生物技术制药(3)

8、Sf-9 • 1983年从亲代IPLB—SF21AE中克隆形成。亲代细
胞从秋粘虫的蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺 蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒高度敏感。
• 通常用的培养基为Grace培养基，添加3.3g/L 水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液, 10%胎牛血清。 用于高效表达外来蛋白制品。
9、C127
无血清培养基加入添加剂
⑴ 生长因子和激素 ⑵ 结合蛋白 ⑶ 贴附因子和伸展因子 ⑷ 有利细胞生长的因子和元素
第五节 动物细胞培养方法和操作方式
一、动物细胞大规模培养的方法 • 依细胞种类:
原代培养、传代培养 • 依培养基:
液体培养、固体培养
• 依培养器和方式: 静止培养、旋转培养、 搅拌培养、微载体培养、 中空纤维培养、 固定床或流化床培养
3、转化细胞系
• 通过某个转化过程形成的，常由于染色 体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点， 而获得无限增殖能力。
• 转化过程可以是自发的、人工的、从动 物肿瘤组织中建立。
4、融合细胞系
• 仙台病毒融合法 • 聚二乙醇融合法 • 电融合法
第三节 生产用动物细胞的要求与获得
三、常用生产用动物细胞特性 1、WI-38 • 核型2n=46，成纤维细胞，能产生胶原，
1mg/ml NaCl → 32mOsm/kg， 平衡盐溶液（BBS） 5、温度：37±0.50C 6、空气：＜30%
二、动物细胞的培养基的种类和组成
⒈ 天然培养基 ⒉ 合成培养基 ⒊ 无血清培养基
⒈天然培养基
血清、羊水、腹水等,成分复杂、成分不稳 定
⒉合成培养基
DME、MEM、DMEM、HAM F12、 RPMI1640、ISOCOV、199、McCoy 5A
电穿孔法：
• 借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜 出现瞬时可逆性小孔，外源DNA沿小孔进 入细胞。转化率较高，拷贝数低。
五、细胞库的建立
• 生产用的工程细胞必须建立两个细胞 库： ⒈ 原始细胞库 ⒉ 生产用细胞库
原始细胞
• 库贮存时须有该细胞的详细挡案， 包括： ①该细胞系的历史 ②该细胞系的特性 ③对各种有害因子的检查结果
动物细胞生产药物
• 优点：分泌胞外、纯化方便、翻译 后修饰糖基化，与天然产品一致。 • 缺点：培养条件高、成本贵、产量低。
第三节 生产用动物细胞的要求与获得
一、生产用动物细胞的要求 原代细胞 二倍体细胞系 转化细胞系
二、生产用动物细胞的获得
1、原代细胞 • 是直接取自动物组织器官经过粉碎消化而
3、贴壁-悬浮培养 （1）微载体培养 • 扩大贴附面积、保持悬浮状态 • 葡聚糖类、聚苯乙烯类、胶原类
理想微载体：
• 表面性质与细胞相容性好，适合附着、伸展、 增殖
• 材料无毒性 • 惰性材料，不与培养基反应、不吸收营养 • 比重1.030-1.045g/ml，搅拌悬浮、静止沉降 • 溶胀后粒径60-250μm，差异不大于20μm
动物细胞制药
第一节 概述
细胞学说 组织培养或细胞培养
细胞工程
细胞工程（Cell engineering or cytotechnology）
• 以细胞为单位，应用细胞生物学、分子生物 学等理论与技术，按人们的意愿有目的地进 行设计和操作，改变细胞的某些遗传特性， 达到改良或产生新品种的目的，或使细胞增 加/重新获得产生特定产物的能力，在离体条 件下进行大量培养、增殖，提取目的产品。
生产用细胞库
• 从原始细胞库来的，或从单一安瓿来， 或从多个安瓿来即刻混合，经培养扩增 再分装储存形成细胞库。
• 需建挡案，进行无菌性无细胞交叉污染 的检查。
• 需确定最高使用的传代数。
第四节 动物细胞的培养条件与培养基
细胞体外培养基本条件: ①无菌 ②营养充足，防止有害物质 ③氧气 ④随时清除代谢有害物质 ⑤良好的生存外环境 ⑥及时分种
3、CHO-K1
• 从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。 核型2n=20-22，上皮样细胞，培养基加 脯氨酸。用于构建缺乏FH2还原酶突变株， DMEM培养基+次黄嘌呤+胸苷+10%小牛 血清。
4、BHK-21
• 从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分 离的;成纤维样细胞,核型为2n=44;培养基为 DMEM + 7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多 瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫 苗，现已用于工程细胞构建。
