甘薯爪哇黑腐病的病原鉴定

甘薯爪哇黑腐病的病原鉴定

摘要

甘薯爪哇黑腐病是甘薯贮藏期的一种真菌性病害，是全球热带和亚热带地区甘薯贮藏期的重要病害之一。2013年我们从广东湛江采集的甘薯中，发现病薯薯块由两端向中间变黑变硬，切开发病薯块，在伤口处会逐渐长出黑色或灰色的菌丝。发病薯块室内放置30 d后表面龟裂，裂口处有大量的黑色粉末溢出，显微镜下观察发现大量褐色有隔膜孢子。经对病原菌进行分离，采用柯赫氏法则回接验证，依据病原菌的形态特征和rDNAITS及βtubulin基因序列，确定该病害为甘薯爪哇黑腐病，病原菌为可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）。致病性测定发现该病具有较强致病性，对于贮藏期甘薯具有较大威胁。这是国内首次对该病进行的报道。

关键词

甘薯；爪哇黑腐病；可可毛色二孢；分子鉴定

我国是世界上最大的甘薯生产国，年均种植面积460万hm2左右，年均总产量占世界总产量的75%左右[1]。但由于甘薯的体积大、水分多、表皮薄易破损、擦伤，而使得其安全贮藏成为我国甘薯生产的重要环节。影响甘薯安全贮藏的因素主要是贮藏环境以及贮藏期病害，其中又以贮藏期病害对甘薯的威胁最大。

甘薯爪哇黑腐病（Java black rot）是由可可毛色二孢[Lasiodiplodia theobromae （Pat.）Griffon & Maubl.]引起的一种贮藏期真菌病害[2]，于1896年在美国首次发现并报道，是美国南部地区甘薯贮藏期最具破坏性的病害之一，也是全球热带和亚热带地区甘薯贮藏期的重要病害之一[3]。该病原菌寄主范围广泛，可以侵染58科的138种植物并导致很多作物

发生贮藏期腐烂病[3]。我国目前为止鲜有对甘薯爪哇黑腐病的研究报道。由于其致病菌可可毛色二孢具有寄主范围广，分布广的特点，目前已经在我国的多种作物上有报道，例如花生茎腐病、沙田柚果腐病、香蕉黑腐病、芒果蒂腐病等[47]。

2013年6月从广东湛江采集的甘薯薯块中发现大量病薯，其症状与甘薯爪哇黑腐病症状极为相似，通过对疑似病原菌进行分离纯化、形态观察、致病性测定以及基因序列分析，最终确定其病原种类，进而为该病的防控及其深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试品种：甘薯样本于2013年6月采自广东湛江；用于回接鉴定的品种为‘烟薯25’；用于致病性测定的品种为：‘冀薯68’、‘烟薯25’、‘商薯19’、‘冀薯98’、‘冀紫薯1号’、‘冀薯4号’、‘徐薯25’。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L 和琼脂20 g/L。LB培养液：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L和NaCl 10 g/L。LB固体培养基含琼脂20 g/L。所有培养基经121℃，湿热灭菌15～20 min后使用。

试剂：Fungal gDNA Kit购自美国Biomiga公司；2×Es T aq MasterMix、DM2000 plus marker、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；pMD18T载体、T4连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司；感受态大肠杆菌DH5α为本实验室自制；EB、氨苄青霉素购自生工生物工程（上海）股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

仪器：梯度PCR仪，美国ABI公司；DYY6C型电泳仪，北京六一仪器厂；凝胶成像仪，伯乐公司；光照培养箱，宁波江南仪器厂；振荡培养箱，上海智诚分析仪器制造有限公司；尼康Eclipse 80i显微镜，尼康映像仪器销售（中国）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离纯化

