生物技术制药(3)
《生物制药技术》实验指导-实验三、四
《生物制药技术》实验指导实验三四环素、金霉素的薄层层析鉴定（验证型）实验目的：掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法。
实验原理：层析（色谱，chromatograpby）是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中（根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种），使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。
用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。
将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatography），在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物（硅胶、纤维素和淀粉等）作为固定相的称为薄层层析（thin layer chromatography），或者用滤纸作为固定相的纸上层析。
层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。
但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。
此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。
分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。
一般是水相和有机溶剂相。
常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。
被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。
一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。
当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。
分配系数大的移动快（阻力小）。
生物技术制药课后习题答案
第一章绪论1生物技术是以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。
2生物技术的主要内容：P1基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程蛋白质工程：运用基因工程全套技术改变蛋白质结构的技术。
染色体工程：探索基因在染色体上的定位，异源基因导入、染色体结构改变。
生化工程：生物反应器及产品的分离、提纯技术。
3生物技术制药采用现代生物技术人为创造条件，借助微生物、植物或动物来生产所需的医药品过程被称为4生物技术药物采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物才能被称为5生物药物生物技术药物与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为PPT复习题第二章基因工程制药1、简述基因工程制药的基本程序。
P162、说明基因工程技术用于制药的三个重要意义。
P15第一段第一行3、采用哪两种方法来确定目的cDNA克隆？P18（7目的基因cDNA的分离和鉴定）①核酸探针杂交法用层析法或高分辨率电泳技术(蛋白质双向电泳技术或质谱技术)分离出确定为药物的蛋白质，氨基酸测序，按照密码子对应原则合成出单链寡聚核苷酸，用做探针，与cDNA文库中的每一个克隆杂交。
这个方法的关键是分离目的蛋白，②免疫反应鉴定法（酶联免疫吸附检测）4、说明用大肠杆菌做宿主生产基因工程药物必须克服的6个困难。
①原核基因表达产物多为胞内产物，必须破胞分离，受胞内其它蛋白的干扰，纯化困难；②原核基因表达产物在细胞内多为不溶性(包含体, inclusion body)，必须经过变性、复性处理以恢复药物蛋白的生物学活性，工艺复杂；③没有翻译后的加工机制，如糖基化，应用上受到限制；④产物的第一个氨基酸必然是甲酰甲硫氨酸，因无加工机制，常造成N-Met冗余，做为药物，容易引起免疫反应；⑤细菌的内毒素不容易清除；⑥细菌的蛋白酶常常把外源基因的表达产物消化；5、用蓝藻做宿主生产基因工程药物有什么优越性？蓝藻：很有前途的药物基因的宿主细胞①有内源质粒，美国Wolk实验室已构建1200种人工质粒，可用做基因载体。
(完整版)生物技术制药习题答案(夏焕章版)
第一章绪论填空题1. 生物技术制药的特征高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。
2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是治疗药物、预防药物、诊断药物。
3.现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；二是基因药物；三是来自动物植物和微生物的天然生物药物；四是合成与部分合成的生物药物；4.生物技术的发展按其技术特征来看，可分为三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。
5.生物技术所含的主要技术范畴有基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程；选择题1.生物技术的核心和关键是（A ）A 细胞工程B 蛋白质工程C 酶工程D 基因工程2. 第三代生物技术（ A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围A 基因工程技术B 蛋白质工程技术C 海洋生物技术D细胞工程技术3.下列哪个产品不是用生物技术生产的（D ）A 青霉素B 淀粉酶C 乙醇D 氯化钠4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制药的特征A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B高技术、高投入、低风险、高收益、长周期C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作A10% B5% C 1% D 7%名词解释1.生物技术制药采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医学药品，称为生物技术制药。
2.生物技术药物一般说来，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸来药物称为生物技术药物。