BME培养基+ 10%小牛血清，pH=7.2，同功 酶B型G-6-PD，倍增时间24h，有限寿命50代， 安全，用于制备疫苗。
2、MRC-5
• 从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。 核型2n=46 ，属成纤维细胞，42-46代，较 WI-38增殖快，对环境敏感性较WI-38低， 对病毒敏感，用于制备疫苗。
易扩大培养规模 • 细胞体积小、难采用灌流培养、细胞密度低 • 通气搅拌罐式与气升式生物反应器
2、贴壁培养
• 适合贴壁细胞、兼性贴壁细胞 • 优/缺点与悬浮培养相反 • 在传代或扩大培养时需要酶将细胞从基质上
消化下来（胰酶、二乙烯四乙酸钠/EDTA、 胰酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA、胶原酶、链霉 蛋白酶、木瓜酶等）
合成培养基组成成分
⑴ 氨基酸 ⑵ 维生素 ⑶ 糖类 ⑷ 无机盐 ⑸ 其它成分
添加小牛血清：5%-10%
（1）提供生长因子和激素 （2）提供贴附因子和伸展因子 （3）提供结合蛋白 （4）提供必需脂肪酸和微量元素 （5）提供合适的pH缓冲系统
⒊ 无血清培养基
①提高重复性 ②减少微生物污染 ③供应充足、稳定 ④产品易纯化 ⑤避免血清因素对细胞的毒性 ⑥减少血清中蛋白对生物测定的干扰
1、细胞的分裂周期长 • 细胞分裂时间为12～48h， • 细胞的分裂周期=间期+分裂期 • 间期（G1+S+G2） • 分裂期（M）
• G1期：4～6h，合成DNA聚合酶及RNA合成 • S期：6～8h，DNA合成 • G2期：2～5h，DNA量加倍, RNA合成 • M期：0.5～1h，染色体分裂
• 细胞代数为细胞分裂次数 • 传代数表示细胞培养分种传代次数 • 细胞代数=传代数×分种数 / 2
X=(logN-logN0)÷log2 X：代数 N：培养最终细胞数 N0：培养起始细胞数 • 倍增时间=培养经过时间÷代数
第二节 动物细胞的形态和生理特点
2、细胞生长需贴附于基质，有接触抑制现象 • 电荷、钙、镁、贴附因子（胶原、纤维结合
7、SP2/0-Ag14
• 通过融合的方法从有羊抗红细胞活性的 BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系 P3X63Ag8融合杂交瘤SP2/NL-Ag亚克隆中分 离获得，能耐受8氮鸟嘌呤 20μg/ml 但在含 HAT 选择培养基中不能存活。
• 通常用培养基为DMEM+10%胎牛血清。用 于生产单抗杂交瘤细胞和抗体。
• RⅢ小鼠乳腺肿瘤细胞，适合带有牛乳头 瘤病毒载体的转染后细胞形态发生显著 变化。
• 生产重组人生长激素。
10、COS细胞
• 用复制起点缺失SV40的基因组DNA转化 非洲绿猴肾细胞CV-1获得三个细胞系： COS-1、COS-3、COS-7
• 广泛应用于瞬时表达系统。
11、MDCK
• 来源于成年雌性西班牙长耳狗的肾脏； • 贴壁型上皮细胞； • 支持多种病毒增殖； • 生产兽用疫苗。
或培养基中提供的贴附因子才能在该表 面上生长。 • 两种形态：
成纤维细胞型 上皮细胞型
第二节 动物细胞的形态和生理特点
2、悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬 浮状态生长。如淋巴细胞。 3、兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢 细胞，小鼠L929细胞。
二、动物细胞的生理特点
①允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。 ②含有使基因表达的调控元件。 ③能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。 ④有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。
2、基因载体的导入和高效表达 工程细胞株的筛选
• 基因载体导动物细胞常用方法是： 磷酸钙沉淀法 电穿孔法
磷酸钙沉淀法：
• 溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙 沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成 DNA—磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触 时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。
力、微量元素等。
5、动物细胞对培养基要求高 • 必需氨基酸、维生素、无机盐、
微量元素、葡萄糖、细胞生 长因子、贴壁因子等。
6、动物细胞蛋白质的合成途径和修饰 功能与细菌不同
• 动物细胞蛋白质的合成部位： 游离核糖体 粗面内质网的核糖体
