协和考博分子生物学精选

重要实验1、RNA酶保护实验（RNase protection assay）：它在许多方面与S1核酸酶分析方法类似。

它是用人工合成的具35S或32P标记的反义RNA探针同目的mRNA杂交，所形成的双链体分子用只切割单链的RNaseA和RNaseT1消化，之后将仍保留着的RNA做大小分部分离，于是被保护的RNA探针便给出了在样品中存在的目的mRNA的大小数值。

此法同样可鉴定样品中mRNA的数量。

2、DNA酶足迹法（DNase footprinting）：也叫足迹实验（footprinting assay），是一种用来检测被特定蛋白特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构特征的实验方法。

基本原理：当DNA分子中的某一区段同特异蛋白结合之后，便会得到保护而免受DNaseⅠ的切割作用，结果不会产生出相应长度的切割分子，于是在凝胶电泳放射自显影图片上便会出现一个空白区，俗称“足迹”。

通过与没有蛋白保护的对照DNA序列比较，便可得知相应于足迹部位的核苷酸序列结构。

3、S1核酸酶定位法（nuclease S1 mapping）：用于揭示mRNA序列结构特征的一种技术。

将从一个克隆基因分离的经放射性标记的单链DNA片段同其相应的mRNA退火形成双链分子，然后用S1核酸酶消化此杂合分子上未互补配对的单链序列，再用PAGE及放射自显影方法，检测保留下来的DNA片段的分子大小。

此法可测定克隆基因中的内含子数目及大体位置，mRNA分子的5’端位置及mRNA5’端任何不均一性的程度。

4、染色体步移（chromosome walking）：借助反向PCR（inverse PCR）通过使部分序列已知的限制片段自身环化连接，然后在已知序列部位设计一对反向引物，经PCR而使未知序列得到扩增。

重复进行反向PCR，从染色体已知序列出发，逐步扩增出未知序列，称染色体步移。

5、凝胶阻滞实验（gel retardation assay）：又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），或电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），或条带阻滞实验（band retardation assay）。

它是根据裸露的DNA与结合有某种蛋白的相同大小的DNA在电泳中具有不同的迁移率（DNA-protein复合物由于具有较高的分子量，因此通过凝胶的速度要比裸露的DNA缓慢）这一原理，在20世纪80年代初期设计出来的用于检测与特定DNA片段相结合的特定蛋白的一种实验技术。

目前也可用于RNA结合protein的研究。

6、甲基化干扰实验（methylation interference assay）：根据DMA能使G残基甲基化，而六氢吡啶又能特异地切割甲基化的G残基这一原理设计的，用于研究protein与DNA相互作用的一种有效的办法。

7、Western blotting：即蛋白质印迹（protein blotting），是用来检测在不均一的蛋白质样品中，是否存在目标蛋白质的一种技术。

其操作程序与Southern blotting十分类似。

先将蛋白质作变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到诸如硝酸纤维素滤膜一类的固体支持物上，通过专一性抗体探测目标蛋白质。

随后再用一种标记的第二抗体（如125I标记的或生物素化的羊抗兔的IgG）检测在印记中存在的免疫复合物（即第一抗体与抗原复合物）。

由于本法是在变性和还原条件下进行凝胶电泳，因此目标蛋白质的分子大小是可被检测出的。

名词解释一1、小分子G蛋白：单体蛋白，分子量20-30kD，与一般G蛋白α亚基有高度同源性并具有相似性，同时与Ras蛋白具有较高同源性，又称为Ras超家族，分为Ras、Rho、Arf、Sar、Ran、Rab六个亚家族，参与多种信号传递途径。

其中Ras蛋白是细胞增殖与分化的关键调节因子，其基因的突变与许多人类肿瘤有关。

2、大分子G蛋白（鸟苷酸结合蛋白（guanine nucleotide binding protein，简称G蛋白））：G蛋白是一类和GTP或GDP相结合、位于细胞膜胞浆面的外周蛋白，由三个亚基组成。

他们是α亚基（45KD）、β亚基（35KD）和γ亚基（7KD）。

G蛋白有两种构象，一种以αβγ三聚体存在并与GDP结合，为非活化型；另一种构象是α亚基与GTP结合并导致βγ二聚体的脱落，此型为活化型。

功能：1、调节腺苷酸环化酶活性；2、调节视网膜cGMP磷酸二酯酶活性。

3、调节磷脂酶C活性，促进IP3与DG的生成；4、调节离子通道。

3、第二信使（secondary messenger）：在细胞内传递细胞调控信号的化学物质称为细胞内信息物质。

通常将cAMP、cGMP、IP3、DG、Ca2+等这类在细胞内传递信息的小分子化合物称为第二信使。

第二信使在传递信号时绝大部分通过酶促级联反应方式进行。

它们最终通过改变细胞内有关酶的活性、开启或关闭细胞膜离子通道及细胞核内基因的转录，达到调节细胞代谢和控制细胞生长、繁殖和分化的作用。

4、基因剔除实验（gene knockout experiment）：建立在同源重组技术的基础上，专门用来定点打断或纠正哺乳动物基因组中的特定基因的实验操作，称基因剔除实验。

