安捷伦1100培训手册
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160 180 200 220
200
Wavelength (nm)
250
60
80
100
Mass/Charge
No.33
紫外－可见检测器
根据Beer定律，通过检测池透射光的强度与溶质浓度成正比。
Detector Cell Io C b I
Log
I0 = 入射光强度 I = 透射光强度 A = 吸光度
HC
3
CH2
CH 3
N Mg N
N
CH3
N CH 3
0 0 0 0 0
CH 3
CH
3
CH
3
CH
3
M.S. Tswett. Ber. Dtsch. Bot. Ges. 24: 384-393 (1906)
No.5
柱色谱
玻璃柱
重力 洗脱
硅胶 氧化铝 纤维素 糖类粉末
装载 样品
装载 溶剂
滤网
Volume (mL) Time (hr)
I. 样品体积 II. 连接管路的体积 III. 色谱柱进口设计 IV. 色谱柱出口设计 V. 检测池体积 ( < 10 µL )
VI.
降低输出回路响应时间
No.22
不同分离度比较
Poor efficiency Moderate selectivity R=1
Poor efficiency Good selectivity
No.31
Necessity for More than One Detector
Selectivity
Flecainide in Serum
UV signal FL signal
Therapeutic concentration: 1.8mg/l, 20ul injected UV and fluorescence signal
Normal-Phase
Silica, Amino, Cyano Diol
Organics
Ionics Inorganic Ions
Ion Exchange
Anion or Cation Exchange Resin Polystyrene Silica
Aqueous/Buffer Counter Ion
A B
2
3
1
2
1
2
t0=1
α
=
k' B k' A
=
1.64 1.58
=
1.04
α
=
1.15 0.85
= 1.35
α
=
0.95 0.63
=
1.50
改用不同的流动相 改变流动相的组成 改变流动相pH值 改变柱温 应用特殊的化学效应 改变固定相
改变分离选择性α的方法
No.13
温度对分离选择性α的影响
40 ℃
R = 1.5
Excellent efficiency Poor selectivity R = 0.5
Excellent efficiency Moderate selectivity
R=4
No.23
如何提高分离度
通过下述方法增加保留时间:
选择合适的分离参数 增加色谱柱长度 增加固定相浓度
通过下述方法降低谱带宽度:
第四天
下午：1 考试 2 发结业证 3 自由练习、讨论
No.3
第一章 色谱基础
本章内容：
•液相色谱发展史
•液相色谱的基本概念 •影响峰形扩展的因素
No.4
历史回顾
1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919)
碳酸钙吸附剂 石油醚 1940‘s - 分配色谱和纸色谱 1950‘s - 气相, 薄层，凝胶过滤色谱 梯度洗脱色谱 1960‘s - 商业高效液相色谱.
Piston Displacement (祃)
0
System Pressure>0
System Pressure=0
脉冲阻尼器
100
One Piston Cycle TIME
减少了单向阀用量 需要阻尼器 压缩因子补偿
w/o compensation with compensation
For internal use only 11
扩散
C = 传质阻力 在低流速下可以降低传质阻力 使用小颗粒载体可以降低传质阻力
H E T P
流动相
线速度
固定相
滞流的 流动相
No.20
扩散
范德姆特方程 The Van Deemter Equation
A = 涡流扩散 B = 自由分子扩散 C = 传质阻力
HETP
B u
A
线速度
No.21
柱外效应
High MW Compounds Polymers
Size Exclusion
Gel FiltrationAqueous Gel PermeationOrganic
No.8
色谱参数 －定性和定量
tR(B)
tR(A)
Detector Response
t0
Inject A B
W Time
A
W
B
t R = 保留时间 t 0 = 死时间
60℃
0
5 Time in Minutes
10
No.14
柱效
Detector Response Inject
低柱效
高柱效
Time
No.15
计算柱效
tR
Inject
W 1/2
W Time
B
N = 16
t R WB L N
2 = 5.54
t R W 1/2
2
HETP =
No.16
扩散
范德姆特方程 The Van Deemter Equation
No.28
手动进样器－六通阀
Load
Sample Syringe To Waste
Inject
To Waste
