罗非鱼组织内无乳链球菌实时荧光定量PCR检测方法建立

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罗非鱼无乳链球菌的分离纯化及鉴定

罗非鱼无乳链球菌的分离纯化及鉴定李旻;梁万文;陈汉忠;王凯;陈明;王瑞;陈福艳;米强;吴文德;李雪;黄甜【摘要】目的:对从广西等地暴发链球菌病的罗非鱼养殖场采集的病料分离的几株致病菌进行分离纯化和鉴定.方法:采用传统的常规方法和分子生物学鉴定方法对病菌菌株进行了综合的分析鉴定.结果:根据分离菌株的形态特征、生化特性初步鉴定这三个分离菌株为无乳链球菌株,再进行PCR检测、克隆测序及Blast比对分析,以及动物致病性回归试验等进行综合的分析,最后将分离纯化的三个菌株鉴定为无乳链球菌株.结论:这些无乳链球菌菌株的分离纯化和鉴定,为进一步研究罗非鱼无乳链球菌病的检测、监测方法和各种防控方法奠定了基础.【期刊名称】《大众科技》【年(卷),期】2017(019)011【总页数】5页(P85-89)【关键词】罗非鱼;无乳链球菌;分离鉴定【作者】李旻;梁万文;陈汉忠;王凯;陈明;王瑞;陈福艳;米强;吴文德;李雪;黄甜【作者单位】广西水产科学研究院·广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁 530021;广西水产科学研究院·广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁 530021;广西大学动物科技学院,广西南宁 530005;广西大学动物科技学院,广西南宁 530005;广西水产科学研究院·广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁 530021;广西水产科学研究院·广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁 530021;广西水产科学研究院·广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁 530021;广西水产畜牧学校,广西南宁 530021;广西大学动物科技学院,广西南宁 530005;广西大学动物科技学院,广西南宁 530005;广西大学动物科技学院,广西南宁 530005【正文语种】中文【中图分类】S965水生动物类链球菌病是一种由链球菌感染引起的疾病，目前，链球菌已成为全球性主要水生动物类致病菌之一。

广东省罗非鱼主养区无乳链球菌的分离、鉴定与致病性

广东省罗非鱼主养区无乳链球菌的分离、鉴定与致病性柯剑;赵飞;罗理;姜兰;卢迈新;邹为民【摘要】从广东省5个罗非鱼主养区患暴发性的罗非鱼中分离到15株菌,挑选其中的5株(不同地域、不同组织分离的菌株)进行人工感染试验,表现出自然发病的症状,确定此5株分离菌为导致罗非鱼暴发病的主要病原.通过形态学观察和生理生化实验,并结合16SrRNA基因序列分析,5株分离菌株均为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae).5株分离菌在形态学和生理生化实验结果上保持一致,16SrRNA基因序列同源性达98.6%～99.8%,但在致病性和对药物的敏感性上却呈现一定的差异.另外10株分离菌株通过生理生化实验鉴定也为无乳链球菌.研究表明,广东省罗非鱼流行性暴发病的病原菌主要为无乳链球菌.【期刊名称】《广东海洋大学学报》【年(卷),期】2010(030)003【总页数】6页(P22-27)【关键词】罗非鱼;无乳链球菌;致病性;细菌鉴定【作者】柯剑;赵飞;罗理;姜兰;卢迈新;邹为民【作者单位】中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380;上海海洋大学水产与生命学院,上海,200090;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380【正文语种】中文【中图分类】S941.42我国是世界上最大的罗非鱼养殖地，罗非鱼是我国出口的主要养殖品种之一[1]。

