大规模动物细胞培养技术
动物细胞大规模培养 ppt
目前, 大规模动物细胞培养中已经普遍使用 无血清培养基, 在此之前使用过天然培养基、 合成培养基。无血清培养基避免了血清培养基 污染的可能性, 并减少了纯化的难度。 但无血 清培养基没有广泛的适应性, 不同的细胞甚至 不同的细胞株和细胞系有各自独立的无血型培 养基配方。采用无血清培养而诱发细胞凋亡也 成为动物细胞无血清培养技术中急待解决的问 题。在培养基中加入某些化合物, 如金精三羧 酸(ATA )、锌离子、抗氧化剂和细胞因子等, 在一定程度上可阻止因采用无血清培养基而导 致的细胞凋亡。
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贴壁培养细 胞转瓶机
2、贴壁培养的优点：
●容易更换培养液：细胞紧密黏附于固相表面， 可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。 ●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的
目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。
●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效 的表达一种产品。
●同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。
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三.生物反应器分类
按其培养细胞的方式不同，可分三类：
1.悬浮培养用反应器：如搅拌反应器、中 空纤维反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、 气升式反应器； 2.贴壁培养用反应器：如搅拌反应器（微 载体培养）、玻璃珠床反应器、中空纤维反 应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器； 3.包埋培养用反应器：如流化床反应器、 固化床反应器。
2、共价贴附法: 利用共价键将动物细胞与固相载体结合的 固定化方法称为共价贴附法（attachment by covalent bonding）。此法可减少细胞的泄漏， 但须引入化学试剂，对细胞活性有影响，且因 贴附而导致扩散限制小，细胞得不到保护。
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动物细胞大规模培养技术
•动物细胞大规模培养技术
(三) 培养基与细胞系
• 动物细胞培养基是细胞赖以生长、增殖的重 要因素。天然培养基、合成培养基后，无血清 培养基开发成为当今细胞领域的一大课题。
• 无血清培养基的优势在于避免血清的批次、质 量、成分等对细胞造成的污染、毒性和不利于 产品纯化等不良影响。
•
•动物细胞大规模培养技术
1悬浮培养技术
基本操作 (1)将动物培养材料分散成细胞悬浮液\ 过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适 宜培养液的培养系统中。传代时按比例 稀释即可继续培养。
•动物细胞大规模培养技术
•动物细胞大规模培养技术
• 对贴壁性•细2微胞载，最体初培采养用技在术培养液中加
人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的 贴壁面积。此方法构造简单，成本低， 重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的 增加。但产率低，劳动强度大，占空间 大。微载体系统培养贴壁细胞，一定程 度上改变了以上这些不足。微载体是直 径60—250um的微珠。
•动物细胞大规模培养技术
• 采用胶原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可获 得更完整的细胞膜和更高的细胞活性。 胶原酶专一性好，不损伤细胞膜，效果 较好。
•动物细胞大规模培养技术
(6)分离细胞：
• 对于回收率要求不高的细胞种类，分组 沉降简单易行。
• 脱离微载体的培养液放入细长容器，于上清液 中分离收集细胞，400r／min，2min离心加速 微载体沉淀。
• 1.病毒疫苗 • 2.非抗体免疫调节剂 • 3.多肽生长因子 • 4.酶类 • 5.激素 • 6.肿瘤特异性抗原 • 7.单克隆抗体 • 8.病毒杀虫剂
•动物细胞大规模培养技术
细胞培养生物论文2000字_细胞培养生物毕业论文范文模板
细胞培养生物论文2000字_细胞培养生物毕业论文范文模板细胞培养生物论文2000字(一)：探析大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品的运用进展论文摘要：探析大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品的方法进行分析，主要包含空心纤维法、微囊法及微载体法，且结合大规模动物细胞培养技术的应用特点，提出大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品中应用的工艺选择方式，以期能够真正发挥大规模动物细胞培养技术的应用优势，为现代兽用生物制品的运用与发展奠定良好基础。