To Column Sample Loop (Fixed Volume) To Column From Pump
From Pump
No.29
检测器使用统计
43.0%
UV-VIS DAD Fluorescence Refractive Index 22.0% 4.0% Electrochemical 1.0% 5.0% 7.0% 10.0% 8.0% Conductivity Mass spec Others
195 190 195 205 210 200-210 310 202, 255 220, 275
-C=CC=O - COOR - CHO - COOH - NO
2
-
max
= wavelength of absorption maximum
No.35
Instrumentation - Absorbance Detectors
No.30
Necessity for More than One Detector
Sensitivity
UV-signal
WL 241/394
WL 270/388
WL 248/411
WL 302/420
WL 247/504
Fluorescence
Solv.: H2O/CH3OH= 10:90 PAH's extracted from soil; Col.: Sup.LC-PAH 150x4.6mm;
第二天
上午：1 化学工作站View菜单介绍 2 方法的编辑、修改、存贮及运行 3 Agilent 各部件采集参数设置 4 填写样品信息表、进样分析（实验二） 下午：1 数据处理参数设置 （谱图优化、积分优化） 2 练习 3 谱图处理、手动积分
No.2
第三天
上午：1 各种定量方法原理及其优缺点 2 建立多级外标校正曲线，用外标法定量 3 练习（实验三） 下午：1 建立多级内标校正曲线，用内标法定量 2 再校正、设定报告类型 3 练习（实验四） 4 高级功能简介（序列、DAD光谱功能……） 上午：1 系统日常维护和保养 2 工作站故障诊断功能的应用 3 Agilent 1100泵的维护 （拆泵头，更换泵头消耗品） 4 Agilent 1100检测器的维护（VWD、DAD易耗品的 更换，清洗流通池） 5 练习 结业午餐
Agilent 1100 化学工作站 操作培训
Agilent 1100 化学工作站培训日程安排
第一天 上午： 1 2 3 下午：1 欢迎，相互介绍 液相色谱基础 HPLC仪器工作原理 Agilent 1100 硬件的结构及特点 （真空脱气机、泵、自动进样器、检测器） 2 Windows操作系统简介 3 化学工作站的重新安装、配置及启动 4 练习（实验一）
Mobile Phase
Reversed-Phase
C-18, C-8, C-4, C-2
Water/Organic Modifiers
Ionics, Bases, Acids
Ion-Pair
C-18, C-8
Water/Organic Ion-Pair Reagent
Compounds Insoluble in Water, Organic Isomers
Variable Wavelength (UV/Visible)
Slits Light Source Detector Element
flow Cell Mechanical Grating Monochromator
No.36
Instrumentation - Absorbance Detectors
No.26
溶剂传输系统
减小流量脉冲－并联柱塞泵
P 单向阀 B A A B 柱塞A前进
Single Piston Delivery P
Combined Delivery
柱塞B后退
相消干扰 通常也需要阻尼器 增加了单向阀的使用数量
No.27
溶剂传输系统
消除流量脉冲－串联柱塞泵
单向阀
P
Agilent 1100 Series Pumps: Solvent Compressibility Compensation
溶剂洗脱强度强
2000 1600 mA U 1000 600 0 2 4 Time (min.) 6 8 10
80% Acetonitrile 20% Water
对于反相色谱，增加10％的有机组成等于降低每个色谱峰的K’值的1/2 到2/3。
No.12
分离选择性
(α)
α
= k' B
k' A
A
B
A B
选择性
x
k' 1 + k'
柱效
容量因子
No.11
容量因子
各组份的容量因子（K’）随溶剂洗脱强度的 变化增大或缩小
溶剂洗脱强度弱
1100 700 mA U 60% Acetonitrile 40% Water
300 100 2 4 Time (min.) 6 8 10
增加流动相的洗脱强度，降低了洗脱物的容量因子
W = 峰底宽度
R=2
K’=
tR(B) - tR(A)
WA + WB
= 1.176
tR(B) - tR(A)
W1/2A + W1/2B
tR-t0 t0
No.9
不同R值的峰重叠
0.4
0.5
0.6
0.7
பைடு நூலகம்
0.8
1.00
1.25
R=1.5可以得到基线分离
No.10
影响R值的因素
R=
Δt W
=
1/4
N
x
α- 1 α
A = 涡流扩散 B = 自由分子扩散 C = 传质阻力
HETP
B u
A
线速度
No.17
扩散