然而，近年来罗非鱼病害的发生逐渐成为我国罗非鱼产业的主要制约因素，且危害呈越发严重的趋势。

国外报道引发罗非鱼病害的主要病原为海豚链球菌（Streptococcus iniae） [2-4]和无乳链球菌（S.agalactiae）[5-6]。

罗非鱼无乳链球菌环介导等温扩增(LAMP)检测技术的建立及应用

在增加了公共卫生安全的风险，这就需要研发采取一种快速、１．１．１细菌菌株罗非鱼ＧＢＳ菌株、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
灵敏和可靠的污染链球菌检测方法，通过采取适当的防控措ｃｏｌｉ）、沙门氏菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ
施，保护易感染群体免受这种人畜共患病原体的侵袭。
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｉｔｒｉｃａｃｉｄｗａｓｔｅｗａｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｂｉｏｍａｓｓ
２０１７，１９：３１２－３２１．
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ＆Ｗａｔｅｒ
［１７］ＬｉＬＸ，ＹａｎｇＸＭ，ＬｉＡ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
科学基金（编号：２０１５ＧＸＮＳＦＡＡ１３９０６８）。作者简介：余艳玲（１９７６—），女，陕西咸阳人，硕士，工程师，主要从事
水产动物分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｅｌｉｎｇ＠１２６．ｃｏｍ。
（Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）与海豚链球菌（Ｓ．ｉｎｉａｅ），均由广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室鉴定和保存。１．１．２主要试剂细菌全基因组ＤＮＡ提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；ＬｏｏｐａｍｐＤＮＡ扩增试剂盒购自日本荣研生物科技公司；ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、钙黄绿
包括野生鱼类［６－７］和养殖鱼类［８－９］严重的疾病，也可导致新生评价。
儿严重的脑膜炎［１０］和成人败血症［１１－１２］。人类或牲畜的ＧＢＳ对罗非鱼具有潜在的感染性［１３］，而来自罗非鱼的ＧＢＳ也可能导致人类感染［１４］。因此，罗非鱼和／或水环境中ＧＢＳ菌株的存

鱼类无乳链球菌病的研究进展

鱼类无乳链球菌病的研究进展邓永强;汪开毓【摘要】无乳链球菌是常见的人兽共患病原菌，常导致新生儿肺炎、脑膜炎、败血症及奶牛乳腺炎。

近年来，在水生动物体内也频繁分离到该菌，尤其是自2007年以来，该菌每年都在中国广东、海南、福建、广西等罗非鱼主要养殖区暴发流行，严重威胁着罗非鱼养殖业的健康发展。

作者综述了当前国内外对鱼类无乳链球菌病的病原学、流行病学、症状、病理变化、毒力因子(荚膜多糖、CAMP 因子、表面免疫原性蛋白、α蛋白、C5a 肽酶)和防控等方面的研究进展，以期为中国鱼类无乳链球菌病的防控提供参考。

%Streptococcus agalactiae is common zoonotic bacteria,which cause neonatal pneumonia, meningitis,septicemia and mastitis in dairy cows.In recent years,it was also be isolated from aquatic animals frequently.Especially since 2007,diseases caused by the bacteria outbreak in Guangdong,Hainan,Fujian,Guangxi and other tilapia aquaculture areas and had a serious threat to the healthy development of tilapia aquaculture in china.In this paper,research progresses on fish Streptococcus agalactiae disease were reviewed.Theetiology,epidemiology,symptoms,path-ological changes,virulence factors (capsular polysaccharide,CAMP factor,Sip,protein alpha,C5a peptidase)and prevention and control were included in the review,which would provide refer-ences for the fish Streptococcus agalactiae disease prevention and control.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)009【总页数】6页(P2490-2495)【关键词】罗非鱼;无乳链球菌;进展【作者】邓永强;汪开毓【作者单位】四川农业大学，成都 611130; 四川省动物疫病预防控制中心，成都610041;四川农业大学，成都 611130【正文语种】中文【中图分类】S852.61+1无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，S.agalactiae)是一种革兰氏阳性球菌，最初常因引起奶牛乳腺炎，造成奶产量下降而引起关注[1]。

罗非鱼无乳链球菌免疫层析快速检测试纸条及其制备方法[发明专利]