关键词：大规模动物细胞培养技术；兽用生物制品随着现代医学的快速发展，大规模动物细胞培养技术逐渐在医学研究、生物学研究中得到推广应用，在各类大规模生产中得到推广应用。
当前大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品制作方面应用的价值较高，但是由于受到传统工艺技术的影响，总体的应用效果还会受到较大影响。
动物细胞培养技术在兽用生物制品运用中的应用，能够提升培养的技术水平，优化细胞培养的环境，且有助于转变细胞培养的特性，对现代兽用生物制品产业技术的发展能够产生重要影响。
文章将结合当前兽用生物制品的研究现状进行分析，希望能够对相关研究活动带来一定借鉴价值。
1大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品中应用的方法动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养与悬浮培养的基础上，将早期流式细胞培养技术融入其中，充分发挥生物技术应用的价值。
纵观当前大规模动物细胞培养技术的应用现状，其技术具体包含空心纤维法、微囊法以及微载体法。
1.1空心纤维法空心纤维法最初所应用的纤维为醋酸纤维素与硝酸纤维素组合而成，作为具有透过性特点的滤膜，其外径约在1/3～3/4mm之间，表面存在诸多海绵孔结构，水分、气体以及营养物质等能够从此经过，且贴附其上进行生长。
培养期间培养系统主要是由3～6层空心纤维构成[1]。
大规模动物细胞培养期间，可以将其种在空心纤维外腔。
在培养一段时间之后，细胞能够达到一定的密度，细胞不会继续增长，但是能够持续进行分泌，保证其蛋白质与各类生物物质的需求。
第十二动物细胞的大规模培养技术
第十二动物细胞的大规模培养技术大规模培养哺乳类细胞是生产许多临床和医学上重要生物制品的一种有效的方法，这些生物制品包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单克隆抗体等，推动了生物学和医学的发展，给医学卫生事业带来了巨大的社会效益和经济效益。
基因工程技术、细胞工程技术，以及新的细胞大规模繁殖培养系统的发展，是构成上述成就的主要原因。
然而，体外大规模繁殖真核细胞要比原核细胞困难得多，如细菌、酵母菌和霉菌的细胞壁厚，能耐受搅拌，不易破碎，营养要求低，生长条件易于控制，增殖周期短，产品的产量也高，目前国外已用20万L发酵罐进行生产。
而真核细胞膜薄而娇嫩、易碎，对营养要求高，大多数细胞必须贴壁附着生长，更重要的是真核细胞具有原核细胞所没有的功能，能对其分泌产物进行修饰，例如二硫键的形成、糖甲酰化等，使产物具有完整的生物学功能，另外原核细胞经基因工程技术所合成的生物制品，不是分泌型的而是同细胞相结合的，需要破碎细胞，释出产物，再经浓缩、纯化；因后加工过程复杂，而使产品的得率受到损失。
利用真核细胞，可以不断合成和分泌，不断收获，后加工过程也相对简单，而且细胞往往可以重复利用。
因此，利用培养的动物细胞生产的生物制品，仍有很高的市场价值。
实验室常规培养动物细胞的方法是用人工合成培养液加上一定量的小牛血清，将细胞放在不同的容器中进行培养，如微孔板、培养皿以及各种培养瓶等。
一船培养容器的体积很小，最大培养体积为1—2L。
用这种方法培养的细胞所分泌的产物是有限的，无法满足实验研究和应用研究的需要。
利用小鼠腹水法繁殖杂交瘤细胞生产各种单克隆抗体；虽然能获得较高浓度的单克隆抗体，一般每只小鼠腹水单克隆抗体浓度在10mg／m1左右，但不易控制动物的批间差异和非特异的小鼠免疫球蛋白，以及潜在感染因子的污染。
单克隆抗体纯度差，分离纯化难度大，成本不低，又不宜用于人体内的诊断和治疗。
因此，不可能作为大规模生产单克隆抗体的主要方法。
应用细胞工程技术，建立大规模细胞培养系统生产各种生物活性物质，是一种比较经济可靠的技术。
第三章 细胞工程(三)
缺点：
存在扩散限制，颗粒太大时细胞生长不 良； ② 培养过程中忌钙沉淀剂或整合剂 ，如磷 酸盐、柠檬酸盐、EDTA等均会使凝胶溶 解。
①
3.抗凋亡技术
细胞凋亡，是指为维持内环境稳定，由 基因控制的细胞自主有序地死亡。 细胞死亡是维持细胞高活性和高密度的 最大障碍，死亡的细胞80%是凋亡所导致， 而不是坏死。因此抗凋亡技术的应用在 细胞大规模培养中显得极为重要。
3.灌流式操作
灌注式操作是指细胞接种后进行培养，一方面 新鲜培养基不断加入反应器。一方面又将反应 液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使 细胞处于一种不断的营养状态。 优点： ①细胞可处在较稳定的良好环境中，营养条件 较好，有害代谢浓度较低。 ②可极大地提高细胞密度，一般都可达107～ 108个/ml，从而极大地提高了产品产量。 ③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低 温下保存，有利于产品质量的提高。 ④培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提 高，生产成本明显降低。
中 试 生 物 反 应 器
动物细胞融合
细胞融合是正Байду номын сангаас的生命活动
受精作用
两个细胞正在融合
细胞融合又称细胞杂交。是指将二种或二 种以上的细胞或原生质体合并形成一个细 胞，不经过有性生殖过程而得到杂种细胞 的方法。
自然融合 自然情况下发生的融合 人工诱导融合 在体外用人工方法促使融合
细胞融合技术
