉴定棉花芽黄候选基因

绿洲农业科学与工程Oasis Agriculture Science and Engineering第9卷第2期2023年12月Vol.9No.2Dec.2023利用BSA-Seq 技术初步鉴定棉花芽黄候选基因王娟，王新，周小凤，马晓梅，田琴，李保成，余渝，董承光*（新疆农垦科学院/农业农村部西北内陆区棉花生物学与遗传育种重点实验室，新疆石河子832000）摘要：芽黄性状可作为棉花育种的标记性状，在棉花杂交选育中可减轻棉花杂交制种和鉴定过程，还可以作为叶绿素等生理代谢研究的理想材料。

研究棉花芽黄突变体具有重要的理论和实践意义。

本研究以芽黄突变体115-23与绿叶正常材料JSH1527为亲本，构建F 2分离群体，鉴定后代芽黄性状，选择30个芽黄单株和30个正常绿叶单株构建混合池，对4个样本（2个亲本池和2个混合池）开展全基因组重测序，采用SNP-index 进行关联分析，确定芽黄基因的候选区域，筛选芽黄候选基因。

结果表明，在2个亲本之间共获得840，612个多态性SNP ，利用Δ（SNP-index ）方法，在95%的置信区间内将候选区域定位到染色体D02区间，包含93个候选基因，其中4个基因功能注释与叶绿体合成等相关，可能是调控棉花叶色的候选基因。

研究结果可为棉花芽黄分子机制及芽黄相关基因的克隆奠定理论基础。

关键词：棉花；芽黄；BSA-Seq ；候选基因Preliminary Identification of Candidate Genes withVirscent Gene inCotton Based on BSA-SeqWANG Juan ，WANG Xin ，ZHOU Xiao-feng ，MA Xiao-mei ，TIAN Qin ，LI Bao-cheng ，YU Yu ，DONGCheng-guang *（Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science/Northwest Inland Region Key Laboratory of CottonBiology and Genetic Breeding ，Ministry of Agriculture and Rural Affairs ，Shihezi 832000，Xinjiang ）Abstract ：Virescent trait could be used as a natural marker for breeding to reduce time and process of hybrid breeding ，moreoverthey were ideal model systems to study chlorophyll and chloroplast biosynthesis and biodegradation process.the virescent mutant in cot⁃ton is of great theoretical and practical implications.In this study ，an F 2segregation population was constructed derived from 115-23（virscent mutant ）and JSH1527（Normal green trait ），based on the identification of virescent trait ，30virescent and 30green plants were selected to construct a mixed pool ，four samples （2parent pools and 2mixed pools ）were sequenced ，SNP-index were used for association analysis to determine the candidate regions of virescentgenes.As a result ，840，612SNPs were obtained between the two parents ，one candidate physical regions showing confidence indices higher than 95%were obtained on chromosome D02，which con⁃tained 93annotated genes ，four of these genes were functional annotations related to chloroplast synthesis and may be candidate genes for the regulation of cotton leaf color.This study laid a foundation for further analyzing the genetic mechanism and clones of genes ofcotton virescent formation.Keywords ：Cotton;Virescent;BSA-Seq;Candidate genes棉花芽黄性状是棉花叶片颜色突变的一种典型性状，一般表现为苗期从第一片真叶开始叶片颜色黄化，到蕾期以后叶片叶绿素含量逐渐增加，又逐渐由黄化变为绿色，表现为正常植株叶片颜色[1]。

CTAB法提取植物总DNA

CTAB法提取植物总DNACTAB法（Cetyltrimethylammonium bromide法）是一种常用的植物总DNA提取方法，其优点是简单、高效、成本低、适用性广，能够快速提取高质量的DNA。

CTAB法利用季铵盐CTAB（Cetyltrimethylammonium bromide）和NaCl共同提取植物样品中的DNA。

下面就CTAB法的步骤进行详细介绍。

材料：- 植物样品- CTAB提取缓冲液（含0.6 M CTAB和NaCl）- 65℃和37℃的水浴- 70%、95%和100%的乙醇- TE 缓冲液（含10 mM Tris-HCl和1 mM EDTA，pH 8.0）步骤：1. 准备植物样品将新鲜植物样品（约0.1g）用液氮粉碎成粉末，加入2 mL CTAB提取缓冲液中，研磨均匀。