它要求在体外构建一种具有失活基因或纠正基因的DNA片段，由于其两端存在着适当的侧翼序列因而能够点射到我们期望研究的遗传座位上，于是这个内源基因便可被取代或纠正。

这种实验方法包括：把外源基因（失活基因或纠正基因）引入胚胎干细胞；选择已成功地发生了同源重组事件的ES细胞亚克隆；把这ES亚克隆导入发育胚胎的胚泡中，由此所诞生的嵌合体动物中，新导入的外源基因成为该种系的一部分，它能够生育出纯合状态的子代动物。

应用此技术，研究工作者便能检测出与某一特定遗传疾病相关的遗传座位，断定特定细胞因子或生长因子的重要性，构建用于研究人类疾病的模式体系。

5、基础转录装置（basical transcriptional apparatus）：在TFⅡA～F等参与下，RNA聚合酶Ⅱ与TFⅡD、TFⅡB等聚合，形成一个功能性的前起始复合物PIC，可以开始转录但其速率低，因此称为基础转录装置。

6、重叠基因（overlapping gene）：是一种转录单位，一个基因可决定多种mRNA和蛋白质，又叫嵌套基因（nested gene）。

它们可以有2个启动子，2个终止子，几个外显子。

转录时，可能使用2个启动子中的1个或2个，也可能使用2个终止子中的1个或2个，或用不同的剪切方式对转录的初级产物进行加工，产生多种mRNA中的一种。

如Bcl-X基因。

7、假基因(pseudogene)：在多基因家族中，不产生有功能基因产物的基因。

即序列与有功能的基因相似，但或者不能转录，或者转录后生成无功能的基因产物。

用Ψ表示。

造成原因是基因在进化过程中，发生突变所致（如缺失、倒位、点突变等）。

假基因往往缺少正常基因的内含子，两侧有顺向重复序列。

8、RNA干扰：siRNA是一类长21—25个核苷酸的双链RNA，产生于病毒感染或其他双链RNA诱导以后，其功能是引起特异的靶mRNA降解，以维持基因组稳定，保护基因组免受外源核酸入侵和调控基因表达等，这一细胞反应过程叫做RNA干扰（RNAi）。

9、酵母双杂交：酵母双杂交是一种新的遗传体系，它是以酵母菌的基因分析为基础，用它在体内研究蛋白质与蛋白质相互作用的实验方法。

双杂交系统是在酵母菌体内用于研究蛋白质相互作用的实验方法，能用于鉴定已知蛋白质之间的相互作用，可对蛋白质的作用部位及关键片段做准确定位，可以从cDNA文库中筛选出与所研究蛋白质相互作用的蛋白质及其编码基因。

并逐渐推广应用到其他一些研究领域如：细胞周期调控，转录调节和信号传导等。

10、转录因子（transcription factor）：转录调节因子由某一基因表达后，通过与特异的顺式作用元件相互作用（DNA-蛋白质相互作用）反式激活另一基因的转录，故称反式作用因子（trans-acting factor）。

11、转录因子（transcription factors，TF）的结构：DNA结合域(DNA binding domain)、转录激活域(activation domain)、蛋白质－蛋白质相互作用结构域（如二聚化结构域）。

（1）DNA结构域：通常由60～100个氨基酸残基组成。

A、锌指(zinc finger)结构。

B、碱性螺旋－环－螺旋(basic helix-loop-hlix，bHLH)。

C、碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper，bZIP)。

（2）转录激活域：由30～100个氨基酸残基组成。

转录激活域又有酸性激活域(acidic activation domain)、谷氨酰胺富含域(glutamine-rich domain)及脯氨酸富含域(proline-rich domain)。

（3）二聚化结构域：二聚化作用与bZIP的亮氨酸拉链、bHLH的螺旋－环－螺旋结构有关。

12、衰减子（attenuator）：位于mRNA分子前导序列中的一段控制蛋白质合成速率的调节区，亦即发生弱化作用的转录终止信号序列。

例如细菌E.coli的trp操纵子中第一个结构基因与启动序列P之间有一衰减子区域。

Trp操纵子的序列1中有两个色氨酸密码子，当色氨酸浓度很高时，核蛋白体（核糖体）很快通过编码序列1，并封闭序列2，这种与转录偶联进行的翻译过程导致序列3、4形成一个不依赖ρ（rho）因子的终止结构——衰减子。

(转录衰减是原核生物特有的调控机制)。

衰减作用（attenuation）：以上机制确保衰减作用在Trp大量存在时增加到最大，一旦Trp缺乏就减到最小。

类似机制至少出现在六个E. coli 操纵子中，它们编码的酶均参与Aa的合成。

13、DNA的体外重组：DNA的体外重组是指含有特异目的基因的DNA片段与载体DNA在试管内连接的过程。

常用的方法：1、粘性末端连接法；2、平末端连接法；3、结尾法；4、人工接头法（linker）。

14、“自杀基因”的基因治疗：也称活化前体药物性基因治疗。

某些病毒或细菌产生的酶能将对人体无毒或低毒的药物前体，在人体细胞内一系列酶的催化下转变为细胞毒性物质，从而导致细胞死亡。

15、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：是一类特异性地水解双链（ds）的DNA的磷酸二酯酶。

分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。

内切酶的用途：1、制作DNA物理图谱；2、DNA限制性片段长度多态性分析（RFLPS）。

3、基因克隆及亚克隆；4、DNA杂交与序列分析；5、基因组同源性研究；6、基因突变和化学修饰的研究。