用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图
聚乙二醇 （PEG） 法细胞融 合过程
电融合 诱导法 原理示 意图
动物细胞融合的过程
动物融合最成功的例子就是“杂交瘤”— —能够产生单克隆抗体的融合细胞。
试分析动物细胞规模化培养技术现状
试分析动物细胞规模化培养技术现状华宇新（兰州大学，甘肃 兰州 730000）摘 要：随着生物制药行业的不断发展与进步，增加了基于细胞培养的生物制品的需求量，使多种动物细胞规模化培养技术应运而生，并得到了广泛的应用，特别是悬浮培养技术，有效弥补了传统动物细胞规模化培养技术使用过程中的不足。
本文通过对动物细胞规模化培养技术的发展现状进行分析，了解不同动物细胞规模化培养技术的优缺点，加大改进力度，选择合适的规模化培养技术，能够显著缩短细胞生长的周期，提高细胞密度，提升细胞的产量和质量。
关键词：动物细胞规模化培养技术；悬浮培养技术；高密度培养最初培养动物细胞主要目的就是对细胞的代谢情况和生长状态进行研究，随后发现其有着巨大的应用机制，在科学技术不断发展的背景下，细胞培养技术逐渐成熟，并在生物学、医学、工业等多个领域中广泛应用，并取得优异的成绩，再加上随细胞培养技术的发展，疫苗、医疗药品等生物制品的需求日益增长，悬浮培养、固定化培养、规模化贴壁等多种技术不断盛行，并受到了科学研究机构和高新技术企业的关注和重视，极大地促进了生物制药行业的发展。
一、贴壁培养规模化贴壁培养技术的转瓶培养属于最经典的一种技术。
转瓶培养主要是将贴壁细胞放置在表面被全部被清理过的转瓶内，并在瓶内倒入适量的培养液，按照规定速度进行旋转，细胞在旋转的过程中就会与空气、培养液产生交替式的接触，这样就可以确保细胞能够正常生长与繁殖[1]。
1870年该技术被申请专利后，将圆形的培养瓶直接放在转轴上进行旋转，能够使细胞的贴壁面积逐渐增加，利于采用规模化的方式对细胞进行培养[2]。
之后很多研究学者都为了可以提升细胞增殖的速度，增加细胞的产量，通过利用增加转瓶内表面积的方式设计出多种类型的内部机构。
转瓶培养技术是最传统的一种细胞培养方式，内部布局非常简单，而且操作流程也非常便捷，所以相对于生产而言会有所降低，通过增加转瓶的次数就可以提高细胞培养量，且产品收获程序非常简易，提高了工作效率。
动物细胞大规模培养技术
大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。
20世界60-70年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。
近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。
随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。
所谓动物细胞大规模培养技术（large-scale culture technology）是指在人工条件下（设定ph、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。
目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube等贴壁细胞培养，发展为生物反应器（Bioreactor）进行大规模细胞培养。
第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。
随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。
采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。
因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。
自70年代以来，细胞培养用生物反应器有很大的发展，种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培养生物反应器有空气提升反应器，中空纤维管反应器，无泡搅拌反应器及篮式生物反应器等。
大规模培养细胞技术
[9]张立,严春,范卫民,等.Vero细胞的微载体培养——放大过程中的接种工艺[J].华东理工大学学报,1998,24:659~663
[10]Zhang L,Zhang Y,Yan C,et al.The culture of chicken embryo fibroblast cells on microcarriers to produce infectious bursal disease virus[J].App Biochem Biotechnol,1997,62:291~30
2.1.3
巨载体培养，是相对微载体和细胞而言的。在这种培养方式中，细胞虽然也像微载体一样贴附于固定的表面生长，但巨载体在生物反应器中是固定的，不因为搅拌而跟随培养液一起运动。
2.2悬浮培养
细胞悬浮培养是指在反应器中自有悬浮生长的过程。悬浮培养系统主要用于非贴壁依赖性细胞的培养。杂交瘤细胞的悬浮培养是研究得最广泛和透彻的动物细胞培养过程，培养规模最大，操作最成熟。近年来，随着无血清培养技术的发展，越来越多的贴壁依赖性细胞被驯化适合于无血清悬浮培养，例如重组CHO细胞和BHK细胞的大规模悬浮培养都获得了成功[11]。
大规模