可以使用带球磨器或者手持器具进行研磨。

2. 加入蛋白酶K加入加入50μL蛋白酶K (20mg/L) 溶液后，65℃恒温振荡2~3 h。

蛋白酶K的作用是降解蛋白质，提高DNA的纯度。

3. 加入腰芽菜素和EB加入5μL腰芽菜素（10mg/mL）和5μL EB（1mg/mL）后，65℃水浴12~15min，使溶液呈现棕黄色，使样品中的腰芽菜素结合到DNA上。

4. 加入氯仿和异丙醇加入等体积氯仿和异丙醇后，轻轻摇匀，离心10min。

离心之后，样品分为四层：上层是异丙醇、第二层是氯仿，中间是粘稠的蛋白质、细胞碎片和杂质，最下面是DNA层。

5. 取出DNA层用200μL的容器沿着DNA层边缘吸取DNA，转移到新管中，并加入300μL75%乙醇洗涤，旋转离心5min，弃上清液，重复一次，最后用吹风机将残留的乙醇风干。

6. 测定DNA浓度用TE缓冲液稀释后测定DNA的浓度和纯度，可以用紫外线光度计进行测定。

测定的结果应该控制在1.8-2.0左右。

总之，CTAB法是一种有效、简单的DNA提取方法，与其他方法相比具有简便易行、节省时间和成本的优势。

棉花线粒体基因组细菌人工染色体文库的构建

摘要：以Ｐ０细胞质雄性不育系黄化苗为材料，用蔗糖密度差速离心和不连续蔗糖密度梯度超速离心提３Ａ采取棉花线粒体，熔点琼脂糖包埋和原位消化裂解的方法制备高分子量的线粒体Ｄ低ＮＡ（ＤｍｔＮＡ）经ＢｍＨＩ，，ａＨｉ引Ⅱ酶切和ＰＲ扩增进行纯度鉴定，对其进行部分酶切，切片段与载体连接，Ｃ并酶电击转人大肠杆菌ＤＨ１Ｂ０

棉花线粒志刚罗淑萍一，，，张锐程海刚，郭三堆，
（．国农业科学院生物技术研究所，京１０８；．疆农业大学农学院，鲁木齐１中北００１２新乌８０５）３０２
中，功的构建了棉花线粒体基Ｎ－ＡＣ文库。该文库共挑取３８０个单克隆，均插入片段大小为１．ｂ覆成ｌｉＢｌ４平５５ｋ，盖率超过７Ｏ倍，究结果表明该基因文库具有较高的质量。研关键词：棉花；胞质雄性不育；粒体基因组（Ｄ细线ｍｔＮＡ）；细菌人工染色体；文库中图分类号：Ｑ８７５文献标识码：Ａ
ｊｎｒｕｔｒｌｎｖｒｉｙ，ｕｉ８０５）ｉｇＡｇｉｌｕａｉｅｓｔＵｒｍｑ，３０２ａｃＵ
ＡｂｔａｔＡｒｅｕｒＯｉｏｌｔｔｓｒｃ：ｐｏｃｄｅｔｓａｅｍＤＮＡｒｍｏｔｏｎｓｅｉｇｓｈａｅｎｄｖｌｐｄ．ＴｈｒｏｃｌａｌｗｓｆｏｃｔｅｄｌｎｓｂｅｅｅｏｅｅｐｏｔｏｌｏｃｔｏｎｍｉｏｈｏｒｏｆｈｉｕｒｔｎｉｌＯｂｅｉｏａｅｙｕｉｇｄｉｆｒｎｔａｅｔｉｕｇｔｏｄｉｃｔｎｏｔｔｃｎｄｉｎｏｇｈｐｉｙａｄｙｅｄｔｓｌｔｄｂｓｎｆｅｅｉｌｃｎｒｆａｉｎ，ｓｏｎｉｕ— ＯｕｕｒｅｇａｉｎｔｃｎｒｆｇｔｏｏｕｃｏｅｄｅｉｙＨｉｈｍｏｌｃｌｒｓｓｃｏｓｒｄｅｅｔｉｕａｉｎｆｓｒｓｎｓｔ．ｇｅｕａｗｅｇｔＮＡｗａｅｒｄｂｙｉｈｔｍＤｓｐｒｐａｅｅｂｄｎｏｍｅｔｐｎｇｏｓｎｎｓｕｄｉｓｉｇａｎｙｉ．ＴｈｎｔｅｍｔＮＡｆｃｔａｍｉａｅｓｅｍｅｄｉｇｌｗｌｏｉｔａｒｅａｄｉｔｇｅｔｎｄｌｓｓｅｈＤｏｙｏｐｌｓｃｍｌｔ —

