PCR假阳性等问题
PCR影响因素
1. 由于PCR反应灵敏度很高，因此要特别主意防止DNA污染的发生。
样品间的相互污染可能产生假阳性结果，特别是将PCR技术应用到临床病原菌感染确定中。
2. 如果是公用的、没有密码保护的PCR仪，经常检查PCR仪上的程序正确与否。
3. 不使用过量试剂“less is usually better (more specific)”。
4. 试剂购回后应分装成小份使用，这样一旦有污染发生，可以立即丢弃污染的试剂，不会造成大的损失；试剂分装也有助于减少反复冻融次数（例如dNTPs对反复冻融敏感）。
5. 加完所有试剂后用枪头吹打几次或稍微涡旋或轻弹管壁以保证充分混匀。
6. 使用阴性对照检查污染的发生。
7. 使用阳性对照（能良好扩增的样本）。
8. 电泳时使用DNA分子量标准品（指示是否PCR失败或条带跑出凝胶或拍照系统失败）。
9. 当扩增很长的、GC含量高的模板时或容易产生二级结构的模板时适量使用添加剂（glycerol, formamide, NMP使变性和退火温度降低几度；glycerol也可起到稳定聚合酶活性的作用；DMSO 减少二级结构的发生，并通过减弱非特异性引物结合的稳定性，提高反应的特异性）。
10. 不使用带有自动除霜功能的冰箱存储酶（避免反复冻融），每次取酶时都使用新的枪头酶，酶使用后应立即放回冰箱。
酶要在加完缓冲液后再加，直接将酶加入水中可能导致酶变性失活。
11. PCR产物的电泳检测时间，一般为48 h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。
一、PCR反应的关键环节1. 模板核酸的制备。
2. 引物的质量与特异性。
3. 酶的质量。
4. PCR循环条件。
二、PCR常见问题及对策1. 假阴性，不出现扩增条带（1）模板原因①模板中含有杂蛋白质。
②模板中含有Taq酶抑制剂。
③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白。
④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：①必要时重新设计引物。
②减低酶量或调换另一来源的酶。
③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
③适当降低Mg2+浓度。
④增加模板量，减少循环次数。
克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。
1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。
应测定比值范围。
连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。
室温保温1小时，或4oC过夜。
在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。
室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4oC过夜。
PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。
如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。
PCR假阳性问题
假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
（二）造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。
4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
5. 实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题比较常见。
（三）假阳性问题的试验控制在每次PCR检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。
阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明DNA提取（RNA提取、RNA反转录）、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。
在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。
只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果成立。