A = 涡流扩散——多径扩散
仔细填充柱子 使用均一的载体
初始 带宽
H E T P
A
线速度
最终 带宽
No.18
扩散
B = 自由分子扩散——纵向扩散
在液相中影响小 在低流速中影响大
H E T P
B
线速度
No.19
I0 I
= A = abc
a = 摩尔吸光系数 b = 检测池长度
c = 溶质浓度
No.34
发色团吸收波长
Chromophore
Amine Ethylene Ketone Ester Aldehyde Carboxyl Nitro Phenyl Naphthyl
Structure
- NH 2
max(nm)
使用均一的载体 仔细填充柱子 选择粒度小的载体 优化流速 减小进样量 降低系统死体积 降低输出回路响应时间
No.24
第二章 HPLC 仪器工作原理
本章内容：
•往复活塞泵的结构及工作原理 •手动进样器（六通阀）结构及工作原理 •常见检测器检测原理
No.25
溶剂传输系统
往复活塞泵(单向阀)
Gold Seal Sapphire Insert Ruby Ball Spring Insert
Photodiode Array (UV/Visible) Light Source Holographic Grating
150 4.0
100 3.0 2.0
50
1.0
10
No.6
高效液相色谱 (HPLC)
进样口 混合器 泵 色谱图 色谱柱
检测器
溶剂
No.7
液相色谱类型
Types of Compounds Separated Neutrals Weak Acids Weak Bases
Mode
Stationary Phase
No.32
需要多个检测器
Qualitative Information
Chlortoluron ? Atrazine ?
Take peak spectrum (UV)
Take peak spectrum (MS)
200 58 215 44 68 96 104
120
172 132
140
138 158
200
Wavelength (nm)
250
60
80
100
Mass/Charge
No.33
紫外－可见检测器
根据Beer定律，通过检测池透射光的强度与溶质浓度成正比。
Detector Cell Io C b I
Log
I0 = 入射光强度 I = 透射光强度 A = 吸光度
HC
3
CH2
CH 3
N Mg N
N
CH3
N CH 3
0 0 0 0 0
CH 3
CH
3
CH
3
CH
3
M.S. Tswett. Ber. Dtsch. Bot. Ges. 24: 384-393 (1906)
No.5
柱色谱
玻璃柱
重力 洗脱
硅胶 氧化铝 纤维素 糖类粉末
装载 样品
装载 溶剂
滤网
Volume (mL) Time (hr)
I. 样品体积 II. 连接管路的体积 III. 色谱柱进口设计 IV. 色谱柱出口设计 V. 检测池体积 ( < 10 µL )
VI.
降低输出回路响应时间
No.22
不同分离度比较
Poor efficiency Moderate selectivity R=1
Poor efficiency Good selectivity
No.31
Necessity for More than One Detector
Selectivity
Flecainide in Serum
UV signal FL signal
Therapeutic concentration: 1.8mg/l, 20ul injected UV and fluorescence signal
Normal-Phase
Silica, Amino, Cyano Diol
Organics
Ionics Inorganic Ions
Ion Exchange
Anion or Cation Exchange Resin Polystyrene Silica
Aqueous/Buffer Counter Ion
A B
2
3
1
2
1
2
t0=1
α
=
k' B k' A
=
1.64 1.58
=
1.04
α
=
1.15 0.85
= 1.35
α
=
0.95 0.63
=
1.50
改用不同的流动相 改变流动相的组成 改变流动相pH值 改变柱温 应用特殊的化学效应 改变固定相
改变分离选择性α的方法
No.13
温度对分离选择性α的影响
40 ℃
R = 1.5
Excellent efficiency Poor selectivity R = 0.5
Excellent efficiency Moderate selectivity
R=4
No.23
如何提高分离度
通过下述方法增加保留时间:
选择合适的分离参数 增加色谱柱长度 增加固定相浓度
通过下述方法降低谱带宽度:
第四天
下午：1 考试 2 发结业证 3 自由练习、讨论
No.3
第一章 色谱基础
本章内容：
•液相色谱发展史
•液相色谱的基本概念 •影响峰形扩展的因素
No.4
历史回顾
1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919)
碳酸钙吸附剂 石油醚 1940‘s - 分配色谱和纸色谱 1950‘s - 气相, 薄层，凝胶过滤色谱 梯度洗脱色谱 1960‘s - 商业高效液相色谱.
