miRNAs对白内障患者晶状体上皮细胞中氧化损伤的生物学效应及其机制
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［关键词 】 年龄相关性 白内障；ｍｉＲＮＡ；ＴＰ５３ＩＮＰ１；ｐ５３ 【中图分类号］ Ｒ７６６．１ ［文献标识码 ］ Ａ 【文章编 号］ １００５－９２０２（２０１８）０８·１９６１４１３；ｄｏｉｉ１０．ａ９６９／ｊ．ｉｓｍ．１００５－９２０２．２０１８．０８．０６９
白内障的发生机制与年龄 、氧化作用 、外伤等多种 因素有关 ，其中年龄相关性 白内障发病机制包括氧化 应 激 、细 胞 凋 亡 、钙 蛋 白酶 激 活 等 。 相 关 研 究 发 现 ， ｍｉＲＮＡ在人晶状体上皮 细胞 （ＬＥＣｓ）的凋亡过程 中发 挥 不 同程 度 的调 控作 用 ，如 ｍｉＲ一１２５通 过 抑 制 靶 基 因 ｐ５３的表 达 来 抑 制 ＬＥＣｓ的凋 亡¨Ｊ。ｍｉＲ－２０ 表 达 于 ＬＥＣｓ中 ，通 过 Ｍｅｉｓ－２调 控 ＰＡＸ６的转 录 ，影 响 晶 状 体 分化 Ｊ。 目前 关 于 ｍｉＲ－２０ 在年 龄相 关性 白内障发 病 过程中与氧化损伤 的关系及作 用机制的研究鲜有报 道 ，我们通过前期实验 ，用生物信息学 预测分析软件 ＲＡＳＭＯＬ、ＩＣＭＬｉｔｅ、ＣｒｙｓｔＩｎｆｏ共 同预 测 了 ＴＰ５３ＩＮＰ１是 ｍｉＲ－２０ 的靶 基 因之 一 ，同时使 用 Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ双荧 光 素酶报告基因验证 了该结果 。本研究拟探讨 ｍｉＲ一２００ 对年龄相关性 白内障氧化损伤的抑制作用及机制 。
薹 ｍｉＲＮＡｓ对 白内障患者 晶状体上皮细胞 中氧化损伤的生物学效应及其机制 第 ８期
ｍｉＲＮＡｓ对 白 内障 患者 晶状 体 上皮 细 胞 中氧 化损 伤 的生物 学 效应 及其 机 制
邹 莹 （白城 医学高等专科学校 ，吉林 白城 １３７－２０ 对年龄 相关性 白内障患者晶状体上皮细胞 （ＬＥＣｓ）中氧化损 伤的生物学效 应及其机制 。方法 选取 ３Ｏ例皮质性年龄相关性 白内障患者的晶状体前囊 膜和 ３０例正 常供体 眼球 晶状体前囊 ，采 用实时荧 光定量 ＰＣＲ检测其 中 ｍｉＲ－２０４的相对表达量 。对 ＬＥＣｓ系 ＨＬＥ—Ｂ３进行培养 ，在对 数期 细胞 培养液中加入终浓度 ２００ ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ的过氧化氢建立 ＬＥＣｓ氧化 损伤模 型 ，之后分为模型对照组 、ｍｉＲ－２０ 拟似物组 、ｍｉＲ－２０４拮抗物组 、拟似 物对 照组 、拮抗物对 照组 ，分别 向细胞培养 液 中加入相 应转染剂 ，未用过氧化氢处理 的 ＬＥＣｓ为正常对照组 。采用 实时荧光定量 ＰＣＲ检测 各组 ＬＥＣｓ中 ｍｉＲ－２０ 的表达量 以验证 转染率 ； 流式细胞仪测定 各组 细胞 凋亡率 ；实 时荧光定 量 ＰＣＲ和 Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹法检测 ＬＥＣｓ中 ＴＰ５３ＩＮＰ１ ｍＲＮＡ和 ｐ５３ ｍＲＮＡ和蛋 白的表达 量 。