摘要：细胞培养工作始于20世纪初，现已广泛应用于生物学、医学各个领域，成为细胞与组织研究的重要技术之一。近年来，随着基因工程和细胞工程技术的不断发展，动物细胞培养已成为大规模生产一系列有商品价值的生物制品的重要宿主，当前人们已经能够生产多种单克隆抗体、激素、细胞因子、病毒疫苗和具有特殊功能的效应细胞等。但是，实验室采用的细胞培养技术获得的细胞量有限，不能满足生产的需求，必修改用超产培养技术方法方可获得大量细胞，目前这种技术种类繁多，归纳起来有三大类：①贴壁培养法；②悬浮培养法；③固定化培养法。细胞体外培养技术的不断发展和完善，为组织和器官培养以及现代生物技术前沿的转基因动物技术、克隆技术、干细胞定向分化、体外受精、性别控制等一系列技术的发展奠定了基础。
动植物细胞大规模培养
动物细胞大规模培养技术-培养基组成
二、动物细胞培养基组成及制备
1、培养基组成
天然培养基
使用最早，营养成分高，也最为有效。 成分复杂，个体差异大，来源也缺乏，因而使用受到限制。 动物血清是细胞培养中用量最大的天然培养基
合成培养基
合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合 成的，具有一定的组成。 它给细胞提供了一个近似体内生存环境，又便于控制和标 准化的体外生存环境。 合成培养基的种类虽多，但一般都含有氨基酸、维生素、 碳水化合物、无机盐和一些其它辅助性成分。
营养成分 尽管植物细胞能在简单的合成培养基生长，但营养成
分对植物细胞培养和次生代谢产物的生成仍有很大的影响。营养 成分一方面要满足植物细胞的生生长所需，另一方面要使每个细 胞都能合成和积累次生代谢产物。普通的培养基主要是为了促进 细胞生长而设计的，它对次生代谢产物的产生并不一定最合适。
植物细胞大规模培养技术-培养因素
从培养方式来看，动物细胞无论是贴壁培养或是悬浮培养， 均可采用分批式、分批补料式、半连续式、连续式等多种培 养方式。从培养系统来看，主要采用中空纤维培养系统和微 载体系统，且以灌注式连续培养方式为佳。
动物细胞大规模培养技术-培养方法
三、动物细胞培养方法和环境要求
2、动物细胞培养的环境要求
影响动物细胞生长、繁殖的环境因素很多，主要有细胞生长 的支持物、气体交换、培养温度、pH、渗透压及其它因素等 方面。
一、植物细胞培养基组成及制备
植物细胞培养，不同培养阶段必需采用不同培养基。培养基 主要由碳源、有机氮源、无机盐、植物生长激素、有机酸和一些 复合物质组成。
碳源
蔗糖或葡萄糖是常用的碳源。通常增加培养基中蔗糖的含量，可 增加培养细胞的次生代谢产物量。
动物细胞大规模培养技术
一、前言动物细胞培养开始于本世纪初1962年，动物细胞培养规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，动物细胞培养已成为医药生物高技术产业的重要部分。
利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。
动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。
目前，动物细胞有悬浮培养和贴壁培养.技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上。
二、动物细胞的特点及生长特性动物细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：①动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；②倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素；③培养过程需氧量少(氧传质系数KLa 大于10 h-1即可满足每毫升107个细胞的生长)；④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；⑤原代培养细胞一般繁殖50 代即退化死亡；⑥代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。
三、动物细胞的固定化培养技术1、固定化培养方法在动物细胞培养中，培养细胞的目的不仅仅要求催化活细胞培养中，培养细胞的目的不仅仅要求催化活力，更重要的是利用细胞来合成和分泌蛋白，因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。
由于动物细胞的极度敏感性，上述这些固定化方法会对动物细胞产生毒性，另外多糖(如卡拉胶等) 由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害，故在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法，如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。
（1）吸附①多孔陶瓷美国某公司开发了一种完全自动化的细胞培养系统，该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。
反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体，可提供4. 25 m2 的生长表面积，既可用于培养悬浮生长的细胞，又可用于培养贴壁依赖性细胞。
动物细胞大规模培养方法分析
科技论坛动物细胞大规模培养方法分析吴旭国（哈尔滨三木制药厂，黑龙江五常150232）摘要：动物细胞大规模培养方法已经广泛应用于生产各种生物制品，也广泛应用于各种兽用疫苗的生产。