Piston Displacement (祃)
0
System Pressure>0
System Pressure=0
脉冲阻尼器
100
One Piston Cycle TIME
减少了单向阀用量 需要阻尼器 压缩因子补偿
w/o compensation with compensation
For internal use only 11
扩散
C = 传质阻力 在低流速下可以降低传质阻力 使用小颗粒载体可以降低传质阻力
H E T P
流动相
线速度
固定相
滞流的 流动相
No.20
扩散
范德姆特方程 The Van Deemter Equation
A = 涡流扩散 B = 自由分子扩散 C = 传质阻力
HETP
B u
A
线速度
No.21
柱外效应
High MW Compounds Polymers
Size Exclusion
Gel FiltrationAqueous Gel PermeationOrganic
No.8
色谱参数 －定性和定量
tR(B)
tR(A)
Detector Response
t0
Inject A B
W Time
A
W
B
t R = 保留时间 t 0 = 死时间
60℃
0
5 Time in Minutes
10
No.14
柱效
Detector Response Inject
低柱效
高柱效
Time
No.15
计算柱效
tR
Inject
W 1/2
W Time
B
N = 16
t R WB L N
2 = 5.54
t R W 1/2
2
HETP =
No.16
扩散
范德姆特方程 The Van Deemter Equation
No.28
手动进样器－六通阀
Load
Sample Syringe To Waste
Inject
To Waste
To Column Sample Loop (Fixed Volume) To Column From Pump
From Pump
No.29
检测器使用统计
43.0%
UV-VIS DAD Fluorescence Refractive Index 22.0% 4.0% Electrochemical 1.0% 5.0% 7.0% 10.0% 8.0% Conductivity Mass spec Others
195 190 195 205 210 200-210 310 202, 255 220, 275
-C=CC=O - COOR - CHO - COOH - NO
2
-
max
= wavelength of absorption maximum
No.35
Instrumentation - Absorbance Detectors
No.30
Necessity for More than One Detector
Sensitivity
UV-signal
WL 241/394
WL 270/388
WL 248/411
WL 302/420
WL 247/504
Fluorescence
Solv.: H2O/CH3OH= 10:90 PAH's extracted from soil; Col.: Sup.LC-PAH 150x4.6mm;
第二天
上午：1 化学工作站View菜单介绍 2 方法的编辑、修改、存贮及运行 3 Agilent 各部件采集参数设置 4 填写样品信息表、进样分析（实验二） 下午：1 数据处理参数设置 （谱图优化、积分优化） 2 练习 3 谱图处理、手动积分
No.2
第三天
上午：1 各种定量方法原理及其优缺点 2 建立多级外标校正曲线，用外标法定量 3 练习（实验三） 下午：1 建立多级内标校正曲线，用内标法定量 2 再校正、设定报告类型 3 练习（实验四） 4 高级功能简介（序列、DAD光谱功能……） 上午：1 系统日常维护和保养 2 工作站故障诊断功能的应用 3 Agilent 1100泵的维护 （拆泵头，更换泵头消耗品） 4 Agilent 1100检测器的维护（VWD、DAD易耗品的 更换，清洗流通池） 5 练习 结业午餐
Agilent 1100 化学工作站 操作培训
Agilent 1100 化学工作站培训日程安排
第一天 上午： 1 2 3 下午：1 欢迎，相互介绍 液相色谱基础 HPLC仪器工作原理 Agilent 1100 硬件的结构及特点 （真空脱气机、泵、自动进样器、检测器） 2 Windows操作系统简介 3 化学工作站的重新安装、配置及启动 4 练习（实验一）
Mobile Phase
Reversed-Phase
C-18, C-8, C-4, C-2