专利名称：罗非鱼无乳链球菌免疫层析快速检测试纸条及其制备方法
专利类型：发明专利
发明人：陈汉忠,梁万文,吴文德,李旻,王凯,陈明,王瑞
申请号：CN201710198956.0
申请日：20170329
公开号：CN107656063A
公开日：
20180202
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了罗非鱼无乳链球菌免疫层析快速检测试纸条及其制备方法，检测试纸条由支撑板、样品垫、标记垫、包被膜、吸水垫组成。

所述标记垫包被有抗罗非鱼无乳链球菌单克隆抗体4C12，所述包被膜上前部设有检测线，所述包被膜上后部设有质控线，所述检测线包被有抗罗非鱼无乳链球菌的单克隆抗体3A9，所述质控线包被有羊抗小鼠免疫球蛋白抗体。

将上所述样品垫、标记垫、包被膜、吸水垫依次搭接粘贴在支撑板上。

本发明优点：本发明的试纸条操作简便，不需要本领域的专业人员和专业设备仪器，能满足不同层次人员和部门的需要，尤其是基层生产单位的需要，并且具有快速、准确、灵敏、特异、价格低廉等优点。

申请人：广西大学,广西壮族自治区水产科学研究院
地址：530004 广西壮族自治区南宁市西乡塘区大学路100号
国籍：CN
代理机构：广西南宁公平知识产权代理有限公司
代理人：王素娥
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罗非鱼源无乳链球菌灭活疫苗的研制及其免疫效果的研究

ｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅｔｏＳｔｕｄｙｏｎｉｍｍｕｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒ．
＂ｌｉｌａｐｉａｗａｓｖａｃｃｉｎａｔｅｄｂｙｉｎｊｅｃｔｉｏｎａｎｄｂａｔｈ，ａｎｄｔｉｌａｐｉａｗａｓｉｍｍｕｎｉｚｅｄｂｙｆｏｕｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｗｈｉｔｅｏｉｌｅｄｕｖｅｎｔｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｉｎｉｎｊｃｃｆｉｏｎｇｒｏｕｐＴｈｅｖａｃｃｉｎｅｗａｓｕｓｉｎｇｗｉｔｈｔｈ／＿ｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｄｊｕｖｅｎｔｓｏｆＲａｃｅａｎｉｓｏｄａｒｎｉｎｅ、ｆａｔｔｙ
ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎｄｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎｄｃａｔａｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎｄ
ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅｉｎｔｈｅｓｅｒｕｉｌｌｆｒｏｍｔｉｌａｐｉａＴｈｅｄｌａｐｉａｉｍｍｔｍｉｚｅｄｗｉｔｈｖａｃｃｉｎｅ
关键词：无乳链球菌，疫氲免疫效果，培养条件优化，佐剂
ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＥｆｆｉｃａｃｙｏｎｔｈｅ
ＩｎａｃｔｉｖａｔｅｄＶａｃｃｉｎｅｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＡｇａｌａｃｔｉａｅ
ＩｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＴｉｌａｐｉａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｉｎｄｅｃａｄｅｓ，ｗｉｔｈｔｈｅｒａｐｉｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｉｌａｐｉａａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｓｏｆｃｕｌｔａｒｅｄｆｉｓｈｔｏｏｋｐｌａｃｅｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，ｃａｕｓｉｎｇｈｕｇｅｅｃｏｎｏｍｉｃｌｏｓｓｔｏａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｗｅｍａｌｎｉｙｆｏｃｕｓｅｄｏｎｔｈｅｇｒｅａｔｈａｒｍｃａｕｓｅｄｂｙＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅｔｏｔｈｅｔｉｌａｐｉａａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅｉｎｄｕｓｔｒｙｉｎｃｈｉｎａ，ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇａｖａｃｃｉｎｅｔｏｐｒｅｖｅｎｔＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓｏｆｆｉｓｈＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｅｄ，ｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗａｓｏｐｔｉｍｉｚａｔｅｄａｎｄｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆ＆ａｇａｌａｃｔｉａｅｖａｃｃｉｎｅｉｎｔｉｌａｐｉａｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄ

一株罗非鱼无乳链球菌Streptococcus_agalactiae_CS2108的全基因组测序及功

罗非鱼主要分布在热带、亚热带地区，对环境适应能力强，生长速度快，繁殖能力强，并且其肉味鲜美、肉质细嫩、食用方法简单、营养丰富，深受广大养殖户的青睐[1-2]。

发展罗非鱼养殖产业对于增加农民就业机会和收入、促进国际贸易具有十分重要的意义[3-4]。

随着罗非鱼养殖模式向着高密度、集约化养殖发展，加上养殖水质、环境及气候的恶化，渔民防控意识的欠缺，导致各类病害常大面积暴发[5]。

其中链球菌病是罗非鱼健康养殖的最大威胁，最主要的病原菌是无乳链球菌(Sreptococcus agalactiae )。

近年来，罗非鱼无乳链球菌病在我国广东、广西和海南等地时有发生，具有暴发范围广、死亡率高的特点[6]。

无乳链球菌大多呈球形，链状排列，革兰氏染色阳性，具有荚膜和鞭毛，无芽孢，适宜在温度28～37℃、pH 值7.4～7.6条件下生长。

在脑心浸液琼脂固体培养基上呈卵圆形，菌落表面光滑。

目前，利用Lance-field 法可以将其分成Ia 、Ib 、Ⅱ～Ⅸ共10个血清型[7]。

该病主要病理特征为眼球突出或浑浊发白[8]，眼眶充血，腹部膨大，肛门红肿，少食或者绝食，游姿平衡失调，解剖病鱼可见胆囊肿大，胆汁稀薄，色浅，肠内充满淡黄色液体，肝脏增大[9-10]。

组织病理学表现为鳃充血，肾脏受损、肿大、白细胞浸润，肝脏颗粒变性，肠道粘膜上皮变性、坏死、脱落、固有膜上炎性白细胞浸润，眼睛脉络膜和眶骨膜组织炎性坏死等[11]。

收稿日期：2023-09-03基金项目：柳州市科学技术局科技攻关与新产品试制项目“基于养殖水体中痕量无乳链球菌检测策略的罗非鱼链球菌病防治新技术研究”（2020NACB0802）；广西壮族自治区农业农村厅广西农业科技自筹经费项目“淡水鱼病害诊治APP 推广应用”（Z2022168）；广西壮族自治区农业农村厅广西农业科技自筹经费项目“稻虾螺共生稻田生态养殖新模式创建与示范”（Z2022171）。

作者简介：施金谷（1986—），硕士，工程师，研究方向为水产病害检测与防控。

双重 PC R检测罗非鱼源无乳链球菌方法的建立

ＺＥＮＧＺｈａｎ－ｚｈｕａｎｇ
（１．ＦｒｅｓｈｗａｔｅｒＦｉｓｈｅｒｉｅｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｕｊｉａｎ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ３５０００２。Ｃｈｉｎａ；２．ＦｉｓｈｅｒｙＴｅｃｈｎｉｃａｌＥｘｔｅｎｓｉｏｎＳｔａｔｉｏｎｏｆＳｈｕｎｃｈａｎｇＣｏｕｎｔｙｉｎＦｕｊｉａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｓｈｕｎｃｈａｎｇ，Ｆｕｊｉａｎ３５３２００，Ｃｈｉｎａ）
关键词：双重ＰＣＲ；无乳链球菌；１６ＳｒＲＮＡ基因；ｓｉｐ基因；罗非鱼
中图分类号：Ｓ８５２
文献标识码：Ａ
ＲａｐｉｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅＩｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＴｉｌａｐｉａｗｉｔｈＤｏｕｂｌｅＰＣＲＦＡＮＨａｉ — ｐｉｎｇ，ＷＵＢｉｎ，ＺＨＡＮＧＸｉｎ — ｙａｎ，ＤＥＮＧＺｈｉ — ＷＵ，ＺＨＥＮＧＬｅｉ，ＺＨＯＮＧＱｕａｎ — ｆｕ，
Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ NhomakorabeaｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１４，２９（１）：８ —１１．