造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策PCR常见问题分析及对策(⽆扩增产物、⾮特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：⽆扩增产物现象：正对照有条带，⽽样品则⽆原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发⽣降解4.反应条件：退⽕温度太⾼，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使⽤试剂盒提取模板DNA或加⼤模板的⽤量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间⼆聚体和链内⼆级结构）或者换⼀管新引物4.降低退⽕温度、延长延伸时间问题2：⾮特异性扩增现象：条带与预计的⼤⼩不⼀致或者⾮特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过⾼3.酶量过多4.Mg2+浓度偏⾼5.退⽕温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使⽤巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离⼦浓度5.适当提⾼退⽕温度或使⽤⼆阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退⽕温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏⾼6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提⾼退⽕温度4.适量⽤酶5.适当降低dNTP和镁离⼦的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空⽩对照出现⽬的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应⼩⼼轻柔，防⽌将靶序列吸⼊加样枪内或溅出离⼼管外；2.除酶及不能耐⾼温的物质外，所有试剂或器材均应⾼压消毒。
所⽤离⼼管及加样枪头等均应⼀次性使⽤。
3.各种试剂最好先进⾏分装，然后低温贮存琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物⼀．原理DNA⽚断的分离与回收是基因⼯程操作中的⼀项重要技术，例如可收集特定酶切⽚断⽤于克隆或制备探针，回收PCR产物⽤于再次鉴定等。
回收实验中两个最重要的技术指标是纯度和回收率：前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；后者不理想时往往会⼤⼤增加前期的⼯作量。
PCR常见问题汇总
PCR常见问题总汇PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
PCR扩增结果分析和胶回收切胶的一点注意事项
讨论1.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有Taq酶抑制剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
③模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
PCR试验结果解读诊断准确性评估
PCR试验结果解读诊断准确性评估PCR（聚合酶链反应）是一种强大的分子生物学技术，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
在新型冠状病毒（COVID-19）疫情肆虐的当下，PCR试验成为了检测感染者的主要手段之一。
然而，PCR试验结果解读对于诊断准确性的评估至关重要，本文将对此进行探讨。
一、PCR试验原理在深入研究PCR试验结果的解读前，有必要先了解PCR的原理。
PCR试验是通过不断复制目标DNA序列，以使其浓度显著增加，从而能够检测到极微量的DNA。
PCR试验主要由三个基本步骤构成：变性、退火和扩增。
通过这些步骤，PCR试验可以在短时间内复制出数百万甚至数十亿个目标DNA分子。
二、PCR试验结果解读PCR试验结果的解读需要根据具体的目标基因或DNA序列来进行评估。
在COVID-19检测中，常用的目标基因是SARS-CoV-2病毒的核酸序列。
PCR试验结果一般会显示PCR反应体系中是否存在目标DNA序列，并且可以根据信号的强弱来判断病毒的感染程度。
正常情况下，PCR试验结果应该为阴性，即未检测到目标DNA序列。
这意味着被检测者未被感染。
而如果PCR试验结果为阳性，即检测到目标DNA序列，则意味着被检测者存在感染。
然而，需要注意的是，低浓度的目标DNA序列可能会导致PCR试验结果为假阳性。
因此，在解读PCR试验结果时，需要结合临床症状和其他检测结果进行综合分析。
三、PCR试验结果解读的误差尽管PCR试验是一种高度敏感和特异的检测方法，但仍然存在一定的误差。
这些误差可能源于多个方面，包括实验条件、操作技巧、试剂质量和样本质量等。
因此，在进行PCR试验结果解读时，需要考虑这些误差的影响。
一种常见的误差是假阴性结果，即未能检测到实际存在的目标DNA序列。
这可能是由于样本中目标DNA序列的浓度过低、反应条件不理想或操作技巧不当等原因导致的。
此外，PCR试验结果也受到实验设备和试剂的质量影响。
因此，为了提高准确性，需要严格控制实验条件，使用高质量的试剂和设备。
一代测序常见问题及解决策略