3.生物药物生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为生物生物药物。
简答题1.生物技术药物的特性是什么？生物技术药物的特征是：（1）分子结构复杂（2）具有种属差异特异性（3）治疗针对性强、疗效高（4）稳定性差（5）免疫原性（6）基因稳定性（7）体内半衰期短（8）受体效应（9）多效应和网络效应（10）检验特殊性2.简述生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品？（1）传统生物技术的技术特征是酿造技术，所得产品的结构较为简单，属于微生物的初级代谢产物。
生物技术制药试题及答案(三)
生物技术制药试题(单选题) 1: 1A: AB: BC: CD: D正确答案:(单选题) 2: 进行动物细胞培养时，最好选用的培养材料是( )A: 衰老退化的动物组织细胞B: 成熟动物个体的体细胞C: 动物的受精卵细胞D: 健康动物、胚胎或幼龄动物个体的体细胞正确答案:(单选题) 3: 1A: AB: BC: CD: D正确答案:(单选题) 4: 在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得该基因的最佳方法是（）。
A: 用mRNA为模板逆转录合成DNAB: 以4种脱氧核苷酸为原料人工合成C: 将供体DNA片段转入受体细胞中，再进一步筛选D: 由蛋白质的氨基酸序列推测mRNA正确答案:(单选题) 5: 关于基因治疗的叙述，不正确的是（）A: 基因治疗可以有效地改善患者的生理状况，其操作对象是基因B: 进行基因治疗时，基因的受体细胞是受精卵C: 基因治疗并不是对患者体内细胞的缺陷基因进行改造D: 基因治疗时可只对患者部分细胞输入正常基因正确答案:(单选题) 6: 1A: AB: BC: CD: D正确答案:(单选题) 7: 1A: AB: BC: CD: D正确答案:(单选题) 8: 人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成。
通过转基因技术，可以获得人的糖蛋白的受体细胞是( )A: 大肠杆菌B: 酵母菌C: 噬菌体D: 肺炎球菌正确答案:(单选题) 9: 对致病基因的异常碱基进行纠正，保留正常部分的技术方法是（）A: 基因矫正B: 基因替代C: 基因置换D: 反义核酸技术E: 基因敲除正确答案:(单选题) 10: 1A: AB: BC: CD: D正确答案:(单选题) 11: 基因工程中，切割目的基因和载体所用的限制酶及切口必备的特点是（）。
A: 可用不同的限制性内切酶，露出的黏性末端必须相同B: 必须用相同的限制性内切酶，露出的黏性末端可不相同C: 必须用相同的限制性内切酶，露出的黏性末端必须相同D: 可用不同的限制性内切酶，露出不同的黏性末端正确答案:(单选题) 12: 下列关于基因表达载体的构建，叙述不正确的是( )A: 目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传和表达发挥作用B: 一个基因表达载体的组成含有目的基因、标记基因、启动子、终止子等C: 终止子位于mRNA的尾端，使转录在所需要的地方停止下来D: 由于不同的受体细胞及目的基因导入的方法不同，基因表达载体的构建也有所差别正确答案:(单选题) 13: 下列有关“基因探针”的叙述，不正确的是( )A: 基因探针的工作原理是碱基互补配对B: 待测的DNA分子首先要解旋变为单链，才可用基因探针测序C: 待测的DNA分子可以直接用基因探针测序D: 基因探针技术可用于疾病诊断和环境监测正确答案:(单选题) 14: 1A: AB: BC: CD: D正确答案:(单选题) 15: 在基因治疗时，目前哪一种细胞不能作为靶细胞（）A: 淋巴细胞B: 肿瘤细胞C: 生殖细胞D: 肝细胞E: 造血细胞正确答案:(多选题) 1: 基因失活的技术包括（）A: 反义RNAB: 核酶C: RNA干扰D: 抗体正确答案:(多选题) 2: 控制潜在RNA酶活性的因素有（）。
生物技术制药试题(打印版)
生物技术制药试题1. 生物技术制药:生物技术制药是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法进行药物制造的技术。
2. 基因表达:基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子.生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。
3. 质粒的分裂不稳定:通常将质粒不稳定性分为两类:一类是结构不稳定性,也就是质粒由于碱基突变、缺失、插入等引起的遗传信息变化;另一类是分离不稳定性,指在细胞分裂过程中质粒不能分配到子代细胞中,从而使部分子代细胞不带质粒(即P-细胞)。
在连续和分批培养过程中均能观察到此两类现象发生。
一般情况下具有质粒的细胞(即P＋细胞)需要合成较多的DNA、RNA和蛋白质,因此其比生长速率低于P-细胞,从而P-细胞一旦形成能较快速地生长繁殖并占据培养物中的大多数。
4. 补料分批培养:发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。
它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。
因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。
但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。
5. 人-鼠嵌合抗体:嵌合抗体（ chimeric atibody ）是最早制备成功的基因工程抗体。
它是由鼠源性抗体的 V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。
因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。
6. 悬浮培养:非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。
生物技术制药模拟题答案最终版
一、名词解释生物技术药物:生物技术药物是指采用DNA重组技术或其他创新生物技术生产的治疗药物。
透析培养:透析培养是对微生物培养用透析膜包裹，并使外部有新鲜培养液流动着的一种培养方法。
单克隆抗体:单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。
次级代谢产物:次级代谢产物是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。