结果 ｍｉＲ－２０ ｍＲＮＡ在年龄相关性 白内障患者 晶状体组织 中的表达量 明显低于正 常人 （Ｐ＜０．０５）。细胞转染后 各组间 ｍｉＲ－ ２００ ｍＲＮＡ表达量差异均显著 （Ｐ＜０．０５），其 中 ｍｉＲ－２０ 拟似物组明显高于拟似物对照组 ，ｍｉＲ－２０４拮抗 物组 明显低 于拮抗 物对照组 （Ｐ＜０．０１）。模 型对 照组 细胞凋亡率 明显高 于正 常对 照组 ，ｍｉＲ－２０ 拟似物组 明显低 于拟似物对照组 ，ｍｉＲ－２０４拮抗物组明显 高于拮 抗物对照组 （Ｐ＜０．０５），但拟 似物对照组和拮抗物对照组之 间差异无统计学意义 （Ｐ＞０．０５）。模型对照组 ＴＰ５３ＩＮＰ１和 ｐ５３ ｍＲＮＡ及 蛋 白的表达量 明显高于正 常对 照组 ；ｍｉＲ－２０ 拟似 物组 明显 低于拟似物对照组 ，ｍｉＲ－２０ 拮抗物组 明显高 于拮抗物对 照组 （Ｐ＜０．０１， Ｐ＜０．０５）。结论 ｍｉＲ一２０ 可通过 下调 ＴＰ５３ＩＮＰ１基 因在 ＬＥＣｓ中的表达来抑制 ＬＥＣｓ凋亡 ，发挥抗年龄相关性 白内障患者氧化损伤 的作用 ，该作用通过 影响 ＴＰ５３ＩＮＰ１一ｐ５３通 路实现。
第 一作 者 ：邹 莹（１９８１－），女 ，硕士 ，主治 医师 ，讲师 ，主要从 事 眼科 学 临 床 教 学 研 究 。
博耀生物科技有限公司）；ＨＲＰ标记的羊抗兔二抗 （上 海 科兴 生化试 剂 有 限公 司 ）；ＥＣＬ发 光试 剂 盒 、ＲＮＡ提 取 试 剂 盒 、ｅＤＮＡ 合 成 试 剂 盒 、细 胞 凋 亡 检 测 试 剂 盒 （上 海静 融生 物科 技有 限公 司 ）。 １．２ 方 法 １．２．１ 实时荧光定量 ＰＣＲ检测 将收集到 的标本放 于裂 解 液 中裂 解 ，使用 ＲＮＡ提 取试 剂盒 获取囊 膜 中 的 总 ＲＮＡ，用 分 光 光 度法 检 测 提 取 ＲＮＡ 的 纯 度 。收 集 １ ｌ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）和 ７ 总 ＲＮＡ，按 Ｍ－ＭＬＶ步 骤逆转 录 得到 ｅＤＮＡ。加 入 Ｍｉｘ ４．０ ｌ、ｍｉＲ－２０ ０．３ ｌ、ＧＡＰＤＨ ０．３ ｌ、上下游引物各 ０．３ １。去 ＲＮＡ酶水 ４．４ ｌ和 ｅＤＮＡ １．０ １建立 反应 体 系。 常规 扩增 条 件 ，共 ４０个 循环 ，计算 目的基 因的相 对表 达量 。 １．２．２ 细胞 培养 及转染 ＨＬＥ—Ｂ３细胞 复苏 后加入 含 １０％胎 牛 血 清 的 ＤＭＥＭ 培 养 基 ，放 于 ３７ｏＣ，５％ ＣＯ２
１ 材 料 与 方 法
１．１ 材料与试剂 ２０１５年 １０月至 ２０１６年 ３月在本 院行 白内障手术 的 ３０例皮质性年龄相关性 白内障患 者的晶状体前囊膜标本 ；取同期本 院眼库收集的 ３Ｏ例 正常供体眼球晶状体前囊膜标本 。本次研究经本院伦 理 委员 会 批 准 ，患 者 均 自愿 参 与 并 签 署 知 情 同 意 书 。 主要试剂 ：ＨＬＥ．Ｂ３ ＬＥＣｓ（广州吉赛生 物科技有 限公 司）；ＤＭＥＭ细胞培养基 、胎 牛血清 （上海 哈灵 生物科 技 有 限公 司 ）；兔 抗 人 ＴＰ５３ＩＮＰ１一 抗 、ｐ５３～ 抗 （上海