动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。
目前,动物细胞有悬浮培养和贴壁培养，技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量。
针对贴壁培养、悬浮培养和固定化培养等三种培养方法进行概述。
关键词：动物细胞；细胞培养；方法分析1细胞生长的基质依赖性1.1细胞对基质的依赖性根据细胞的生长特性和对基质的依赖性，可分为贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。
贴壁依赖性细胞的生长需要适量带电荷的固体或半固体支持表面，细胞自身分泌或人为在培养基中加入贴附因子，使细胞依附在支持物表面、才能生长和增殖，大多数动物细胞都属于此类，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞。
接触抑制性是当细胞长满整个培养表面后，就不再生长了，但仍然能存活一段时间。
非贴壁依赖性细胞的生长不依赖于固体支持物表面，可在培养液中悬浮生长，所以也被称为悬浮细胞。
血液、淋巴细胞、肿瘤细胞(包括杂交瘤细胞)和某些转化细胞属于此类。
有些细胞对固体支持物的依赖性不严格，可以贴壁生长，但在一定条件下，也可以悬浮生长。
1.2生长基质贴附细胞生长需要一个支持介质，培养器皿表面的材质不适合，因此人们采用在培养液中添加或在器皿表面覆盖生长基质，帮助细胞的贴附和生长。
把改变生长表面特性，促进细胞贴附的物质称为生长基质。
生长基质一般为胞外基质成分，主要介绍多聚赖氨酸、纤维连接蛋白、胶原、层黏蛋白、韧黏素等。
多聚赖氨酸是合成的赖氨酸多聚体，分子量为7-30ku的多聚赖氨酸可作为细胞生长基质。
纤维连接蛋白是细胞表面与血清浆中的大蛋白分子，具有维持细胞结构、促进贴附功能。
层黏蛋白为胞外基质中分子量900ku的非胶原性糖蛋白，影响细胞的贴附和运动，调节细胞生长和分化。
8讲第2节-动物细胞大规模培养技术
由于动物细胞生长的特殊性，如贴壁、脆弱等， 与微生物细胞培养不同，需要特别注意反应器结构 设计以及特物细胞培养的剪切力损伤？ 2.如何满足细胞贴壁要求又能充 分利用反应器空间体积？
1.动物细胞培养的生物反应器
机械搅拌式：浆叶改造
充气搅拌式：需要改造
一次性培养袋
在线分析技术
中空纤维生物反应器
中空纤维是一种细微的管状结 构，管壁为极薄的半透膜。 主体是由微孔中空纤维管束制成 的中空丝，纤维束由外壳包裹， 因此可分为中空内腔与中空外腔 两部分，每部分各有其进出口。 新鲜培养液从中空内腔导入。气 体在管体部分通过，其中一部分 则均匀地扩散至壳体内部。
3.良好的传质性能
4.强的机械性能：重复利用、保护细胞 5.好的热稳定性：高压灭菌
制备微载体的材料
1.人工合成聚合物 聚甲基丙烯酸-2 羟乙酯（PHEMA）、聚苯乙烯（PS）、聚丙烯酰 胺、聚氨酯泡沫、葡聚糖、低聚合度聚乙烯醇等。 2.天然聚合物及其衍生物 明胶、胶原、纤维素、甲壳质及其衍生物、海藻酸盐
一种微载体产品（Fibra-Cel）
人胚肾细胞HEK293
人上皮细胞—— SoloHill微载体上的生长
微载体对细胞生长具有显著的影响
问题：
微载体培养如何收获细胞？接 种细胞传代呢？
胰蛋白酶消化
球传球(bead to bead)技术
将贴满细胞的微载体与新鲜微载体混合，实现细 胞因随机碰撞而实现转移贴附在新载体表面的技 术。
转化细胞一般具有永生性，但是永生性不一定成瘤。 一般转化细胞并不致瘤。 致瘤性评价：接种到动物体内，发展形成肿瘤结 节，为生瘤阳性。 随着对肿瘤发生机制等研究的深入，转化细胞于20 世纪80年代获得批准用于生产。
大规模动物细胞培养问题及对策
细胞工程第十章动物细胞大规模培养技术
02
动物细胞大规模培养技术的基本原理
动物细胞的基本特性
动物细胞具有特定的形态和功能，如上皮细胞、肌 肉细胞、神经细胞等。
动物细胞具有高度的代谢活性，能够合成蛋白质、 酶等生物大分子。
动物细胞具有膜结构，能够进行物质交换和信号转 导。
动物细胞生长与增殖的机制
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03
动物细胞通过分裂进行增殖，分裂过程中需要进行 DNA复制和细胞分裂。
定义与特点
定义
动物细胞大规模培养技术是指通过一定的生物反应器系统，在一 定的培养条件下，大规模培养动物细胞以获取所需的细胞、组织 或生物制品的技术。
特点
动物细胞大规模培养技术具有高效、可重复性高、可工业化生产 等优点，广泛应用于生物医药、生物制品、生物材料等领域。
动物细胞大规模培养技术的应用领域
监控与检测
建立完善的监控和检测体系，定期对培养物进行 微生物、支原体和内毒素检测，确保产品质量。
3
安全性评估
对大规模培养的动物细胞进行安全性评估，包括 细胞形态、染色体数目、病毒污染等方面，确保 产品安全可靠。
提高培养效率与产物质量的策略与方法
选择适宜的细胞株
选择增殖能力强、产物表达量高的细胞株，提高培养效率和产物 质量。
动物细胞的生长与增殖受到多种因素的影响，如营养 物质、激素、生长因子等。
动物细胞的生长与增殖过程受到细胞周期的调控，细 胞周期包括分裂间期和分裂期。
动物细胞培养的环境因素
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04
温度