大规模转基因彩色棉花后代筛选方法研究

基Hale Waihona Puke ，ｊ通过外源目的基因表达，进行生物测定而
的筛选方法各不相同，过程复杂，选缓慢。特别筛是近年，随着大规模转基因研究的相继开展，传统的筛选方法已无法满足大规模转基因后代的高效
筛选，尤其是在转基因杂交育种中，需要在开花前
酸转移酶基因）该基因是目前基因工程中被广泛，使用的选择标记，对植物细胞表现毒性的机理它是：卡那霉素干扰了细胞叶绿体及线粒体的蛋白质合成，终导致植物细胞死亡，最而转基因植株抑制
后代群体的筛选显得尤为重要。
本试验结合我国棉花转基因育种中的两个主流方法＿］以花粉管导人ｌ外源基因自交系Ｔ一４，６Ｔ３转基因杂交育种Ｆ种子为材料，、探讨田间卡那霉素筛选与ＰＲ分子鉴定相结合，对大规模转Ｃ应
１２方法．
１２２卡那霉素抗性植襟筛选。在卡那霉素浓度．．梯度试验的基础上，对转基因供试材料进行卡那霉
素筛选，筛选后的阳性植株做标记，对以备ＰＲ分Ｃ
子检测。
１２１卡那霉素浓度梯度试验。设置卡那霉素３０．．．
那霉素棉叶涂抹，３在～５ｄ内，片仍未变化。该叶

植物提取dna的方法有哪些方法有哪些

植物提取dna的方法有哪些方法有哪些
植物提取DNA的方法有如下几种常见的方法：
1. CTAB法（Cetyltrimethylammonium bromide法）：这是一种常见的DNA 提取方法，利用CTAB和其他化学试剂来分离DNA。

2. 酚/氯仿提取法：通过酚和氯仿来提取DNA，可以有效地分离植物细胞中的DNA。

3. 细胞壁酶法：使用细胞壁酶来降解细胞壁，然后通过物理方法和化学方法提取DNA。

4. 硅胶柱法（Silica column法）：使用硅胶柱来吸附DNA，然后通过洗涤和洗脱的处理，得到纯净的DNA。

5. 盐法：通过高盐浓度和乙醇等试剂来沉淀DNA，然后经过洗涤和离心分离。

6. 磁珠法：使用具有磁性的珠子来吸附和纯化DNA，具有操作简便和高纯化度的优点。

除了以上提到的方法，还有一些其他的DNA提取方法，如酶解法、离心分离法等。

每种方法都有其特定的优缺点，适用于不同的样本和实验需求。

对于特定的
植物种类和实验目的，可根据需要选择最合适的DNA提取方法。

线粒体DNA提取方法的比较

・论　著・　线粒体DNA 提取方法的比较3李伟文　陆松敏　刘建仓　武　凡　李　萍　柏干荣第三军医大学野战外科研究所(重庆,400042) 摘要　目的将提取线粒体DNA 的碱变性法、T riton 法、改进高盐沉淀法加以比较,以得到最方便快速提取线粒体DNA 的方法。

方法分离W istar 大鼠小肠上皮细胞,用3种方法提取线粒体DNA ,紫外分光光度法定量。

用琼脂糖凝胶电泳和线粒体A T Pase 8亚基基因PCR 扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA 。

结果改进高盐沉淀法线粒体DNA 量最多,T riton 法最少。

OD 260 OD 280均在1.78～1.85间。

将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA 用于PCR 扩增,测定出了线粒体DNA A T Pase 8亚基基因序列。