白内障的发生机制与年龄 、氧化作用 、外伤等多种 因素有关 ，其中年龄相关性 白内障发病机制包括氧化 应 激 、细 胞 凋 亡 、钙 蛋 白酶 激 活 等 。 相 关 研 究 发 现 ， ｍｉＲＮＡ在人晶状体上皮 细胞 （ＬＥＣｓ）的凋亡过程 中发 挥 不 同程 度 的调 控作 用 ，如 ｍｉＲ一１２５通 过 抑 制 靶 基 因 ｐ５３的表 达 来 抑 制 ＬＥＣｓ的凋 亡¨Ｊ。ｍｉＲ－２０ 表 达 于 ＬＥＣｓ中 ，通 过 Ｍｅｉｓ－２调 控 ＰＡＸ６的转 录 ，影 响 晶 状 体 分化 Ｊ。 目前 关 于 ｍｉＲ－２０ 在年 龄相 关性 白内障发 病 过程中与氧化损伤 的关系及作 用机制的研究鲜有报 道 ，我们通过前期实验 ，用生物信息学 预测分析软件 ＲＡＳＭＯＬ、ＩＣＭＬｉｔｅ、ＣｒｙｓｔＩｎｆｏ共 同预 测 了 ＴＰ５３ＩＮＰ１是 ｍｉＲ－２０ 的靶 基 因之 一 ，同时使 用 Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ双荧 光 素酶报告基因验证 了该结果 。本研究拟探讨 ｍｉＲ一２００ 对年龄相关性 白内障氧化损伤的抑制作用及机制 。
薹 ｍｉＲＮＡｓ对 白内障患者 晶状体上皮细胞 中氧化损伤的生物学效应及其机制 第 ８期
ｍｉＲＮＡｓ对 白 内障 患者 晶状 体 上皮 细 胞 中氧 化损 伤 的生物 学 效应 及其 机 制
邹 莹 （白城 医学高等专科学校 ，吉林 白城 １３７－２０ 对年龄 相关性 白内障患者晶状体上皮细胞 （ＬＥＣｓ）中氧化损 伤的生物学效 应及其机制 。方法 选取 ３Ｏ例皮质性年龄相关性 白内障患者的晶状体前囊 膜和 ３０例正 常供体 眼球 晶状体前囊 ，采 用实时荧 光定量 ＰＣＲ检测其 中 ｍｉＲ－２０４的相对表达量 。对 ＬＥＣｓ系 ＨＬＥ—Ｂ３进行培养 ，在对 数期 细胞 培养液中加入终浓度 ２００ ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ的过氧化氢建立 ＬＥＣｓ氧化 损伤模 型 ，之后分为模型对照组 、ｍｉＲ－２０ 拟似物组 、ｍｉＲ－２０４拮抗物组 、拟似 物对 照组 、拮抗物对 照组 ，分别 向细胞培养 液 中加入相 应转染剂 ，未用过氧化氢处理 的 ＬＥＣｓ为正常对照组 。采用 实时荧光定量 ＰＣＲ检测 各组 ＬＥＣｓ中 ｍｉＲ－２０ 的表达量 以验证 转染率 ； 流式细胞仪测定 各组 细胞 凋亡率 ；实 时荧光定 量 ＰＣＲ和 Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹法检测 ＬＥＣｓ中 ＴＰ５３ＩＮＰ１ ｍＲＮＡ和 ｐ５３ ｍＲＮＡ和蛋 白的表达 量 。结果 ｍｉＲ－２０ ｍＲＮＡ在年龄相关性 白内障患者 晶状体组织 中的表达量 明显低于正 常人 （Ｐ＜０．