切取发病薯块的病健交界处组织，75%乙醇消毒1 min，无菌水冲洗3遍后移入10%次氯酸钠消毒2 min，然后再用无菌水冲洗3次，最后用灭菌滤纸吸干组织表面水分。消毒后的组织移入PDA培养基上（含50 mg/L链霉素），在25℃，光周期L∥D=14 h∥10 h下培养3 d。将初次培养获得的各菌株分别接种到新鲜PDA培养基上同样条件下继续培养至新生菌丝长出，以此为第一代，通过在显微镜下挑取单条新生菌丝的方法连续继代培养3代后获得纯化的病原菌。

1.2.2 柯赫氏法则验证

选取健康、表面无破损的‘烟薯25’薯块，用70%乙醇表面消毒，无菌水冲洗3次后用于回接试验。在薯块靠近两端处分别打取5 mm孔，用于接种受测菌株和空白对照（PDA琼脂块），具体方法为：从分离获得的各菌株平板上打取5 mm菌盘，将菌盘菌丝面朝下置于薯块一端的一个接种点处，另一个接种点以同样的方法接种PDA琼脂块，每个菌株接种3个薯块。将接种好的薯块置于湿润无菌沙土中于25℃、光周期L∥D=14 h∥10 h下保湿培养，分别于3、6、10和15 d时调查发病情况，再次分离致病菌，并进行形态和分子鉴定。

1.2.3 病原菌形态鉴定

将直径为5 mm的菌盘接种到PDA平板中央，置于25℃，光周期L∥D=14 h∥10 h下培养，观察其菌落的培养特征；从发病薯块切取一小块干腐变黑的组织，置于无菌水中捣碎，吸取上层液体于尼康80i显微镜下观察孢子的形态，并利用显微镜附带软件NISElements F 3.2对孢子进行拍照并测量其大小。

1.2.4 病原菌的分子鉴定

利用Fungal gDNA Kit提取病原菌的基因组DNA。用两对通用引物ITS1/ITS4

（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′/5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）和Bt2a/ Bt2b （5′GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC3′/5′ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC3′）分别对病原菌的rDNAITS以及βtubulin基因进行扩增，PCR体系为：2×Es T aq MasterMix 10 μL，正反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板1 μL，加ddH2O至20 μL。反应程序为：94℃，3 min；94℃ 30 s，55℃/58℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃充分延伸10 min。PCR 产物在浓度为1%的琼脂糖凝胶中电泳，EB染色，用凝胶成像系统观察、拍照，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带。将回收纯化后的PCR产物与pMD18T载体4℃过夜连接，连接产物用热激法转化感受态大肠杆菌DH5α，并于含氨苄青霉素（50 mg/L）的LB固体培养基上培养12～14 h，筛选阳性克隆。挑取单菌落于4 mL含氨苄青霉素（50 mg/L）的LB液体培养基进行扩大培养，将获得的菌液利用质粒小提试剂盒提取质粒后进行PCR验证。最后将经PCR验证的阳性克隆（至少3个）送至上海生工进行测序。利用DNAStar软件包的SeqMan进行序列拼接比对。所得序列提交NCBI数据库进行BLAST 比对分析。采用MEGA 5.2软件包中的neighborjoining（NJ）聚类分析法对所测定的序列进行聚类分析。

1.2.5 致病性测定

在PDA培养基上接种已纯化菌株，25℃，光周期L∥D=14 h∥10 h下培养5 d用于致病性测定。7个受试甘薯品种为：‘冀薯68’、‘烟薯25’、‘冀薯98’、‘商薯19’、‘徐薯25’、‘冀薯4号’以及‘冀紫薯1号’。每个品种选取3个薯块作为试验组接种致病菌，1块作为对照组接种PDA琼脂块，方法：将所有薯块经70%乙醇表面消毒，无菌水冲洗3次后，每个薯块分别设置针刺与不处理两个接种点，两接种点均接种5 mm菌盘（对照组接种5 mm PDA琼脂块），菌丝面朝下置于接种点上。接种好的薯块置于湿润无菌沙土上25℃，