• 游离核糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。
• 粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分泌的 和膜中的整合蛋白，多为糖蛋白。
四、基因工程细胞构建和筛选
• 在生产中采用更多的更有前景的是融合细 胞及采用基因工程构建的各种工程细胞。
• 被用构建工程细胞的动物细胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、Namalwa、Vero、 SP2/0、 Sf-9 等细胞。
1、真核细胞基因表达载体的构建
• 使用的载体有两类： （一）病毒载体
牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、 杆状病毒 （二）质粒载体：穿梭质粒载体
• 牛痘病毒：用构建多价疫苗 • 腺病毒、逆转录病毒：用于基因治疗。 • 杆状病毒：用于外源基因表达。
杆状病毒作为载体的优点：
①双链DNA，易重组 ②插入7～8kb DNA不影响正常病毒粒子的
形成。 ③多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，
蛋白等） • 接触抑制或密度依赖抑制 （转化异倍体后此现象消失）
第二节 动物细胞的形态和生理特点
3、正常二倍体细胞的生长寿命有限 • 原代培养 • 有限细胞系：种族、年龄 • 无限细胞系或连续细胞系：异倍体
第二节 动物细胞的形态和生理特点
4、动物细胞对周围环境十分敏感 • 理化因素如：渗透压、pH、离子浓度、剪切
第一节 概述
• 基因工程/基因重组 • 细胞融合 • 细胞移植 • 染色体改造 • 转基因 • 细胞培养 • 产物的提取纯化等技术
第二节 动物细胞的形态和生理Hale Waihona Puke Baidu点
一、动物细胞的形态 适应功能,形态各异
• 离体培养细胞分三类： 贴壁细胞 悬浮细胞 兼性贴壁细胞
第二节 动物细胞的形态和生理特点
1、贴壁细胞 • 生长须有贴附的支持物表面，自身分泌
5、Vero： • 从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。为贴壁依
赖的成纤维细胞，核型2n=60； • 199+5%胎牛血清，增殖病毒（包括多瘤病毒、
脊髓灰质炎、狂犬病毒 ）
6、Namalwa
• 从肯尼亚患有淋巴瘤病人获取，建成的人 的类淋巴母细胞。2.8%的高倍体率，12～ 14条标记染色体。单条X，无Y。培养基为 RPMI 1640 +7%胎牛血清。用于生产α干扰 素。
因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能 形成有感染力病毒粒子；
④多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生 的蛋白质可占全 部蛋白质的20%～30%；
⑤用光学显微镜可看到多角体，可以此作为 标记物，选阳性克隆。
⑥如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源 基因。
质粒载体
• 在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增。都 含有如下基本成分：
• 从生产实际分为: 悬浮培养 贴壁培养 贴壁-悬浮培养
⒈ 悬浮培养 • 让细胞自由的悬浮于培养基内生长繁殖。 ⒉ 贴壁培养 • 让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方
法。 ⒊ 贴壁-悬浮培养
⒊ 贴壁-悬浮培养 ⑴ 微载体培养 ⑵ 包埋和微囊培养 ⑶ 结团培养
1、悬浮培养 • 适合非贴壁依赖细胞、兼性贴壁细胞 • 操作简便、培养条件均一、传质和传氧较好、
一、动物细胞的培养条件
1、器材的清洗和消毒
• 浸泡、刷洗、泡酸、冲洗
组 分 强酸 次强酸
重铬酸钾/g 63
120
硫酸/ml
1000 200
水/ml
200 1000
弱酸 100 100
1000
• 器材的消毒灭菌：物理、化学、抗生素 2、水质 3、pH：7.2-7.4,缓冲系统 4、渗透压:290-300mOsm/kg，
获得的细胞悬液（109/g）。 • 需要大量动物，费钱费劳力。 • 鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、
淋巴细胞。
2、二倍体细胞系
• 原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞 成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一 定特征的细胞株。
二倍体细胞有正常细胞的特点
①染色体组型是 2n 核型； ②贴壁依赖接触抑制； ③可传代培养50代； ④无致瘤性。