０５）。细胞转染后 各组间 ｍｉＲ－ ２００ ｍＲＮＡ表达量差异均显著 （Ｐ＜０．０５），其 中 ｍｉＲ－２０ 拟似物组明显高于拟似物对照组 ，ｍｉＲ－２０４拮抗 物组 明显低 于拮抗 物对照组 （Ｐ＜０．０１）。模 型对 照组 细胞凋亡率 明显高 于正 常对 照组 ，ｍｉＲ－２０ 拟似物组 明显低 于拟似物对照组 ，ｍｉＲ－２０４拮抗物组明显 高于拮 抗物对照组 （Ｐ＜０．０５），但拟 似物对照组和拮抗物对照组之 间差异无统计学意义 （Ｐ＞０．０５）。模型对照组 ＴＰ５３ＩＮＰ１和 ｐ５３ ｍＲＮＡ及 蛋 白的表达量 明显高于正 常对 照组 ；ｍｉＲ－２０ 拟似 物组 明显 低于拟似物对照组 ，ｍｉＲ－２０ 拮抗物组 明显高 于拮抗物对 照组 （Ｐ＜０．０１， Ｐ＜０．０５）。结论 ｍｉＲ一２０ 可通过 下调 ＴＰ５３ＩＮＰ１基 因在 ＬＥＣｓ中的表达来抑制 ＬＥＣｓ凋亡 ，发挥抗年龄相关性 白内障患者氧化损伤 的作用 ，该作用通过 影响 ＴＰ５３ＩＮＰ１一ｐ５３通 路实现。
第 一作 者 ：邹 莹（１９８１－），女 ，硕士 ，主治 医师 ，讲师 ，主要从 事 眼科 学 临 床 教 学 研 究 。
博耀生物科技有限公司）；ＨＲＰ标记的羊抗兔二抗 （上 海 科兴 生化试 剂 有 限公 司 ）；ＥＣＬ发 光试 剂 盒 、ＲＮＡ提 取 试 剂 盒 、ｅＤＮＡ 合 成 试 剂 盒 、细 胞 凋 亡 检 测 试 剂 盒 （上 海静 融生 物科 技有 限公 司 ）。 １．２ 方 法 １．２．１ 实时荧光定量 ＰＣＲ检测 将收集到 的标本放 于裂 解 液 中裂 解 ，使用 ＲＮＡ提 取试 剂盒 获取囊 膜 中 的 总 ＲＮＡ，用 分 光 光 度法 检 测 提 取 ＲＮＡ 的 纯 度 。收 集 １ ｌ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）和 ７ 总 ＲＮＡ，按 Ｍ－ＭＬＶ步 骤逆转 录 得到 ｅＤＮＡ。加 入 Ｍｉｘ ４．０ ｌ、ｍｉＲ－２０ ０．３ ｌ、ＧＡＰＤＨ ０．３ ｌ、上下游引物各 ０．３ １。去 ＲＮＡ酶水 ４．４ ｌ和 ｅＤＮＡ １．０ １建立 反应 体 系。 常规 扩增 条 件 ，共 ４０个 循环 ，计算 目的基 因的相 对表 达量 。 １．２．２ 细胞 培养 及转染 ＨＬＥ—Ｂ３细胞 复苏 后加入 含 １０％胎 牛 血 清 的 ＤＭＥＭ 培 养 基 ，放 于 ３７ｏＣ，５％ ＣＯ２
１ 材 料 与 方 法
１．１ 材料与试剂 ２０１５年 １０月至 ２０１６年 ３月在本 院行 白内障手术 的 ３０例皮质性年龄相关性 白内障患 者的晶状体前囊膜标本 ；取同期本 院眼库收集的 ３Ｏ例 正常供体眼球晶状体前囊膜标本 。本次研究经本院伦 理 委员 会 批 准 ，患 者 均 自愿 参 与 并 签 署 知 情 同 意 书 。 主要试剂 ：ＨＬＥ．Ｂ３ ＬＥＣｓ（广州吉赛生 物科技有 限公 司）；ＤＭＥＭ细胞培养基 、胎 牛血清 （上海 哈灵 生物科 技 有 限公 司 ）；兔 抗 人 ＴＰ５３ＩＮＰ１一 抗 、ｐ５３～ 抗 （上海