固定化酶:用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。
生物药物:生物药物是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法，利用生物体、生物组织、细胞、体液等制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。
生物药物，包括生物技术药物和原生物制药。
血液成分制品:系指单用物理方法自全血中分离制备的成分，包括红细胞、白细胞、血小板和血浆。
组织工程:应用生命科学和工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物正常及病理两种状态下组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护和促进人体各种组织或器官损伤后功能和形态生物替代物的学科。
抗体酶:20世纪80年代以来出现的一种具有催化活性的蛋白质，是利用生物学和化学的成果在分子水平上交叉渗透研究的产物；其本质上是免疫球蛋白，只是在其易变区被赋予了酶的属性，因此抗体酶又称为催化抗体。
二、选择题1. 世界上采用基因工程生产的第一个传染性疫苗是（ A ）A 乙肝疫苗B 霍乱疫苗C 甲肝疫苗D 艾滋病疫苗2. 单克隆抗体杂交瘤细胞与抗体性状鉴定的主要方法是（ A ）A 染色体分析 B凝胶电泳 C 免疫荧光技术 D 层析3．下列不属于影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素是：（ D ）A 外源基因的拷贝数B 外源基因的表达效率C 表达产物的稳定性D 宿主细胞的容量4. cDNA法获得目的基因的优点是（ B ）A 成功率高B 不含内含子C 操作简便D 表达产物可以分泌5. 菌体生长所需能量（ A ）菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸。
生物技术制药(第三版,夏焕章)复习重点
1.绪论1.1首次代表性药物——第一个动物疫苗药（美—基因工程药—DNA重组技术生产—1982欧洲被批用）：重组人胰岛素1.2（名词解释1）生物技术药物：采用DNA重组技术/其他生物新技术研制的蛋白质/核酸药物。
（包括——细胞因子、重组蛋白质药物、抗体、疫苗、寡苷酸药物…….）生物技术制药：以生物体、组织、细胞等为原料，利用物理、化学、生物化学、生物技术、微生物学、药学等科学的原理和方法进行药物制造的技术。
生物技术制药特性/特点：高技术、高投入、长周期、高风险、高收益2.基因工程制药2.1基因工程技术的优点：①大量生产，为临床使用建立有效的保障。
②提供足够数量的生理活性物质③挖掘更多内源生理活性物质④获得新型化合物，扩大药物筛选来源2.2什么叫基因工程药（技术）？将目的基因插入载体、拼接、转入新宿主细胞，构建工程菌/细胞，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
基因工程：将外源基因经体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。
2.3工作流程上游——（实验室）——分离目的基因，构建工程菌/细胞下游——（实验室产品产业化）——（大规模培养）产品分离纯化，质量控制等2.4目的基因获得——反转录法（制取真核生物目的基因常用方法）①mRNA纯化——得到目的基因的mRNA特点：真核细胞中mRNA的3’端常含有一多聚腺苷酸polyA②cDNA第一链合成模板：蛋白质真核细胞的mRNA；反转录酶作用下，合成互补的DNA③cDNA第二链合成模板：cDNA（只反映基因表达转录及加工后产物携带信息—只与基因编码序列相关，不含内含子）反转录酶/DNA聚合酶1/Klenow酶大片段作用下，最终合成双链DNA序列得蛋白质多肽的DNA序列④cDNA克隆载体：质粒DNA/噬菌体DNA连接方法：加同聚尾；加人工接头⑤重组体导入宿主细胞⑥cDNA文库鉴定——表型筛选⑦目的cDNA克隆的分离与鉴定方法：核酸探针杂交法；免疫反应鉴定法2.5基因表达①常用宿主菌细胞及优缺点（目前最常用——大肠杆菌、酿酒酵母）1）原核细胞（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉素-可糖基化）P222）真核细胞（酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞）优点：可糖基化缺点：合成复杂②宿主菌的要求1）具有高浓度、高产量、高产率2）能利用廉价原料而得3）不致病、不产生内毒素4）发热量低、需氧低，适当发酵温度和细胞形态（培养条件温和）5）易代谢调控、易进行重组DNA技术6）产物易提取纯化③影响基因在大肠杆菌中表达的因素：1）表达质粒的拷贝数和稳定性（一定范围内，表达和拷贝数成正比；载体越小，稳定性越好）2）外源基因的表达效率3）表达产物的稳定性4）细胞代谢负荷5）工程菌的培养条件2.6（名词解释2）基因工程的不稳定性：传代过程中出现的质粒不稳定现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定，（稳定性至少维持25代），分裂不稳定指工程菌分裂时出现一定比例的不含质粒的子代菌现象（整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸）；结构不稳定指DNA从质粒上丢失/碱基重排、缺失所致工程菌性能改变（导致其表观生物学功能丧失）。
生物技术制药课后习题
1.生物技术制药分为哪些类型生物技术制药分为四大类：（1）应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂。
（2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等（3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物（4）合成与部分合成的生物药物2．生物技术制药具有什么特征（1）分子结构复杂（2）具有种属特异性（3）治疗针对性强，疗效高（4）稳定性差（5）基因稳定性（6）免疫原性（7）体内的半衰期短（8）受体效应（9）多效性（10）检验的特殊性3.生物技术制药中有哪些应用应用主要有：（1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物（2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产物（3）酶工程制药（4）发酵工程制药4.基因工程药物制造的主要程序有哪些基因工程药物制造的主要步骤有：目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验5.影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些（1）外源基因的计量（2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱 b、核糖体的结合位点 c、SD序列和起始密码的间距 d、密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件6.质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。