Water/Organic Modifiers
Ionics, Bases, Acids
Ion-Pair
C-18, C-8
Water/Organic Ion-Pair Reagent
Compounds Insoluble in Water, Organic Isomers
Variable Wavelength (UV/Visible)
Slits Light Source Detector Element
flow Cell Mechanical Grating Monochromator
No.36
Instrumentation - Absorbance Detectors
No.26
溶剂传输系统
减小流量脉冲－并联柱塞泵
P 单向阀 B A A B 柱塞A前进
Single Piston Delivery P
Combined Delivery
柱塞B后退
相消干扰 通常也需要阻尼器 增加了单向阀的使用数量
No.27
溶剂传输系统
消除流量脉冲－串联柱塞泵
单向阀
P
Agilent 1100 Series Pumps: Solvent Compressibility Compensation
溶剂洗脱强度强
2000 1600 mA U 1000 600 0 2 4 Time (min.) 6 8 10
80% Acetonitrile 20% Water
对于反相色谱，增加10％的有机组成等于降低每个色谱峰的K’值的1/2 到2/3。
No.12
分离选择性
(α)
α
= k' B
k' A
A
B
A B
选择性
x
k' 1 + k'
柱效
容量因子
No.11
容量因子
各组份的容量因子（K’）随溶剂洗脱强度的 变化增大或缩小
溶剂洗脱强度弱
1100 700 mA U 60% Acetonitrile 40% Water
300 100 2 4 Time (min.) 6 8 10
增加流动相的洗脱强度，降低了洗脱物的容量因子
W = 峰底宽度
R=2
K’=
tR(B) - tR(A)
WA + WB
= 1.176
tR(B) - tR(A)
W1/2A + W1/2B
tR-t0 t0
No.9
不同R值的峰重叠
0.4
0.5
0.6
0.7
பைடு நூலகம்
0.8
1.00
1.25
R=1.5可以得到基线分离
No.10
影响R值的因素
R=
Δt W
=
1/4
N
x
α- 1 α
A = 涡流扩散 B = 自由分子扩散 C = 传质阻力
HETP
B u
A
线速度
No.17
扩散
A = 涡流扩散——多径扩散
仔细填充柱子 使用均一的载体
初始 带宽
H E T P
A
线速度
最终 带宽
No.18
扩散
B = 自由分子扩散——纵向扩散
在液相中影响小 在低流速中影响大
H E T P
B
线速度
No.19
I0 I
= A = abc
a = 摩尔吸光系数 b = 检测池长度
c = 溶质浓度
No.34
发色团吸收波长
Chromophore
Amine Ethylene Ketone Ester Aldehyde Carboxyl Nitro Phenyl Naphthyl
Structure
- NH 2
max(nm)
使用均一的载体 仔细填充柱子 选择粒度小的载体 优化流速 减小进样量 降低系统死体积 降低输出回路响应时间
No.24
第二章 HPLC 仪器工作原理
本章内容：
•往复活塞泵的结构及工作原理 •手动进样器（六通阀）结构及工作原理 •常见检测器检测原理
No.25
溶剂传输系统
往复活塞泵(单向阀)
Gold Seal Sapphire Insert Ruby Ball Spring Insert
Photodiode Array (UV/Visible) Light Source Holographic Grating
150 4.0
100 3.0 2.0
50
1.0
10
No.6
高效液相色谱 (HPLC)
进样口 混合器 泵 色谱图 色谱柱
检测器
溶剂
No.7
液相色谱类型
Types of Compounds Separated Neutrals Weak Acids Weak Bases
Mode
Stationary Phase
No.32
需要多个检测器
Qualitative Information
Chlortoluron ? Atrazine ?
Take peak spectrum (UV)
Take peak spectrum (MS)
200 58 215 44 68 96 104
120
172 132
140
138 158