结论改进高盐沉淀法提取线粒体DNA 具有操作简单,产量多的优点,该法所提取m tDNA 可用于m tDNA 测序。

关键词　线粒体;DNA ;分子遗传学3国家“九七三”项目资金资助(G 1999054202) 1981年,A nderson 用氯化铯密度梯度分离得到线粒体DNA (m tDNA ),进行了全序列分析。

此后,m tDNA 的研究日益得到重视。

本实验将T riton 法、碱变性法与改进高盐沉淀法进行了比较,发现后者具有简便、经济、易重复等优点。

1　材料和方法111　试剂和溶液琼脂糖系P rom ega 产品,其它生化试剂系国产分析纯。

①溶液 :含T ris 2HC l 10mm o l L ,N aC l 10mm o l L ,M gC l 25mm o l L pH 7.5;②溶液 :T ris 2HC l 10mm o l L ,N aC l 400mm o l L ,ED TA 2mm o l L pH 8.0;③溶液A :含50mm o l L 葡萄糖,25mm o l L T ris 2HC l 30mm o l L ED TA N a 2,pH 8.0;④溶液B :0.2m o l L N aOH 含1%SD S (临用前用5m o l L N aOH 和10%SD S 贮存液配制);⑤溶液C :3m o l L 醋酸钾溶液,pH 5.4,含5m o l L 醋酸根离子;⑥T riton 溶解液:含10mm o l L KC l ,15mm o l L T ris 2HC l ,pH 8.3,　2.5mm o l L M gC l 2,1%V V T riton X 2100;⑦ΚDNA B am H M arker 16841、7233、6770、6527、5256 5505bp ;⑧BD 2000M arker 3000,2000,1000,750,500,200bp 。

真核细胞中提取线粒体DNA

文献名称：线粒体DNA及其提取方法；宋凯陈文武吴江涛真核细胞中的线粒体基因组DNA提取一：基本原理线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。

线粒体基因组不仅是研究DNA结构与复制转录的良好模型，也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。

线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。

由于线粒体基因在真核生物具有高保守性，对其遗传相对独立的自主性及生物发生的研究成为当前细胞生物学中非常活跃的领域，所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记，并为线粒体起源提供有价值的线索。

线粒体DNA(mtDNA)已被广泛应用于发病机理临床诊断遗传变异生物进化等多方面的研究，并取得许多有价值的结果。

mtDNA在细胞内能够独立地进行复制和转录，动物体每个细胞中mtDNA有1000-10000个拷贝，容易从组织中分离提纯。

本实验将介绍高岩沉淀法来提取线粒体DNA。

高盐沉淀法通过SDS (十二烷基磺酸钠) 破坏细胞膜核膜，使蛋白质变性，从而游离出来核酸。

EDTA能抑制细胞中DNA酶的活性，蛋白酶K进一步将蛋白质降解成小肽。

加入饱和乙酸钠后，绝大部分线性大分子量DNA和蛋白质在SDS作用下变性形成沉淀，而环状mtDNA仍为自然状态，通过高速离心，除去绝大部分细胞碎片染色体DNA及蛋白质，mtDNA仍在上清中。

高盐沉淀法操作简单，易重复，可依需用量扩大反应体系，使mtDNA质量得以轻松控制。

二：试剂与器材1.试剂(1)溶液I：含Tris-HC1 10mmol／L，NaC1 10 mmol／L，MgC12 5 mmol／L，pH7.5(2)溶液Ⅱ：含Tris-HC1 10 mmol／L，NaC1 400 mmol／L，EDTA 2 mmol／L，pH8.0(3)RTE溶液：含10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA-Na2，20g/ml，无DNA酶的RNA 酶A，pH8.0(4)四季青细胞培养液(5)蛋白酶K(6)10%SDS溶液(7)饱和醋酸钠溶液(8)酚：氯仿：异醇(25：24：1)溶液(9)冰乙醇；70%冰乙醇(10)异丙醇(11)1*胰蛋白酶(12)PBS溶液2.器材培养皿；1ml移液枪；低温高速离心机；10ml离心管；血球计数板；恒温水浴锅；5ml、1.5mlEppendrof管；冰盒；剪刀；镊子。