测序常见问题及解决策略一、PCR常见问题1.假阴性，不出现扩增条带PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因：1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。
2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。
3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
常见原因有：1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
pcr-技术审核中存在的问题及解决措施
为确保实时PCR设备的准确性和可靠性，应对设备进行定 期维护和校准，同时应选择经过认证的试剂和仪器品牌。
要点二
实时PCR技术应用不当
为避免实时PCR技术应用不当导致的误差和异常情况，应 进行技术培训和质量控制，提高实验人员的技能水平。同 时应建立完善的技术标准和操作流程，以确保实验结果的 准确性和可靠性。
• PCR（聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，可用于快速、灵敏地检测特定DNA序列 的存在。PCR技术审核是指对使用PCR技术进行的检测实验进行全面的评估和审核，以确保实验的准确性和可靠性。
pcr-技术审核重要性
• PCR技术广泛应用于医学、生物学、农业等领域，其准确性和 可靠性对于实验结果的质量和可靠性具有至关重要的影响。因 此，对PCR实验进行技术审核是十分必要的。通过对实验的审 核，可以及时发现并纠正实验中存在的问题，提高实验的准确 性和可靠性，避免因实验失误而导致的误诊或误判。
02
pcr-技术审核中存在的问题
样品污染
实验室环境或试剂被污染
实验室环境或试剂被污染，可能导致扩增产物中检测到非目标序列，影响结果 准确性。
样品间交叉污染
不同样品之间存在交叉污染，导致扩增产物中出现非目标序列，影响结果判断 。
假阳性/阴性结果
假阳性结果
由于引物特异性不高或存在非特异性扩增，导致扩增产物中 检测到非目标序列，呈现假阳性结果。
详细描述
高通量pcr技术采用了先进的仪器设备，能够同时对多个 样本进行pcr扩增和检测，大大缩短了检测时间，提高了 检测效率。此外，高通量pcr技术还能够对多个基因位点 进行同时检测，提高了检测的准确性和灵敏度。
PCR常见问题总结
PCR常见问题总结PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
PCR实验常见问题
【实验】PCR常见问题总结作者: gene121(站内联系TA)发布: 2005-07-04PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。
一.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
pcr的局限性
pcr的局限性PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、生物学研究等领域。
然而，PCR也存在一定的局限性。
本文将探讨PCR技术在实际应用中的局限性，并提出一些可能的解决方案。
一、样本污染PCR技术对样本的纯净度要求较高。
即使微小的外源污染也可能引入假阳性结果。
样本污染可能来自实验环境、试剂、仪器设备，或者操作者本身。
特别是在目标DNA含量很低的情况下，污染对PCR结果的影响更为明显。
解决方案：1. 严格控制样本处理过程中的污染。
在实验室环境中，应定期消毒操作台面和仪器设备，避免细菌与DNA的交叉污染。
2. 采用质量可靠的试剂和消耗品，并遵循厂家提供的操作指南。
3. 为每一个PCR反应设置阴性对照，以及必要的阳性对照，以确定实验过程中是否出现样本污染。
二、特异性PCR的特异性是指只扩增目标序列而不扩增其他非特定序列。
然而，由于基因组的复杂性和相似序列的存在，PCR扩增产物的特异性可能受到影响。
特别是在分子标记较短或目标序列与非特定序列相似度较高时，特异性会成为一个问题。
解决方案：1. 根据序列的特点设计特异性引物。
可以使用生物信息学工具检查引物序列是否存在非特定反应的可能性，并进行必要的修正。
2. 选择适当的扩增条件和试剂配方，如调节退火温度、引物浓度、试剂浓度等，以提高特异性。
3. 验证扩增产物的特异性，可以采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、测序、或相关的分子生物学技术进行检测。
三、定量准确性PCR通常被用于定量目的，例如测定基因表达水平或病原体载量。
然而，PCR的定量准确性常受到多种因素的限制，包括反应效率、扩增曲线的线性范围、引物的选择和环境条件等。
解决方案：1. 使用标准曲线法进行定量。
通过制备一系列已知浓度的参比样品，构建标准曲线，以根据扩增产物的信号强度计算未知样品的目标物含量。
2. 优化PCR反应条件，如试剂浓度、退火温度、扩增循环数等，以提高反应效率和准确性。
PCR技术用于微生物检测的优缺点
PCR技术用于微生物检测的优缺点(一) PCR技术用于微生物检测的优点传统办法检测微生物通常用平板培养法，通过菌落计数来推断菌休浓度。