一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法[发明专利]

专利名称：一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法专利类型：发明专利
发明人：易弋,杨军,黄稀,黎娅,伍时华,罗福广,左跃
申请号：CN201210368104.9
申请日：20120927
公开号：CN102888458A
公开日：
20130123
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法，涉及一种无乳链球菌的检测方法，本发明以无乳链球菌基因为检测对象，通过检测罗非鱼血液中是否存在无乳链球菌基因，从而判断被检罗非鱼是否受到了无乳链球菌感染。

本方法通过反转录的方法将菌体内单拷贝的基因转变为多拷贝，再通过环介导等温扩增技术对目标基因进行检测，从而大大提高检测灵敏度。

该方法能在感染初期快速、特异、简便的检出罗非鱼体内的无乳链球菌，为罗非鱼链球菌病的预防提供新的技术手段。

申请人：广西工学院,柳州市鱼家乐饲料有限公司
地址：545006 广西壮族自治区柳州市东环路268号
国籍：CN
代理机构：柳州市荣久专利商标事务所(普通合伙)
代理人：周小芹
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罗非鱼无乳链球菌间接ELISA检测方法的建立

罗非鱼无乳链球菌间接ELISA检测方法的建立赵光军;李高俊;佟延南;李芳远;王世锋【期刊名称】《现代农业科技》【年(卷),期】2018(000)006【摘要】本文利用终浓度为0.5％(v/v)的甲醛在4℃条件下灭活24 h制备灭活的罗非鱼无乳链球菌,用其作为抗原对兔进行免疫制备兔抗无乳链球菌血清,以无乳链球菌抗兔血清作为一抗,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG作为酶标二抗,建立并优化了无乳链球菌的间接ELISA快速检测方法.此检测方法的抗原最适包被浓度为1×107 CFU/mL,一抗最适工作浓度为1:100(v/v),二抗最适工作浓度为1:2000(v/v),最低检测限为1×104 CFU/mL.利用此法对发病的罗非鱼进行检测,阳性检出率为80％,与本试验选取的指示菌株均无交叉反应.【总页数】4页(P213-215,219)【作者】赵光军;李高俊;佟延南;李芳远;王世锋【作者单位】海南省海洋与渔业科学院,海南海口 571126;海南省海洋与渔业科学院,海南海口 571126;海南省海洋与渔业科学院,海南海口 571126;海南省海洋与渔业科学院,海南海口 571126;海南大学【正文语种】中文【中图分类】S943【相关文献】1.基于奶牛乳腺炎无乳链球菌rSip-PGK-FbsA融合蛋白的间接ELISA检测方法的建立 [J], 吴金花;布日额;王金良;陈金龙;锡林高娃;孙立杰;王华;王学理;刘燕2.牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白pgk抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立 [J], 布日额;任晓峰;吴金花;王学理;刘燕;锡林高娃;孙立杰;刘洋3.牛源无乳链球菌sip蛋白抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立[J], 郎景民;布日额;孙立杰;刘娣;吴金花;锡林高娃;刘燕;史芬芳4.罗非鱼源无乳链球菌的间接ELISA快速检测方法 [J], 祝璟琳;李大宇;肖炜;邹芝英;杨弘5.以重组无乳链球菌GapC1-150作抗原的牛血清抗体间接ELISA检测方法建立[J], 刘硕;崔玉东;王欣;李皖豫;马骏;范钊伟;王然;段旭阳;周玉龙;朱战波因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