维持适宜的温度是动物细胞培 养的基本条件，不同种类的动 物细胞对温度的需求不同。
气体环境
动物细胞培养需要适宜的气体 环境，如95%空气（细胞代谢 必需的）和5%的${CO}_{2} ($ 维持培养基的酸碱度)。
动物细胞大规模培养技术
青 睐。 到各 大、 中城市建立绿色产品专卖店 、 连锁店 、 加盟店 ，
到各 大 超 市 开 设食 品 专 柜 、 销 区等 ， 产 品运 输 、 藏 中 实 专 在 储 行绿 色 冷 链 管 理 ， 保 产 品 的 绿 色 营 养 品 质 ， 进 产 品 的 营 确 促
６ 延伸产业链 。 ． ２ 推行产业化 随着人们生活水平的逐步提高 ， 绿色食品的市场竞争愈
原本 为圆形的细胞一经 贴壁就迅速铺展 ，然后开始有丝分
裂 ， 很 快进 入 对 数 生 长期 。 般 数天 后 就 铺 满 培养 表 面 ， 并 一 并
新 。我国是疫苗产品 的最大使用国和最大生产 国， 但关键生 产工艺以及部分疫苗质量与 国际发达 国家存在较大差距 。 国 内大部分疫苗生产企业仍采用的转瓶 培养 动物细胞 ， 每个转
（ ） 细胞 繁 殖贴 壁后 不 易 消化 下 来 ， 的扩 大 比较 困难 ； １ 培养
进一步扩大 、 优化细胞培养环境 、 高产 品的产 出率与保证 提
其质量 ， 动物细胞大规模 培养技术 已成为各生产企业 发展 至
关 重 要 的环 节 。
近几年来 ，随着科学技术的发展和人们认识 的提高 ， 为
演愈烈 ， 所以不断完善质量管理体系 ， 研发绿色产品 ， 全力 打
销， 扩大产品在国内外市场 的知名度和 占有率。实施绿 色营 销奠定 良好的基础 。进一步提高企业 知名度增强品牌效应 、
专 论 与 综 述
动物细胞大 规模 培 养技术
朱庆 虎 秦 红 丽 陈 弘 ４刘 兰刚 ２ 二 勇 。 ， ， ， ， 康
（． １哈尔滨 兽 医研 究所 ， 哈尔滨 １ ０ ０ ；． ５ ０ １ ２武川县 农村 改水 办公室 。武 川 ３天津 市天农 大生物技 术发展 有 限公司 ，天津 ． ３００ ； ０ ４ ２ ０ １０ ； １ ７ ０
大规模细胞培养技术的操作方式
大规模细胞培养技术的操作方式规模细胞培养的操作方式可分为：分批式、流加式、半连续式、连续式和灌注式五种。
一、分批式培养（batch culture）分批式培养（batch culture）是细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。
该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。
该方式的特点:操作简单。
培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。
反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，容易掌握；直观反映细胞生长代谢的过程。
因培养期间细胞生长代谢是在一个相对固定的营养环境，不添加任何营养成分,因此可直观的反映细胞生长代谢的过程,是动物细胞工艺基础条件或"小试"研究常用的手段；可直接放大。
由于培养过程工艺简单，对设备和控制的要求较低，设备的通用性强，反应器参数的放大原理和过程控制，比较其它培养系统较易理解和掌握，在工业化生产中分批式培养操作是传统的、常用的方法，其工业反应器(Genetech)规模可达12000L。
分批培养过程中，细胞的生长分为五个阶段：延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期。
分批培养的周期时间多在3-5天，细胞生长动力学表现为细胞先经历对数生长期（48-72h）细胞密度达到最高值后，由于营养物质耗劫或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡，表现出典型的生长周期。
收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行。
二、流加式培养（feeding culture）1.流加式培养是在批式培养的基础上，采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以悬浮微载体培养贴壁细胞，细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较高的密度，目标产品达到较高的水平，整个培养过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。
动物细胞大规模培养
绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、 促间质细胞激素、促黄体激素等
补充内容（一）
单克隆抗体
哺乳动物细胞中有一套复杂的防御系统保护自己不受有毒物质和病原物的侵
害，其中一部分防御反应就是淋巴细胞经诱导产生特异的蛋白，这些蛋白可以在其 他免疫系统蛋白的帮助下与外来物质结合，并抵消其生物学功能。这些特异的蛋白， 就是抗体；相对于抗体，诱发产生抗体的外来物质即称为抗原。
于是，人们认识到要把抗体应用于临床诊断或是治疗，必须要制备单一类型的 只对某一特定抗原决定簇的抗体分子，也就是单克隆抗体。
多克隆抗体
在一个血清样品中包含了对同一抗原分子上不同抗原决定簇的多种抗体。
单克隆抗体
由杂交瘤细胞系产生的针对某一特定抗原决定簇的单一类型的抗体。
补充内容（二）
动物细胞培养步骤