质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。
提高质粒稳定性的方法如下：（1）选择合适的宿主细菌（2）选择合适的载体（3）选择压力（4）分阶段控制培养（5）控制培养条件（6）固定化7.影响基因工程菌发酵的因素有哪些如何控制发酵的各种参数影响因素：（1）培养基（2）接种量（3）温度（4）溶解氧（5）诱导时机的影响（6）诱导表达程序（7）P H值8.什么是高密度发酵影响高密度发酵的因素有哪些可采取哪些方法来实现高密度发酵高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L影响因素：（1）培养基（2）溶氧浓度（3）PH (4)温度（5）代谢副产物实现高密度发酵的方法：（1）改进发酵条件：a、培养基 b、建立流加式培养基 c、提高供养能力（2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻断乙酸产生的主要途径 b、对碳代谢流进行分流 c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流 d、引入血红蛋白基因（3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌9.分离纯化常用的色谱分离方法有哪些它们的原理是什么方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱。
生物技术制药课后习题答案
第一章绪论1生物技术是以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。
2生物技术的主要内容：P1基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程蛋白质工程：运用基因工程全套技术改变蛋白质结构的技术。
染色体工程：探索基因在染色体上的定位，异源基因导入、染色体结构改变。
生化工程：生物反应器及产品的分离、提纯技术。
3生物技术制药采用现代生物技术人为创造条件，借助微生物、植物或动物来生产所需的医药品过程被称为4生物技术药物采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物才能被称为5生物药物生物技术药物与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为PPT复习题第二章基因工程制药1、简述基因工程制药的基本程序。
P162、说明基因工程技术用于制药的三个重要意义。
P15第一段第一行3、采用哪两种方法来确定目的cDNA克隆？P18（7目的基因c DN A的分离和鉴定）①核酸探针杂交法用层析法或高分辨率电泳技术(蛋白质双向电泳技术或质谱技术)分离出确定为药物的蛋白质，氨基酸测序，按照密码子对应原则合成出单链寡聚核苷酸，用做探针，与cDNA文库中的每一个克隆杂交。
这个方法的关键是分离目的蛋白，②免疫反应鉴定法（酶联免疫吸附检测）4、说明用大肠杆菌做宿主生产基因工程药物必须克服的6个困难。
①原核基因表达产物多为胞内产物，必须破胞分离，受胞内其它蛋白的干扰，纯化困难；②原核基因表达产物在细胞内多为不溶性(包含体, inclusi on body)，必须经过变性、复性处理以恢复药物蛋白的生物学活性，工艺复杂；③没有翻译后的加工机制，如糖基化，应用上受到限制；④产物的第一个氨基酸必然是甲酰甲硫氨酸，因无加工机制，常造成N-Met冗余，做为药物，容易引起免疫反应；⑤细菌的内毒素不容易清除；⑥细菌的蛋白酶常常把外源基因的表达产物消化；5、用蓝藻做宿主生产基因工程药物有什么优越性？蓝藻：很有前途的药物基因的宿主细胞①有内源质粒，美国Wolk实验室已构建1200种人工质粒，可用做基因载体。
生物制药复习题（有答案）
生物制药复习题（有答案）《生物技术制药》习题（课后作业）一、下列概念：⑴生物制药：⑵生物药物：包括生物技术药物，天然生化药物，微生物药物，海洋药物和生物制品。
(3)生物技术制药：采用现代生物技术,借助某些微生物、植物、动物生产医药品。
(4)生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。
（5）现代生物技术：以现代生命科学为基础, 把生物体系与工程学技术有机结合在一起，按照预先的设计，定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料, 产生对人类有用的新产品(或达到某种目的)之综合性科学技术。
（6）基因表达：⒈转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA为模板合成mRNA的过程。
2、翻译：以mRNA为模板,tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程（7）质粒的分裂不稳定：基因工程菌分裂时产生一定比例不含质粒的子代菌的现象,即重组分子从受体细胞中逃逸。
（8）质粒的结构不稳定：DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
重组DNA分子某一区域发生变异，导致表观生物学功能的丧失；（9）显微注射：显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。
经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。
（10）悬浮细胞：（11）补料分批培养：是指分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。
（12）连续培养行下去的一种培养方法。
（13）接触抑制：细胞在生长分裂时达到相互接触而停止分裂的现象,称为接触性抑制（14）单克隆抗体：由一个抗原决定簇刺激的、单一的B细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、高度均一的抗体。
（15）多克隆抗体：一种抗原具有多个抗原决定簇,每个抗原决定簇都能刺激一个B细胞产生一种抗体。
这样所获得的免疫血清是多种抗体的混和物。
（完整版）生物技术制药课后习题..