这种办法简单操作，但是通常耗时较长，快者需培养2~3d，慢者需7~10d方能出检测结果。
然而，用PCR技术可以快速、特异性地扩增待检微生物目的DNA片段，很快即可推断某种(类) 微生物在样品中存在与否，十分迅捷、敏捷。
此外，PCR技术可以用来检测那些人工无法培养或难以培养的微生物，从而大大增强诊断检查内容和诊断能力。
(二) PCR技术用于微生物检测的缺点 PCR技术也存在着一些缺陷，故尚未能成为一种常规检查办法。
目前仍无法彻低取代传统的培养检测法。
其缺陷主要体现在以下方面。
1.假阳性问题 PCR用于微生物检测，最大问题是核酸污染造成假阳性。
PCR具有极高的敏捷度就是造成这个问题的缘由，由于1~100个分子水平上的污染即可使扩增呈阳性。
假阳性的造成，主要是扩增产物污染和标本间的交错污染。
扩增产物污染既是最严峻，也是最简单发生的一种污染；由于经过一次PCR扩增，可以产生大量的扩增产物，即使最极小的气溶胶微滴(1×10-6uL)，也可含有大量的靶分子。
如该气溶胶被带进扩增管内，明显假阳性就产生了。
要防止假阳性，主要是做好物理隔离， PCR试验室最少应分为3个区：标本处理区、试剂配制区、扩增及产物检测区，采取扩增前、后隔离操作制；规范试验程序、严守试验室规章。
试验中必需每次做阴性对比，以推断是否有污染而造成假阳性。
2.假阴性问题假如用于PCR扩增的模板液中带有某种抑制PCR反应的成分，则有可能使扩增失败而产生假阴性。
尤其是食品中成分比较复杂，食品基质成分抑制PCR反应导致假阴性的状况比较常见。
因此，每次试验中也必需同时设立阳性对比以推断是否有抑制成分导致的假阴性。
3.定量检测困难 PCR法检测微生物，其结果表现为“有”或“无”，仅可定性判别，无法定量分析。
PCR_法检测WSSV_出现假阳性和非特异性条带的原因分析及解决方法
套式PCR法检测白斑综合征病毒(WSSV)因操作简便、灵敏度高等优点而被县级实验室广泛应用。
但基层实验室由于缺少专职实验操作员、管理较为松散等原因，经常出现假阳性和非特异性条带问题。
近年来，农业农村部每年开展水生动物防疫系统实验室检测能力验证工作，要求已经建成运行的县级水生动物防疫站至少参加一种疫病的实验室能力验证项目。
白斑综合征(WSD)由于发病率高、引起水产动物死亡率高从而成为众多县级实验室选择的检测项目。
昆山市水生动物疫病预防控制中心自2015年起开展WSSV的实验室检测工作，参照《白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分：套式PCR检测法》(GB/T28630.2－2012)严格执行。
然而，在实验过程中，经常会出现假阳性和非特异性条带。
笔者与江苏省内多家县级水生动物防疫站交流后发现，以上两个问题在多家实验室普遍存在。
本文对套式PCR法检测WSSV假阳性和非特异性条带两个问题形成的原因加以分析，并提出预防和解决方法，旨在为广大基层实验室提供参考。
一、假阳性1.形成原因套式PCR的原理是采用两步法进行目的片段的扩增，第二步PCR以第一步PCR反应产物为模板。
这种方法检测灵敏度非常高，即使在反应体系中出现了极其微量的模板污染，也会造成假阳性。
(1)首次假阳性。
由于县级防疫实验室的检测人员并非专职实验操作员，一般为当地水产技术推广部门的工作人员兼职负责，所以在操作过程中，可能会出现枪头非一次性使用、动作幅度过大、手套未及时更换、PCR阳性产物不慎溢出等不当操作，这些都是导致假阳性的原因。
(2)非首次假阳性。
往往出现一次假阳性后，随着短期内实验次数的增加，假阳性发生的概率也会随之加大，这是由于在首次出现假阳性后，实验操作台、仪器设备和试剂耗材均有可能被污染，空气中也可能存在目的片段气溶胶颗粒。
2.预防措施假阳性一旦出现则很难消除，做好预防工作是十分必要的，具体做好以下3点。
(1)规范实验操作。
县级防疫站要加强对实验操作人员的理论培训和实操培训，使其增强意识和提升操作能力，尽可能地减少污染发生。
动物疫病荧光定量PCR检测假阳性的分析与控制
荧光定量PCR自20世纪90年代问世以来， 以其灵敏性好、特异性强和检测速度快的显著优 势，不仅在分子生物学的各个领域得到了广泛应 用，而且作为一种诊断手段应用于临床％目前，荧 光定量PCR已成为必不可少的病原体检测手段， 对于动物疫病的防控具有重要意义％随着国家对 疫病防控的重视，尤其自2018年发生非洲猪瘟以 来，荧光定量PCR已经在国内的省地级动物疫病 控制中心、第三方检测实验室、大型养殖场、屠宰 场等普及应用％在实际的检测工作中，如何控制 好荧光PCR检测的质量，减少假阳性概率，一直是 检测人员普遍关注的问题％笔者就目前动物疫病 检测工作中荧光定量PCR假阳性问题产生的原因 进行分析，并提出相应的控制方法，以期为相关技 术人员提供参考％
会导致假阳性现象*1+%
作者简介：杨忠苹（1981 —），女，硕士，兽医师，从事动物疫病诊断试剂的研究工作％ E-mail： zhongping_yang@126. com
・55・
•经验交流！
《上海畜牧兽医通讯》2021年第3期
2动物疫病检测中荧光定量PCR假阳性的 控制
2.1加强相关人员的技术培训和管理 采样和检测人员应具备兽医或相近专业的专
业发布的标准方法，自制的方法须经过方法验证和