尼罗罗非鱼无乳链球菌微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

尼罗罗非鱼无乳链球菌微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用张险朋;丁文桂;胡毅军;李小军;李永福;黄育浩;李敏;李建军【期刊名称】《水产学杂志》【年(卷),期】2024(37)2【摘要】通过设计筛选引物和探针、优化反应浓度和退火温度,构建一种尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法,分析该方法的敏感性、特异性及重复性,并应用于临床样品检测。

结果显示:当引物、探针浓度分别为0.9μmol·L^(-1)、0.3μmol·L^(-1)且退火温度为56.9℃时,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR方法阴、阳性微滴分布界限明显,平均拷贝数高,有较高扩增反应效率;线性关系线良好(R^(2)=0.997 3),最低检测限为2.56 copies·μL^(-1);与猪链球菌2型、鱼类海豚链球菌和其他5种常见的水生动物疫病病原体无交叉反应;重复变异系数为3.15%;临床样品检测结果与实时荧光PCR方法结果的符合率100%,与细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。

结果表明,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可对罗非鱼无乳链球菌感染的临床样品进行定量检测,为尼罗罗非鱼无乳链球菌的研究提供有益参考。

【总页数】9页(P46-54)【作者】张险朋;丁文桂;胡毅军;李小军;李永福;黄育浩;李敏;李建军【作者单位】东莞市动物疫病预防控制中心;佛山科学技术学院【正文语种】中文【中图分类】S965.125【相关文献】1.罗非鱼无乳链球菌巢式 PCR 检测方法的建立2.基于毒力基因的罗非鱼无乳链球菌三重PCR检测方法的建立及应用3.罗非鱼组织内无乳链球菌实时荧光定量PCR 检测方法建立4.罗非鱼湖病毒微滴式逆转录数字PCR检测方法的建立因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

罗非鱼无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗免疫效果研究

罗非鱼无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗免疫效果研究林楠【摘要】为研究无乳链球菌Streptococcus agalactiae表面免疫蛋白(surface immunogenic protein,SIP)微胶囊口服疫苗对罗非鱼Oreochromis niloticus的免疫效果,将制备的无乳链球菌SIP微胶囊疫苗口服免疫健康的罗非鱼,以注射免疫无乳链球菌灭活疫苗为阳性对照,口服包埋PBS的微胶囊颗粒为阴性对照,分别于免疫后0、7、14、28 d取脾脏组织,通过实时荧光定量PCR方法检测脾脏组织中的白细胞分化抗原CD4、白介素IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子TNF-α、核转录因子NF-κB等5种免疫相关基因表达的变化,并于第5周进行人工感染攻毒试验,计算无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗对罗非鱼的相对免疫保护率.结果显示,免疫接种之后,SIP微胶囊疫苗口服免疫组(SIP疫苗组)和全菌灭活疫苗注射免疫组(灭活疫苗组)罗非鱼脾脏中的5种免疫相关基因表达均不同程度上调,且相对表达量显著高于阴性对照免疫组(阴性对照组)(P<0.05).在人工感染攻毒试验中,SIP疫苗组和灭活疫苗组的死亡率均显著低于阴性对照组(P<0.05),灭活疫苗组比SIP疫苗组得到了更高的免疫保护率,但两组的死亡率差异不显著(P>0.05).说明罗非鱼无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗免疫效果好,在罗非鱼无乳链球菌病的免疫防治中有良好的应用前景.%The immunological efficacy of Streptococcus agalactiae surface immunogenic protein (SIP) oral vaccine on tilapia (Oreochromis niloticus) was studied .Randomly grouped fish were injected with the inactivated vaccine as the positive control (Group Inactivated Vaccine) ,or orally administered with SIP vaccine (Group SIP Vaccine) for treatment or PBS as the negative control (Group Negative Control) .Spleen samples from the tilapias were collected at 0 ,7 ,14 and 28 d after the immunization .Thegene expressions of the cluster determinant 4 (CD4) ,interleukin-8 (IL-8) ,interleukin-10 (IL-10) ,tumor necrosis factor α(TNF-α) and nucle ar transcription factors κB (NF-κB) were determined by the quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) .Four weeks after the treatments ,the groups were challenged by the artificial infection of S .agalactiae to observe the relative percentsurvivals(RPS)onthefish.TheresultsshowthattheexpressionsonCD4,IL-8,IL-10,TNF-αandNF-κBgenes of Group SIP Vaccine and Group Inactivated Vaccine increased in varying degrees ,and were significantly higher (P<0.05) than those of Group Negative Control .The death rates of fish in Group SIP Vaccine and Group Inactivated Vaccine were significantly lower (P<0.05) than that of Group Negative Control .The RPS of Group Inactivated Vaccine was higher than that of Group SIP Vaccine ,but not significantly different (P>0.05) .It appeared that the SIP oral vaccine could be used with satisfaction in protecting tilapias from S .agalactiae infection .【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2018(033)004【总页数】6页(P351-356)【关键词】罗非鱼;无乳链球菌;表面免疫蛋白;免疫相关基因;免疫保护【作者】林楠【作者单位】福建省水产技术推广总站 ,福建福州 350002【正文语种】中文【中图分类】S943自2008年国内首次报道从罗非鱼爆发性流行病中分离无乳链球菌以来[1]，广东、海南等罗非鱼主养区均出现无乳链球菌导致的链球菌病大规模爆发[2]，造成较大经济损失，严重影响罗非鱼产业的健康发展。