（完整版）生物技术制药课后习题..生物技术制药课后习题by ×× Yuan1、生物技术制药分为哪些类型？生物技术制药分为四大类：（1）应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂。
（2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等（3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物（4）合成与部分合成的生物药物2、生物技术制药具有什么特征？（1）分子结构复杂（2）具有种属特异性（3）治疗针对性强，疗效高（4）稳定性差（5）基因稳定性（6）免疫原性（7）体内的半衰期短（8）受体效应（9）多效性（10）检验的特殊性3、生物技术制药中有哪些应用？应用主要有：（1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物（2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产物（3）酶工程制药（4）发酵工程制药4、基因工程药物制造的主要程序有哪些？基因工程药物制造的主要步骤有：目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验5、影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？（1）外源基因的计量（2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱b、核糖体的结合位点c、SD序列和起始密码的间距d、密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件6、质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。
质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。
提高质粒稳定性的方法如下：（1）选择合适的宿主细菌（2）选择合适的载体（3）选择压力（4）分阶段控制培养（5）控制培养条件（6）固定化7、影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数？影响因素：（1）培养基（2）接种量（3）温度（4）溶解氧（5）诱导时机的影响（6）诱导表达程序（7） PH值8、什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L影响因素：（1）培养基（2）溶氧浓度（3）PH（4）温度（5）代谢副产物实现高密度发酵的方法：（1）改进发酵条件：a、培养基 b、建立流加式培养基 c、提高供养能力（2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻断乙酸产生的主要途径 b、对碳代谢流进行分流 c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流d、引入血红蛋白基因（3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌9、分离纯化常用的色谱分离方法有哪些?它们的原理是什么?方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱。
生物技术制药第第三章动物细胞制药优秀课件
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第一节 概述
一、动物细胞培养的历史 二、细胞工程学 三、动物细胞制药发展历史
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动物细胞工程制药
两大内容：
在无菌和人工控制的条件下培养动物细胞以获得多肽和 蛋白质药物；
按照预定的设计，根据细胞生物学及工程学原理，采用
遗传操作技术定向改造动物细胞及动物细胞的遗传性状，
Vacanti Mouse：人耳鼠
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三、动物细胞制药的发展历史
1949年，Enders及其同事用哺乳动物原代细胞生产灭活脊髓灰质炎病 毒疫苗，开创了先河。
1986年用淋巴母细胞Namalwa生产干扰素批准用于临床。此后，Vero 细胞生产狂苗和脊髓灰质炎疫苗大量应用。
Cellular engineering includes tissue engineering and bioprocess engineering. Tissue engineering involves the use of living cells in the development of
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动物细胞体外培养历史上的里程碑
20世纪50年代，各种培养操作技术、培养器皿和培养基孕育而生。 Earle首创单个细胞克隆培养方法，建立了可无限传代的C3H小鼠结缔 组织细胞系。
1951年，Gay建立了第一个上皮型细胞系——人宫颈癌Hela细胞系。 1957年，Dulbecco采用胰酶消化处理组织块，用液体培养的方法获得
1897年 Loeb从血液和结缔组织中分离细胞可在血清和血浆中存活 1903年 Jolly观察到蝾螈细胞在体外可进行分裂 1907年 Harrison无菌条件下培养了离体的蛙胚神经组织，观察到神经
第3章生物技术制药
gt10载体
cDNA插入到gt10中可使噬菌体阻遏物基因（cI） 失活。 当用大肠杆菌c600的突变型hflA（高频溶原性） 作为宿主时，只有携带cDNA插入片段的噬菌体 可形成噬菌斑； 而在非突变型大肠杆菌c600宿主菌中，带与不带 cDNA插入片段的噬菌体都可形成噬菌斑。