确认后方可使用；所采用的检测标准均为受控管
理％检测人员必须按照所检样品相应的现行有效 的标准进行检测％加样操作时，应遵循从低浓度到 高浓度的顺序，最后加阳性对照；同时设立阴性对 照、阳性对照和空白对照，以便发生假阳性时排查 原因％
2.6加强实验室环境管理 2.6.1 实验室功能分区严格
假阳性的原因与预防措施*+中国动物检疫，2020, 37 (2)： 4963. [4] 海岩，王文瑞，李昕，等.应用实时荧光PCR方法检测 HFMD临床样本时出现问题的分析[J].中国卫生检验 杂志，2013, 23 (13)： 28422843,2846. [5] 刘贺.荧光RT-PCR准确性的影响因素及控制策略[J]. 中国动物检疫，2013, 30(11)： 26-2& [6] 刘贺.兽医实验室RT-PCR的质量控制[J].动物医学进 展，2013, 34(10)： 115-117. [7] 毛源，王晶，汪钦.临床基因扩增实验室的质量控制 [J].检验医学与临床，2012, 9(23)： 30313032. [8] 南文龙，张悦勇，陈义平.PCR假阳性的原因分析及控制 措施[J].中国动物检疫，2015, 32 (8)： 566&
关于菌落平板假阳性
1.转化在对应抗性平板上得来的阳性菌可能会出现假阳性，再进一步做菌落pcr扩增目
的片段上的任意一个基因，如果能够扩出来，则说明重组的片段极大可能在载体上，但不能确定构建好的载体是否发生了突变，也不能确定扩出来的片段的模板一定就是来自菌内的，可能是取菌时菌旁边残留的未转入的目的片段，因此，最终确定还需要测序鉴定。
在对应抗性平板上长起来的假阳性菌落可能是：质粒载体进去了，另外还可能是回收的目的片段引入的杂质质粒
2.重组转化第二天平板出现类似杂菌的小菌落可能的原因有：
●抗生素失效
●重组产物中带的
●重组序列本身原因导致部分菌落长得较慢，不一定是杂菌。
PCR扩增常见问题及特点
PCR 扩增常见问题及特点PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。
假阴性，不出现扩增条带。
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR 循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul。
或100 ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20 ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
PCR技术在传染病诊断中的优势和挑战
PCR技术在传染病诊断中的优势和挑战近年来，PCR（聚合酶链式反应）技术在传染病诊断中得到广泛应用，其独特的优势和同时面临的挑战不可忽视。
本文将从PCR技术的基本原理、在传染病诊断中的优势以及当前面临的挑战等方面进行探讨。
首先，我们来了解一下PCR技术的基本原理。
PCR技术是一种体外扩增DNA的方法，通过在离体条件下，模拟DNA的自然复制过程来扩增目标DNA片段。
PCR技术主要包括以下三个关键步骤：变性、引物结合和DNA链合成。
变性步骤将DNA两条链分离，引物结合步骤利用特异性引物选择性地定位目标DNA，而DNA链合成则通过DNA聚合酶在引物的引导下进行。
通过循环这三个步骤，可以在短时间内倍增目标DNA，从而快速检测和定量分析。
PCR技术在传染病诊断中具有多方面的优势。
首先，PCR技术的敏感性极高，可以检测到低至单个基因拷贝的目标DNA，对于低剂量感染或病原体携带者的检测非常有效。
其次，PCR技术的特异性也非常高，通过特异性引物的设计，可以选择性地扩增目标DNA，避免了其他非靶DNA的干扰。
此外，PCR技术的快速性和高效性使其成为临床快速诊断的理想选择，检测结果可以在短短数小时内获得，大大缩短了传染病的诊断时间。
此外，PCR技术还可用于病原体的基因分型以及药物抗性基因的检测，为临床治疗提供重要参考。
然而，PCR技术在传染病诊断中也面临一些挑战。
首先，PCR技术对样本质量要求较高，因为即使微量的DNA污染也可能导致假阳性结果。
同时，病原体的变异性也可能影响PCR的特异性和灵敏性。
例如，病毒的突变可能导致引物与目标序列不完全匹配，从而降低PCR的扩增效率。
此外，PCR 技术在样本处理和分离过程中可能出现的交叉污染也需要严格控制，以避免结果的错误解读和判定。
另一个挑战是PCR技术在实时监测和定量分析中的应用。
传统的PCR技术只能判断目标DNA是否存在，而无法提供定量分析的结果。
然而，实时定量PCR（qPCR）技术的出现弥补了这一缺陷，可以根据扩增曲线的阈值周期数来推断目标DNA的初始浓度。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
PCR检测常见问题与解决途径利用PCR方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。
尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。
为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。