吉富罗非鱼源无乳链球菌Sip-GAPDH融合基因的构建及其原核表达

吉富罗非鱼源无乳链球菌Sip-GAPDH融合基因的构建及其原核表达王蓓;李桂欢;鲁义善;汤菊芬;黄郁葱;吴灶和;简纪常【摘要】利用重叠延伸（SOEing）PCR技术，将吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）源无乳链球菌（Streptococcus agalactiae） ZQ0910株表面免疫原性蛋白（Surface immunogenic protein，Sip）基因与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因通过Linker序列融合，构建成为Sip-GAPDH融合基因。

将其定向克隆至原核表达载体pET-32a（+）中，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达。

结果表明，重组质粒pET-32a-Sip-GAPDH在大肠杆菌BL21（DE3）中表达后所获得的融合蛋白Sip-GAPDH分子量为102.01 kD，表达最佳条件为37℃，IPTG浓度0.1 mmol/L，诱导5 h。

Western blot鉴定结果表明融合基因得到了成功表达。

%The DNA fragment encoding the Sip and GAPDH gene of Streptococcus agalactiae strain ZQ0910 isolated from GIFT Strain of Nile Tilapia(Oreochromis niloticus)were obtained by PCR. The Sip-GAPDH gene was constructed in a Sip-linker-GAPDH format with the standard 15-amino acid linker(Gly4Ser)3 by SOEing PCR technique, and the final full length product was cloned into the pET-32a(+)vector for protein expression in Escherichia coli strain BL21(DE3). The result showed that the expression fusion protein Sip-GAPHD were about 102.01 kD and Western blotting analysis confirmed that the 102.01 kD protein was the fusion protein, because it was specifically recognized by mouse anti-His monoclonal antibody. Inducing the cells at 37℃in 0.1 mmol/L of IPTG for 5 hours wasthe optimal conditions for expression of the recombinant Sip-GAPDH fusion protein.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2014(000)007【总页数】6页(P137-142)【关键词】无乳链球菌;Sip-GAPDH融合基因;重叠延伸PCR技术;原核表达【作者】王蓓;李桂欢;鲁义善;汤菊芬;黄郁葱;吴灶和;简纪常【作者单位】广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088; 仲恺农业工程学院，广州 510225;广东海洋大学水产学院，湛江524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088;广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088【正文语种】中文罗非鱼，又被称为“白色三文鱼”，是联合国粮农组织推荐的21世纪最有发展前景的淡水养殖品种［1，2] 。