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一、工程菌（或细胞）构建中重要的工具
1.工具酶：限制性内切酶和连接酶 2.基因：对目的基因DNA进行序列分析。 3.表达系统： 原核生物和真核生物两类表达系统； 选择基因表达的系统主要考虑的是保证表 达蛋白质的功能， 其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化 的难易。
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2、cDNA第一链的合成
① 一般mRNA都带有3‘-polyA，所以 可用寡聚dT作为引物，在逆转录酶 的催化下，开始cDNA链的合成。 一次好的逆转录反应可使寡聚dT选 出的mRNA有5%~30%被拷贝。
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3、cDNA第二链的合成
② 碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNAmRNA杂交链中的mRNA链； ③ 以cDNA第一链为模板合成第二链。由于 第一链cDNA链3‘末端往往形成一个发 夹形结构，所以，可以从这一点开始合 成cDNA第二链。此反应是在DNA聚合酶 I催化下完成的。 ④ 核酸酶S1专一性切除单链DNA（发夹结 构），变性琼脂糖凝胶电泳检测双链 cDNA分子的大小。
化学合成法的基本战略
全基因合成
大片段酶促法：
根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
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生物技术制药(第三版)练习题
生物技术制药（第三版，夏焕章）题目1. 下列培养方式（）适用于生物制药大规模细胞培养。
A. 悬滴培养B. 灌注室培养C. 培养瓶培养D. 生物反应器E. 培养板培养正确答案：D2. 生物技术的核心是（）A.酶工程B.细胞工程C..基因工程D.发酵工程E.蛋白质工程正确答案：C3. 第一个被FDA批准上市的基因工程药物是什么？A. 乙肝疫苗B. 赫赛汀C. 重组人胰岛素D. 重组人干扰素正确答案：C4. 基因工程菌的稳定性至少要维持在（）代以上A. 20B. 30C. 40D. 25正确答案：D5. 下列哪个产品不是用生物技术生产的A. 青霉素B. 淀粉酶C. 乙醇D. 氯化钠正确答案：D6. 与动物细胞和微生物细胞相比，植物细胞具有A. 细胞壁、线粒体和质体B. 细胞壁、液泡和质体C. 细胞壁、线粒体和中心体D. 细胞壁、内质网和质体正确答案：B（中心体动物细胞特有：溶酶体）7. 下面哪种不是植物组织培养的表面的消毒剂A. 青霉素B. 氯化汞C. 次氯酸钙D. 次氯酸钠正确答案：A植物培养细胞重量增加——主要取决于对数期；次级代谢产物累积——主要在稳定期；常用灭菌剂：次氯酸钙5~30min、次氯酸钠、氯化汞；过氧化氢、溴水、硝酸银、抗生素8. 国内首个新冠疫苗属于（）A. 灭活疫苗B. 减毒活疫苗C. 联合疫苗D. 亚单位疫苗E. 基因工程疫苗正确答案：A9. 凝胶过滤法是依赖（）来分离蛋白组分。
A. 分子大小B. 带电状态C. 解离状态D. 分子质量正确答案：A10. 动物细胞培养的最适PH为A.6.5-6.8B.7.0-7.2C.6.8-7.0D. 7.2-7.4正确答案：D大多数微生物生长的PH值范围：3~611. 用反转录法获得目的基因，首先必须获得A. tRNAB. cDNAC. rRNAD. mRNA正确答案：D12. 那一类细菌不属于原核细胞( )A. 大肠杆菌B. 枯草芽孢杆菌C. 酵母D. 链霉菌正确答案：C13. 影响植物次级代谢产物产生和累积的主要因素有哪些？A. 物理条件：温度、光（光照时间、光强、光质）、通气（氧气）、酸度和渗透压B. 化学条件：无机盐、碳源、物质生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质和前体等；C. 生物条件：外植体、季节、休眠、分化等D. 工业培养条件：培养罐类型、通气、搅拌和培养方式。
生物技术制药
生物技术制药：是指利用生物系统或通过生物反应过程生产药物的技术。
名解生物药物：是指以生物资源为原料或以生物技术为手段开发生产的用作疾病的预防、诊断和治疗的医药品。
名解1）基因工程：又称DNA重组技术（DNA recombination technology），是指按人的意志，将某一生物体（供体）的遗传信息（目的基因）在体外经人工与载体DNA重组，构成重组DNA，然后转入到另一生物体（受体）细胞中，使被引入的外源DNA片段（目的基因）在受体细胞内得以表达和遗传。
名解2）限制酶：限制性核酸内切酶，是一类专一性很强的核酸内切酶，专一地识别和作用于DNA分子上特定的核苷酸序列，切断DNA双链。
名解3）连接酶：能将两段DNA拼接起来的酶叫DNA连接酶。
这类酶的发现和分离纯化，使两个DNA片段在体外连接形成重组DNA分子成为可能。
名解5）限制酶星活性：在标准条件下，每种限制酶都有严格的识别序列。
在非标准条件下，会导致限制酶识别序列的特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称限制酶的第2活性或星活性。
名解6）基因载体：在细胞内具有能进行自我复制的独立DNA分子作为外源DNA片段的运载体，简称基因载体，又称分子克隆载体或无性繁殖载体。
名解3、限制酶有哪些特性？（1）不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列（核苷酸序列不同，序列大小不同）。
（2）各种限制酶的识别序列都具有回文结构。
（3）各种限制酶的切割类型是各式各样的，切后形成各种粘性或平整末端。
①一种是限制酶错位切断DNA双链而形成彼此互补的单链末端，称粘性末端。