线粒体提取

2,6—D（还原态）无色
.
样品
2
管号
1
2
操作
混合液（ml）
3.4
3.4
步骤
琥珀酸钠（ml） 0.8
0.8
延胡索酸（ml） —
—
CK
3
4
3.4
3.4
— 37C恒温水浴3 min
酶液（溶胀液）（ml）
0.2
0.2
0.2
0.2
（立即记时）
每管反应15min
HCl(ml)
0.6
0.6
思考题： 1.通过线粒体制备实验，谈谈你对分离细胞器的体会 2.说出琥珀酸脱氢酶活性测定时，各种试剂的作用。关键步
骤有哪些？ 3.蛋白质含量测定有哪些方法，各有何有优缺点？
0-4℃（2—4 ℃）以减少自溶变化。这些变化是由于把正常区隔开来的酶和底物混合到一起的结果。
匀浆液用4层纱布过滤
残渣弃（部分未破碎的组分）
上清液 12000g 离心15min
上清液弃
加3ml悬浮液，悬浮线粒体
滤液 3000g 离心10min
沉淀弃
（细胞碎片、细胞核等）沉淀留（线粒体）
4.注意事项制备植物线粒体最大的困难是随着组织的破坏，常伴随有线粒体膨胀和由于内源脂肪酸、酚类、醌类物质所引起正常线粒体机能的抑制。所以制备时要求：（1）溶剂系统必须要维持一定的渗透压。一般使用的是甘露醇或蔗糖。（2）加螯合剂或巯基化合物去除酚类化合物的毒害。（3）加入牛血清抑制游离脂肪酸或其它脂类物质的毒害。（4）根据不同材料确定不同的缓冲系统。
介质中，常含有： ① 0.25-0.4mol/L蔗糖或甘露醇，使与细胞溶液成等渗的； ② 50mmol/L的pH7-8缓冲液（通常用tris),以中和酸性的

线粒体DNA提取

mtDNA提取流程(1)将待测组织充分切碎(碎片大小:脾脏组织≤10 mg、其他组织≤25 mg),取样品25 mg移入微型离心管。

(2)加入180 μL Buffer ATL、20 μL Proteinase K、缓慢充分混匀,置于56 ℃恒温水浴直到完全溶解(水浴期间间隔摇晃混合)。

在开始下一步前摇晃混合15 s。

(3)加入200μL Buffer AL,充分混合(血液样品需56℃恒温水浴10 min)。

(4)加入200 μL 无水乙醇,混合均匀。

(5)将混合溶液移至2mL收集管中的滤管里,6000 xg条件离心1 min,取出滤管,扔掉收集管。

(6)将滤管放入新的收集管中,加入500 μL Buffer AW1, 6000 xg条件离心1 min,取出滤管,扔掉收集管。

(7)将滤管放入新的收集管中,加入500 μL Buffer AW2, 20000 xg条件离心3 min,取出滤管,扔掉收集管。

(8)将滤管放入新的微型离心管(1.5-2 mL)。

(9)向滤管中心滴加200 μL(100 μL)Buffer AE洗涤DNA,室温放置1 min。

6000 xg条件离心1 min。

(10)重复一边上述步骤,增大DNA产率(重复一遍即可)。

理论25mg原料大概能提取10-20μg DNA.注:摇晃混合和拿起时一定要轻慢,防止DNA断裂。

琼脂糖电泳步骤1. 准备电泳槽:将有机玻璃的电泳凝胶床洗净晾干,插上样品梳。

2. 琼脂糖凝胶的制备:称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中(1%的琼脂糖含量),置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化(不要加热至沸腾),取出摇匀。

3. 灌胶:将冷却60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上(厚度不超过0.5cm)。

待琼脂糖胶凝固后,在电泳槽内加入电泳缓冲液,然后拔出梳子。

5. 加样:将DNA样品与加样缓冲液按5:1混匀后(取10μL DNA样液与2μL 电泳载样缓或5μL DNA样液与1μL 电泳载样缓冲液混匀,用移液枪将混合液加到样品槽中,每槽加10-20μL,记录样品的点样次序和加样量。