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摘要：为建立一种罗非鱼组织内无乳链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ）的定量检测方法，以无乳链球菌基因为
靶标建立了ＴａｑＭａｎ荧光探针实时定量ＰＣＲ方法，并对该方法的特异性、敏感性及实用性进行了验证。应用建
ＴｈｅｍｉｎｉｍｕｍｄｅｔｅｃｔａｂｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅｇｅｎｏｍｅＤＮＡｗａｓ３．４２ ×１０～ｎｇ・ＬＬＬ～，ａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆｔｈｅａｓｓａｙ
Ｖｏ１．１１，Ｎｏ．３
Ｊｕｎ．，２０１５
罗非鱼组织内无乳链球菌实时荧光定量ＰＣＲ检测方法建立
王瑞，李莉萍，黄婷，梁万文，梁聪，雷爱莹，陈明
（广西水产科学研究院，广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁５３００２１）
ａｎｄｐｒａｃｔｉｃａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅａｓｓａｙ．ＴｈｅｓｔａｎｄａｒｄａｎｄｐｏｓｉｔｉｖｅｓｔｒａｉｎｓｏｆＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅ．ａｎｄａＩＪｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓｗｅｒｅｎｅｇａｔｉｖｅ．
ａｇａｌａｃｔｉａｅｆｒｏｍｔｉｌａｐｉａｔｉｓｓｕｅ
ＷＡＮＧＲｕｉ，ＬＩＬｉｐｉｎｇ，ＨＵＡＮＧＴｉｎｇ，ＬＩＡＮＧＷａｎｗｅｎ，ＬＩＡＮＧＣｏｎｇ，ＬＥＩＡｉｙｉｎｇ，ＣＨＥＮＭｉｎｇ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｙｄｅｓｉｇｎｉｎｇｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｐｒｏｂｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎｏｆ
ｇｅｎｅｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｓｕａｇａｌａｃｔｉａｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｉｌａｐｉａ，
第１１卷第３期
２０１５年６月ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５— ０７８０．２０１５．０３．００７
南方水产科学
ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＦｉｓｈｅｒｉｅｓＳｃｉｅｎｃｅ
立的方法检阳性，阴性对照菌株均为阴性；无乳链球菌基因组ＤＮＡ最低检测质量浓度为３．４２×１０一ｎｇ・ｔｘＬ～，每个反应体系检测下限低于１０个细胞；人工感染罗非鱼肝、脾、中肠和肾组织样品无乳链球菌检测结果均为阳性，组织样品每微克ＤＮＡ可检测到无乳链球菌细胞数量分别为２．９５×
中图分类号：Ｓ９４３．１２５文献标志码：Ａ文章编号：２０９５— ０７８０一（２０１５）０３— ００４１— ０６
Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
（ＧｕａｎｇｘｉＫｅｙＬａｂ．ｆｏｒＡｑｕａｔｉｃＧｅｎｅｔｉｃＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＨｅａｌｔｈｙＡｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，ＧｕａｎｇｘｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｉｓｈｅｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｎｉｎｇ５３００２１，Ｃｈｉｎａ）
ｗｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｒｅａｌ — ｔｉｍｅｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅｆｒｏｍｔｉｌａｐｉａｔｉｓｓｕｅａｎｄｖｅｒｉｉｆｅｄｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
１０个、２．４５×１０个、２．３４×１０个和４．５４×１０个，对照组为阴性。结果表明建立的罗非鱼组织内无乳链球菌
实时荧光定量ＰＣＲ检测方法具有准确性高、特异性和敏感性强等特点，可对罗非鱼组织内无乳链球菌进行快速定量检测，可用于罗非鱼无乳链球菌病的监测与预防。关键词：罗非鱼；无乳链球菌；实时荧光定量ＰＣＲ；ＴａｑＭａｎ荧光探针