②另一种是限制酶在同一位点平齐切断DNA两条链而形成的双链末端，称为平整末端。
（4）在标准条件下，每种限制酶都有严格的识别序列。
在非标准条件下，会导致限制酶识别序列的特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称限制酶的第2活性或星活性。
5、基因载体有哪些特性？6、如何将天然的原始载体改造成理想的基因载体？5、6连①要有复制子（Replicom）功能，且复制起始区中没有限制酶的酶切位点。
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二、动物细胞的培养基的种类和组成
⒈ 天然培养基 ⒉ 合成培养基 ⒊ 无血清培养基
⒈天然培养基
血清、羊水、腹水等,成分复杂、成分不稳 定
⒉合成培养基
DME、MEM、DMEM、HAM F12、 RPMI1640、ISOCOV、199、McCoy 5A
• 从生产实际分为: 悬浮培养 贴壁培养 贴壁-悬浮培养
⒈ 悬浮培养 • 让细胞自由的悬浮于培养基内生长繁殖。 ⒉ 贴壁培养 • 让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方
法。 ⒊ 贴壁-悬浮培养
⒊ 贴壁-悬浮培养 ⑴ 微载体培养 ⑵ 包埋和微囊培养 ⑶ 结团培养
1、悬浮培养 • 适合非贴壁依赖细胞、兼性贴壁细胞 • 操作简便、培养条件均一、传质和传氧较好、
• RⅢ小鼠乳腺肿瘤细胞，适合带有牛乳头 瘤病毒载体的转染后细胞形态发生显著 变化。
• 生产重组人生长激素。
10、COS细胞
• 用复制起点缺失SV40的基因组DNA转化 非洲绿猴肾细胞CV-1获得三个细胞系： COS-1、COS-3、COS-7
• 广泛应用于瞬时表达系统。
11、MDCK
• 来源于成年雌性西班牙长耳狗的肾脏； • 贴壁型上皮细胞； • 支持多种病毒增殖； • 生产兽用疫苗。
• 细胞代数为细胞分裂次数 • 传代数表示细胞培养分种传代次数 • 细胞代数=传代数×分种数 / 2
X=(logN-logN0)÷log2 X：代数 N：培养最终细胞数 N0：培养起始细胞数 • 倍增时间=培养经过时间÷代数
第二节 动物细胞的形态和生理特点
2、细胞生长需贴附于基质，有接触抑制现象 • 电荷、钙、镁、贴附因子（胶原、纤维结合
动物细胞制药
第一节 概述
细胞学说 组织培养或细胞培养
细胞工程
细胞工程（Cell engineering or cytotechnology）
• 以细胞为单位，应用细胞生物学、分子生物 学等理论与技术，按人们的意愿有目的地进 行设计和操作，改变细胞的某些遗传特性， 达到改良或产生新品种的目的，或使细胞增 加/重新获得产生特定产物的能力，在离体条 件下进行大量培养、增殖，提取目的产品。
一、动物细胞的培养条件
1、器材的清洗和消毒
• 浸泡、刷洗、泡酸、冲洗
组 分 强酸 次强酸
重铬酸钾/g 63
120
硫酸/ml
1000 200
水/ml
200 1000
弱酸 100 100
1000
• 器材的消毒灭菌：物理、化学、抗生素 2、水质 3、pH：7.2-7.4,缓冲系统 4、渗透压:290-300mOsm/kg，
电穿孔法：
• 借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜 出现瞬时可逆性小孔，外源DNA沿小孔进 入细胞。转化率较高，拷贝数低。
五、细胞库的建立
• 生产用的工程细胞必须建立两个细胞 库： ⒈ 原始细胞库 ⒉ 生产用细胞库
原始细胞
• 库贮存时须有该细胞的详细挡案， 包括： ①该细胞系的历史 ②该细胞系的特性 ③对各种有害因子的检查结果
1、细胞的分裂周期长 • 细胞分裂时间为12～48h， • 细胞的分裂周期=间期+分裂期 • 间期（G1+S+G2） • 分裂期（M）
• G1期：4～6h，合成DNA聚合酶及RNA合成 • S期：6～8h，DNA合成 • G2期：2～5h，DNA量加倍, RNA合成 • M期：0.5～1h，染色体分裂
牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、 杆状病毒 （二）质粒载体：穿梭质粒载体
• 牛痘病毒：用构建多价疫苗 • 腺病毒、逆转录病毒：用于基因治疗。 • 杆状病毒：用于外源基因表达。
杆状病毒作为载体的优点：
①双链DNA，易重组 ②插入7～8kb DNA不影响正常病毒粒子的
形成。 ③多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，
BME培养基+ 10%小牛血清，pH=7.2，同功 酶B型G-6-PD，倍增时间24h，有限寿命50代， 安全，用于制备疫苗。
2、MRC-5
• 从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。 核型2n=46 ，属成纤维细胞，42-46代，较 WI-38增殖快，对环境敏感性较WI-38低， 对病毒敏感，用于制备疫苗。
5、Vero： • 从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。为贴壁依
赖的成纤维细胞，核型2n=60； • 199+5%胎牛血清，增殖病毒（包括多瘤病毒、
脊髓灰质炎、狂犬病毒 ）
6、Namalwa
• 从肯尼亚患有淋巴瘤病人获取，建成的人 的类淋巴母细胞。2.8%的高倍体率，12～ 14条标记染色体。单条X，无Y。培养基为 RPMI 1640 +7%胎牛血清。用于生产α干扰 素。
动物细胞生产药物
• 优点：分泌胞外、纯化方便、翻译 后修饰糖基化，与天然产品一致。 • 缺点：培养条件高、成本贵、产量低。
第三节 生产用动物细胞的要求与获得
一、生产用动物细胞的要求 原代细胞 二倍体细胞系 转化细胞系
二、生产用动物细胞的获得
1、原代细胞 • 是直接取自动物组织器官经过粉碎消化而
生产用细胞库
• 从原始细胞库来的，或从单一安瓿来， 或从多个安瓿来即刻混合，经培养扩增 再分装储存形成细胞库。