一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。
本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。
一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
（二）造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。
4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
5. 实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题比较常见。
（三）假阳性问题的试验控制在每次PCR检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。
阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明DNA提取（RNA提取、RNA反转录）、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。
在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。
只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果成立。
造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。
试验对照包括：1、DNA阳性对照：以含有目的片段的DNA(或质粒）作为模板进行扩增，证明PCR试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段。
（注意：阳性样品扩增效率高，应严格控制，避免其成为潜在的污染源）。
2、DNA阴性对照：以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。
3、空白对照：以纯水作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。
4、PCR抑制物对照：在与阳性对照相同的反应体系中，加入相同数量的待测样品DNA，如果未扩增出目的片段，证明此待测样品DNA中存在PCR抑制物。
5、空白提取对照：空白提取对照扩增结果为阳性，说明DNA提取试剂可能受到污染。
6、阳性提取对照：阳性提取对照扩增结果为阴性，说明提取过程可能有误。
如果DNA阳性对照扩增结果为阴性，或者DNA阴性对照和空白对照扩增结果为阳性，则说明PCR试剂或扩增过程存在问题。
（四）假阳性解决途径由于PCR 的敏感性和效率特别高，所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性。
尤其是PCR扩增产物和质粒分子很容易造成实验室的污染，导致假阳性现象发生。
1、规范实验室设计实验室设置上分配液区、DNA提取区、扩增区、电泳区。
物流应按分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区顺序，严禁倒流。
在连续而独立的空间中完成不同实验步骤。
不同工作区域相互隔离，通过传递仓传递。
PCR前处理区（样品制备室、DNA提取室）和PCR准备室设置正压通风系统，并设置通风柜或生物反应柜造成局部负压；后PCR室（PCR室及电泳室为高度污染区）设置负压通风系统，防止大量游离分子及气溶胶，对其它区域造成环境污染。
配制PCR反应体系（配备冰箱及生物安全柜，此实验室要求无模板DNA存在）和向PCR反应体系中加入模板DNA（配备生物安全柜及冰箱）要求在不同区域进行。
2、规范试剂耗材管理1）验证：新购买的试剂需进行实验前验证；2）分装：双蒸水、引物和dNTP均应分装储存，并标明日期，以防污染；试剂的分装应在装有紫外灯的超净工作台上进行；试剂分装成小份一次使用后弃去。
3）消毒：除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
必要时，在加样本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
3、规范实验室操作1）控制污染源：PCR产物和质粒操作空间是最大的污染源，应严格防止将这个空间的物品带出；2）一次性用具：使用实验服和一次性手套，使用带有滤膜的移液器枪头，一次性反应管和离心管；3）定期消毒：定期对实验室进行紫外照射，用10%漂白剂、3％双氧水或专用商业产品清理实验室台面及死角。
4）定期通风：对实验室定期进行正压、负压通风处理；5）小心操作：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；加样时，最后加阳性对照。
4、技术处理1）在DNA 模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物以破坏污染的PCR 产物。