合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体内生存环境中各种 已知物质在体外人工条件的模拟，经过反复实验筛选、强化和重新组合后形成的培 养基。这种培养基在很多方面有天然培养基所无法比拟的优点，它既能经细胞提供 一个近似于体内的生存环境，又便于控制和提供标准化体外生存环境。
问题
合成培养基中一般都有哪些营养成分？
对于一个免疫刺激（有毒物质或病原物侵入，即抗原），每一个淋巴细胞都 会合成并分泌一种单个的抗体，这些抗体可以高度特异地识别免疫抗原的特定区域， 也就是抗原决定簇。由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫 淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的 不同的抗体统称为多克隆抗体。
织和许多单倍体等贴壁依赖性细胞的培养。由于大多数动物细胞属于贴壁依赖
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PO2控制单元工作原理
关联计算
设定值 DO
空气阀 被控
DO
PI控制
O2阀
N2阀
对象
检测
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pH控制系统
• 级联控制：数字化集成控制
相关参数 CO2 Na2HCO3 控制器 Gas Mix Station Alkali Pump
•
• • •
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细胞生长和单抗生产的动力学 和 提高单抗比生成速率的研究
• • • 多数研究认为，杂交瘤细胞培养中，单抗的生产是负生长偶联型的，即在较 慢的生长速率下，细胞的单抗比生长速率较高。 通过细胞同步化和流式细胞仪研究发现，在细胞生长周期中，在G1期或S早期 的细胞生产单抗最快。这样，使细胞缓慢生长，从而使更多的细胞处于Gl期， 是提高单抗产率的一种策略。 在减缓细胞生长的方法中，通常采用的有提高培养基的渗透压、DNA或RNA合 成的抑制 、非抗体蛋白合成的抑制等，都使得细胞的单抗比生成速率有不同 程度的提高，但这些方法常常同时抑制了细胞的生长速率，降低了最大细胞 密度，因而其使用受到限制。 使用细胞截留的连续培养中可以解决这个问题。 Ｇ１期：即ＤＮＡ合成前期；②Ｓ期：即ＤＮＡ合成期；③Ｇ２期：即ＤＮ Ａ合成后期；④Ｍ期：即有丝分裂期。
低剪切力搅拌浆
大搅拌桨页保证培 养基混合均匀的同 时,将剪切力降至 最低
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溶氧控制
• 级联控制：数字化集成控制 • 相关参数 Air O2 N2 Stir 控制器 AirFlow Controller Gas Mix Station Gas Mix Station Stir Speed Controller
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大规模动物细胞培养技术
Sartorius BBI Systems (B.Braun Biotech International GmbH) 德国赛多利斯BBI系统 （贝朗国际生物）
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无泡通气装臵
• 通气采用无气泡发生 装臵,保证细胞正常的氧 气消耗的同时,使细胞不 会受到剪切力的伤害 • 通气环管采用高通量 ,高强度的硅胶管 (专利 DE2940446)
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剪切力对动物细胞的作用及细胞保护
• 在生物反应器中，机械搅拌和气泡都会给杂交瘤细胞带来损伤， 降低细胞活性 • 最为严重的是，在培养基中运动的气泡常会吸附大量细胞于气液 界面，在其运动特别是聚并和破碎时，会严重破坏细胞，造成对 细胞活性的严重影响 • 通常血清对细胞有较好的保护作用，表面活性物质，如Pluronic F68，通过阻止细胞在气泡表面的吸附，从而达到保护细胞免受气 泡损伤的目的。其它的一些大分子聚合物也对细胞有一定的保护 作用。但Pluronic F68这类保护剂对某些细胞的生长有抑制作用 • 对反应器而言，解决的方案是：1、采用低剪切力的搅拌桨；2、 采用无泡通气系统或者在大反应器中采用微泡通气系统。
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反应器参数的优化
• 温度：最适合的细胞生长温度，产物表达最适合温度或者会有，需 要进行摸索。对反应器而言需要做到控制的温度精度高，还需要有 编程控制能力。 • 溶氧控制：细胞在对数生长期、产物表达期、连续培养还是分批培 养等不同情况下，对溶氧饱和度的要求不一样，需要进行摸索和优 化。对反应器而言，由于与溶氧相关的因素较多，如Air，O2，N2 所以一个好的反应器必须有很好的气体混合控制功能，还需要保证 溶氧控制的温度和编程控制能力。 • 杂交瘤细胞对pH非常敏感。通常的pH控制范围为7.0—7.2，但实际 上pH偏低一些比偏高一些对细胞的影响要小。对反应器而言，需要 配臵很好的pH控制系统，如CO2和Na2HCO3的级联控制，需要保证pH 的精度。
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PH控制单元工作原理
