溶菌酶高产菌株的筛选

产酶菌株的分离
采用双层平板法
以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用混菌方法制 下层： 又叫双层琼脂平板法 成下层培养基 先在培养皿中倒入底层固体培 养基，凝固后再倒入含有宿主细菌 上层： 和一定稀释度噬菌体的半固体培养 1mL土 将土壤样品充分研磨，梯度稀释后，取 壤悬液加入已经凝固的下层培养基上，再倒入 基。培养一段时间后，计算噬菌斑 50℃营养琼脂培养基，混匀，制成上层培养基 的数量。
主要培养基
(l)指示菌培养基:蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%， pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。 (2)初筛培养基及菌株的保存培养基: 蛋白胨1%，牛肉 膏0.5%，NaCl 1%，琼脂 1.5%-2%。 pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。 (3)基础培养基: 蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 1%。 pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。 (4)摇瓶发酵产酶培养基:可溶性淀粉 1.25%，牛肉 膏2.5%，玉米浆1%，Tween 0.1%， pH值调至7.0，121℃灭菌 20min。
①内．Ｎ．乙酰已糖胺酶 ②酰胺酶 ③内肽酶（Peptidasc）和蛋白酶 ④β-1，3.β-1，6葡聚糖酶和甘露糖酶（葡甘 露糖酶） ⑤磷酸甘露糖酶 ⑥壳多糖酶 ⑦脱乙酰壳多糖酶
2、溶菌酶菌株的筛选
由于溶菌酶微生物的分布广泛性，所 以本课题从土壤微生物入手，从中筛选分 离出溶菌酶高产菌株，并进行培养保存 其中的土壤样品是来自17个省市地区 的各种植被类型土壤样品156份
28℃培养，每天观察并记录
用灭菌牙签挑取在初 筛双层平板上产生透明 圈的菌落，进行划线分 离 挑取单一菌落，点接 到含金黄色葡萄球菌的 验证板上，37℃培养 2d。观察其是否再次产 生透明圈，以及产圈稳 定性。 将经过验证仍产透明圈 的菌株进行纯化并保存。
高抑菌活性菌株的初步筛选
将分离得到的具有抑菌活性的菌株 进行摇瓶发酵，利用营养肉汤培养基， 300mL三角瓶装瓶量 50mL，接种量 2%，37℃， 200rpm摇振培养。每8h 取发酵液，在含金黄色葡萄球菌的营养 琼脂平板上用直径6mm无菌中空管打 孔，注入50uL发酵液。37℃温育24h。 观察结果并用游标卡尺测量透明圈直径。 筛选抑菌圈较大的菌株。
溶菌酶高产菌株
筛选及其产酶研究
1、溶菌酶的分布
目前已知溶菌酶在自然界中分 布极为广泛， 已经发现高等动 植物组织及分泌 物、原生动物、 昆虫和各种微生 物中都有溶菌酶 存在
如鸡卵清中含有相当 动物溶菌酶 量的溶菌酶（约3.4％ 至3.5％），此外，人 体、蜜蜂、蚜虫等均 人们从上世纪６０年代发现微生物 发现有溶菌酶
也产生溶菌酶，并且进展很快。溶菌 植物中的溶菌酶通 植物溶菌酶 溶菌酶 酶可以用溶菌谱来作 为酶专一性的主 常比动物来源的溶 菌酶具有较大的分 要指标，但由于这类酶的作用机制十 子量 分复杂，所以这种分类并不能反映酶 微生物溶菌酶 的作用 本质，现在以酶的作用性质来 进行分类。
一般把微生物产生的溶菌酶分为７类
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溶菌酶高产菌株的复筛
对初步鉴定抑菌活性成分是蛋白 质的高活力菌株进行摇瓶发酵试 验，测定溶菌酶活力，根据产酶 活力，结合菌株特性，综合确定 筛选菌株。
抑菌活性成分的初步鉴定
将筛选到的具有较强抑菌活性菌株进行摇瓶发酵， 取36h发酵液 12000rpm、 20min离心。 取上清液进行蛋白酶K处理，20uL蛋白酶 K(20mg/mL)加入500ul上清液中，50℃反应1 h， 各取50匹在含有金黄色葡萄球菌的营养琼脂板上 打孔点样，37℃培养24h观察透明圈。 将发酵液离心取上清进行透析浓缩，发酵液 10mL加入透析袋(透过规格8一 14.0KD)中，扎 紧，置于聚乙二醇20000中，4℃透析过夜。测 定透析前后酶活力。