一般选用波长254nm 照射30min （Nature ，1990 ，34:27 ）；2）PCR 实验中使用dUTP ，而不用dTTP 。
在扩增前使用UraciI N 一g1ycosylase （尿嘧啶糖基化酶）处理可降解交叉污染的PCR 产物，而不降解基困组DNA 模板，然后热灭活此酶，再进行扩增反应（Gene，1990，93：125）。
美国PE 公司提供此类试剂盒；3）在PCR 反应前加入一种光化学试剂，反应完成后激活该试剂，光化学试剂可交联DNA 链，使之不能再扩增（Nucleic Acids Res，1991，19 ：99）。
二、假阴性（一）假阴性现象与判断方法如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。
但这里应注意，许多国产PCR试剂盒中阳性对照采用质粒DNA，和标本相比来说，不需纯化提取核酸的步骤，因此，如果在标本核酸纯化提取步骤有问题，即使阳性对照均呈阳性，标本检测中还可能有假阴性。
设置内标准基因对照是判断假阴性较好的指示系统。
在每一反应管中同时对内标准基因对照进行扩增，若内标准基因对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能有问题。
（二）造成假阴性的原因1．仪器因素PCR实验对仪器的依赖性是很高的，离心机、扩增仪都是造成PCR假阴性的因素。
扩增仪的主要问题是孔间差，引起扩增失败或扩增效率降低。
而离心机的影响则更容易被忽视。
国内使用离心机很少使用离心加速度（XXXg）作为参数指标，而常使用转数作为参数指标，这里就存在着一个问题，由于离心机的大小不同，有效跳心半径也不相同，因此同样的转速所产生的离心力相差很大(有的在数倍以上)，所以在相同的离心时间下，有可能模板并没有离心下来，造成PCR假阴性。
这个问题在其他实验也有，但因其他实验都是测定大分子蛋白沉淀，对离心的速度要求较低所以不太明显。
建议使用小型台式离心机的实验要注意一下这个问题。
2．试剂质量问题PCR实验的成功与否试剂的质量至关重要，试剂的质量问题涉及多个方面：细胞的裂解；模板的抽提；引物位点的选择；Taq酶的活性等等。
其中任一环节出了问题都会引起结果的假阴性。
这些都是试剂质量的问题，因此选用高质量的PCR试剂非常重要。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq 酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
3．核酸模板问题1）模板中含有杂蛋白质；2）模板中含有Taq 酶抑制剂；3）模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；4）在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；5）模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
4、物理原因：PCR仪控温不准，也是PCR 失败的原因之一。
有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪内的变性、退火和延伸温度。
5、靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR 扩增是不会成功的。
6．操作人员素质问题PCR实验的环节很多，而且对每一环节的质量要求都很高，例如少加、漏加试剂、离心不充分、循环参数设计错误等等都能造成结果的假阴性。
（三）假阴性问题的试验控制在每次PCR检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。
阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明DNA提取（RNA提取、RNA反转录）、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。
在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。
造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。
试验对照包括：1、DNA阳性对照：以含有目的片段的DNA(或质粒）作为模板进行扩增，证明PCR试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段。
（注意：阳性样品扩增效率高，应严格控制，避免其成为潜在的污染源）。
2、DNA阴性对照：以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。
3、空白对照：以纯水作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。
4、PCR抑制物对照：在与阳性对照相同的反应体系中，加入相同数量的待测样品DNA，如果未扩增出目的片段，证明此待测样品DNA中存在PCR抑制物。
5、空白提取对照：空白提取对照扩增结果为阳性，说明DNA提取试剂可能受到污染。
6、阳性提取对照：阳性提取对照扩增结果为阴性，说明提取过程可能有误。