关联计算
设定值
碱泵
pH
被控
PI控制
CO2阀
pH
对象
检测
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温ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ控制
自动控制阀（冷却水） 自动控制阀（蒸汽）
温度电极
循环泵
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重要提示
• 灌注系统螺旋过滤器孔径的选择：孔径过大，大量的 细胞会被抽出；孔径过小，截留下来死细胞过多，留 下代谢废物太多。 • 最好选择：根据显微技术分析细胞大小，选择合适的 孔径，保证死细胞大部分被抽出，而高活力细胞保留 在罐内。 • 目的：保证罐内一直都是高活力的细胞，整个生产周 期可以延长很长时间，生产效率和产量将会明显提高。
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营养成份－其他需要注意的要点
• 提高培养细胞的接种密度； • 选择合适的抗流体剪切保护剂，在含血清培养时选用的保护剂未 必在无血清培养时适用； • 选择合适的生物反应器，使剪切作用更小，控制精度更高； • 添加更丰富的氨基酸和维生素； • 定期检查杂交瘤细胞的遗传特性，特别是分泌单抗能力的变化， 必要时进行重新克隆或用新的种子； • 建立液氮冻存细胞的方法和程序； • 细胞培养用的容器要更加洁净，水和化学品的纯度要更高； • 培养基的储存期要短，储存时应避免反复冷冻或pH的大幅度波动。
细菌与细胞的结构 The Cell
Cellwall Ribosome Cytoplasm Genome Plasma membrane Ribosome Cytoplasm Mitochondrion Golgi apparatus Endoplasmic Reticulum Nucleus
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营养成份
• • • • • • • • • • • 杂交瘤细胞培养时使用的血清中的各种蛋白是单抗纯化的主要障碍 杂交瘤细胞的无血清培养基通常是在标准的基础培养基中添加小分子和大分子物质，以代 替血清的各种功能。最常用的基础培养基有RPMI 1640，F12，IMDM，DMEMF12， DMEMF12RPMI 1640 无血清培养基用于杂交瘤细胞培养有它的固有优点，也有它的不可避免的缺点，如需要对 每个细胞系优化配方， 添加成本很高的激素和生长因子，导致长的迟滞期，降低细胞生 长速率、最大细胞密度和细胞活性等 逐渐形成了以胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、亚硒酸钠为基础添加剂的各种无血清培养基配 方，进而通过合理解决铁离子的传递问题，开发出了无蛋白培养基 胰岛素是杂交瘤细胞的重要生长因子，能够刺激葡萄糖的利用及RNA、蛋白和磷脂的合成 转铁蛋白是一种结合铁的糖蛋白，在无血清培养基中是一种重要的生长刺激蛋白 乙醇胺是一种重要的刺激细胞生长的化合物，与细胞内的磷脂合成有关 亚硒酸钠中的硒作为一种微量元素，是一种谷胱甘肽过氧化物酶的辅因子，拥有抗过氧化 物的能力，因而可提高杂交瘤细胞在无血清培养基中的生长速率及活性 多数细胞系需要脂类维持在无血清培养基中生存，常见的添加脂类为胆固醇、低密度脂蛋 白、大豆磷脂和亚油酸或油酸 所需微量元素：铁、硒、铜、铝、锰、钒、锌等；无蛋白条件下长期培养往往还需要添加 铷、锆、铬、镉、钴、镍、硅、锡、锗等 无血清培养基中常见的其他添加物质包括：-巯基乙醇、氢化可的松、维生素C、生长因 子和抗氧化剂等
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四通道气体混合仪
• 由发酵罐控制单元控制 • 通过控制氧气，空气，氮气 的通气量来调节培养液中PO2 的 值 • 通过控制CO2的通气量和补 料泵补充Na2HCO3来调节培养液 中的PH值 • 控制模式：并联式、排他式
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外臵旋转灌注系统
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灌注系统－螺旋过滤器
过滤器安装于搅拌轴上
• 多种孔径可供选择,配合灌注流工 艺的需要 悬浮细胞 ( 10um,20 um ), 聚合细胞 ( 40 um ), 微载体 ( 70 um ) • 可从实验室到生产规模线性放大 • 316L材质,可在位灭菌 专利技术 • 可选择过滤器孔径
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反应器的控制系统
• • • • 控制系统主板，电源板，信号放大器 补料泵 操作和显示面板 响应元件：自动控制阀，补料泵，气体混合仪
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B.Braun灌注培养系统
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无菌取样
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