• 需建挡案，进行无菌性无细胞交叉污染 的检查。
• 需确定最高使用的传代数。
第四节 动物细胞的培养条件与培养基
细胞体外培养基本条件: ①无菌 ②营养充足，防止有害物质 ③氧气 ④随时清除代谢有害物质 ⑤良好的生存外环境 ⑥及时分种
第一节 概述
• 基因工程/基因重组 • 细胞融合 • 细胞移植 • 染色体改造 • 转基因 • 细胞培养 • 产物的提取纯化等技术
第二节 动物细胞的形态和生理特点
一、动物细胞的形态 适应功能,形态各异
• 离体培养细胞分三类： 贴壁细胞 悬浮细胞 兼性贴壁细胞
第二节 动物细胞的形态和生理特点
1、贴壁细胞 • 生长须有贴附的支持物表面，自身分泌
获得的细胞悬液（109/g）。 • 需要大量动物，费钱费劳力。 • 鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、
淋巴细胞。
2、二倍体细胞系
• 原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞 成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一 定特征的细胞株。
二倍体细胞有正常细胞的特点
①染色体组型是 2n 核型； ②贴壁依赖接触抑制； ③可传代培养50代； ④无致瘤性。
或培养基中提供的贴附因子才能在该表 面上生长。 • 两种形态：
成纤维细胞型 上皮细胞型
第二节 动物细胞的形态和生理特点
2、悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬 浮状态生长。如淋巴细胞。 3、兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢 细胞，小鼠L929细胞。
二、动物细胞的生理特点
力、微量元素等。
5、动物细胞对培养基要求高 • 必需氨基酸、维生素、无机盐、
微量元素、葡萄糖、细胞生 长因子、贴壁因子等。
6、动物细胞蛋白质的合成途径和修饰 功能与细菌不同
• 动物细胞蛋白质的合成部位： 游离核糖体 粗面内质网的核糖体
• 游离核糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。
• 粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分泌的 和膜中的整合蛋白，多为糖蛋白。
因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能 形成有感染力病毒粒子；
④多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生 的蛋白质可占全 部蛋白质的20%～30%；
⑤用光学显微镜可看到多角体，可以此作为 标记物，选阳性克隆。
⑥如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源 基因。
质粒载体
• 在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增。都 含有如下基本成分：
无血清培养基加入添加剂
⑴ 生长因子和激素 ⑵ 结合蛋白 ⑶ 贴附因子和伸展因子 ⑷ 有利细胞生长的因子和元素
第五节 动物细胞培养方法和操作方式
一、动物细胞大规模培养的方法 • 依细胞种类:
原代培养、传代培养 • 依培养基:
液体培养、固体培养
• 依培养器和方式: 静止培养、旋转培养、 搅拌培养、微载体培养、 中空纤维培养、 固定床或流化床培养
四、基因工程细胞构建和筛选
• 在生产中采用更多的更有前景的是融合细 胞及采用基因工程构建的各种工程细胞。
• 被用构建工程细胞的动物细胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、Namalwa、Vero、 SP2/0、 Sf-9 等细胞。
1、真核细胞基因表达载体的构建
• 使用的载体有两类： （一）病毒载体
合成培养基组成成分
⑴ 氨基酸 ⑵ 维生素 ⑶ 糖类 ⑷ 无机盐 ⑸ 其它成分
添加小牛血清：5%-10%
（1）提供生长因子和激素 （2）提供贴附因子和伸展因子 （3）提供结合蛋白 （4）提供必需脂肪酸和微量元素 （5）提供合适的pH缓冲系统
⒊ 无血清培养基
①提高重复性 ②减少微生物污染 ③供应充足、稳定 ④产品易纯化 ⑤避免血清因素对细胞的毒性 ⑥减少血清中蛋白对生物测定的干扰
7、SP2/0-Ag14
• 通过融合的方法从有羊抗红细胞活性的 BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系 P3X63Ag8融合杂交瘤SP2/NL-Ag亚克隆中分 离获得，能耐受8氮鸟嘌呤 20μg/ml 但在含 HAT 选择培养基中不能存活。
• 通常用培杂交瘤细胞和抗体。
①允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。 ②含有使基因表达的调控元件。 ③能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。 ④有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。
2、基因载体的导入和高效表达 工程细胞株的筛选
• 基因载体导动物细胞常用方法是： 磷酸钙沉淀法 电穿孔法
磷酸钙沉淀法：
• 溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙 沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成 DNA—磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触 时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。