生物技术制药要点

生物技术制药要点概括

1.现代生物技术发展大事记：

年代主要发现和进展

1953 Watson和Crick阐明了DNA的双螺旋结构

1958 分离得到DNA聚合酶I，并在试管内制得人工DNA

1960 发现mRNA，并阐明了mRNA在蛋白质合成中的作用

1966 破译遗传密码

1967 分离得到DNA连接酶

1970 分离出第一个限制性内切酶

1971 第一次用限制性内切酶和连接酶获得重组DNA

1972 合成了完整了tRNA基因

1974 Boyer和Cohen建立了DNA重组技术

1975 Kohler和Milstein建立了单克隆抗体技术

1976 DNA测序技术诞生

1978 Genentech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素

1981 第一个单克隆抗体诊断试剂盒在美国被批准使用

1981 第一台商业化生产DNA自动测序仪诞生

1982 用DNA重组技术生产的第一个动物疫苗在欧洲获得批准

1983 基因工程Ti质粒用于植物转化

1988 PCR（聚合酶链式反应）技术诞生

1990 美国批准第一个体细胞基因治疗方案

1997 英国培育出世界上第一只克隆羊多莉

1998 美国批准艾滋病疫苗进行人体实验

2001 人类基因组草图完成

2003 世界上第一个正式批准的基因治疗药物重组腺病毒-p53注射液在中国上市

2008 人类将表皮细胞激活为干细胞

2.生物技术药物（biopharmaceutics）:广义是是指所有以生物质为原料只去的各种生物活性物质及其人工合成类似物、以及通过现代生物技术制的的药物，狭义指利用生物体、生物组织、细胞及其成分，综合应用化学。生物学和医药学各学科原理和技术方法制得的用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品，而这里特指采用DNA重组技术或其他现代生物技术研制的蛋白质或核算类药物。

3.生物技术药物的四大类型：基因重组药物、基因药物、天然药物、合成的半合成的生物技术药物。

4.生物技术药物的主要特点：剂量小，活性高；分子结构复杂，分子量一般较大；稳定性较差，易失活或分解，体内半衰期短；具有种属特异性；具有免疫原性；分析检验的特殊性。

5.生物技术药物与化学药物的区别：

6.组合化学（Combinatorial Chemistry）方法：是一门将化学合成、组合理论、计算机辅助设计及机械手结合一体，并在短时间内将不同构建模块根据组合原理，系统反复连接，从而产生大批的分子多样性群体，形成化合物库(compound library)，然后运用组合原理，以巧妙的手段对库成分进行筛选优化，得到可能的有目标性能的化合物结构的科学。

7.基因组学（Genomics ）：是对一个生物体的整个基因组的系统性研究。核心目标是将细胞的全部DNA进行测序，绘制基因组排序的物理图谱，对各种基因和非编码区在基因组中的精确定位。

8.蛋白质组学（Proteomics ）：是指由一个细胞或组织的基因组在某一特定环境下的某一时刻所表达的全部相应的蛋白质，目的是提供正常人和病体中总体蛋白质的结构、功能及调控的详细信息。

9.生物技术药物质量控制相关英文缩写：

FDA：Food & Drug Administration(食品药物监督管理局)

SFDA：State Food & Drug Administration（中国国家食品药品监督管理局）

GLP：Good Laboratory Practice（药物非临床研究质量管理规范）

GCP：Good Clinical Practice（药品临床试验质量管理规范）

GMP：Good Manufacture Practice（药品生产质量管理规范）

10.生物技术药物的分析检测：

○电泳分析（electrophoresis analysis）：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。SDS-PAGE用于蛋白质亚基解离、变性，游离成单独的肽链，用SDS掩盖蛋白质表面的电荷，使所有肽链均带上相同密度的负电荷，因此肽链在聚丙烯酰胺凝胶中迁移的速率只取决于肽链的相对分子质量，用已知相对分子质量的标准蛋白marker作为残币，可以测得待测蛋白质亚基的相对分子质量；琼脂糖凝胶电泳常用于核算分离及相对分子质量测定，核酸片段在琼脂糖中的迁移速率取决于核酸分子的大小及形状，与其相对分子质量的对数值成反比，DNA的构型对迁移率产生很大的影响，迁移率按从大到小依次为：共价闭合环状DNA、线型DNA、开环的双链环状DNA；

○凝胶色谱分析（gel chromatography analysis）；是测定大分子相对分子质量的一种常用方法，可以测定大分子相对分子质量的分布，尤其是多糖，由于不同的大分子具有不同的空间尺寸，因此它们在凝胶层中移动的路径不同；

○酶分析法（enzyme assay method）；

○免疫分析（immunoassay）：是利用抗原/抗体之间的特异性结合作用来选择性识别和测定可作为抗体或抗原的待测物的分析方法，具有高度的特异性和敏感性；标记免疫分析方法是指将试剂抗原/抗体用具有很高检测灵敏度的标记物标记，发生免疫反应后测定反应物或复合物中标记物的量的变化，间接测定待测抗原或抗体的含量/浓度；酶联免疫吸附分析法（ELISA--enzyme-linked immunosorbent assay）是将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展的一种免疫分析方法，其原理是将抗原或抗体与某种酶联结成酶标记抗原或抗体，这种酶标记抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

11.抗原（antigen，Ag）是指能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质，具有免疫原性和抗原特异性的特征。

12.抗体（antibody，Ab）是指机体经抗原刺激后由免疫细胞产生的一组免疫球蛋白，其具有高度的特异性，一般只能与相应的抗原发生专一性反应，用于防御外界物质对机体的侵袭。

13.基因工程制药的基本过程：获得目的基因（切）－组建重组质粒（接）－构建基因工程菌或细胞（转）－培养工程菌（增）－产物分离纯化（检）－除菌过滤（分离）－半成品和成品鉴定（除菌）—包装。

14.目的基因的获得：反转录法；反转录-PCR反应法；化学合成法；筛选基因的新方法（编码序列富集法、岛屿获救PCR法、动物杂交法、功能克隆法、构建cDNA文库、差异显示技术的应用）；对已发现基因的改造。

15.基因载体的选择：

○质粒载体：pET-32a（+）：E.coli中表达的优良载体，受T7噬菌体强转录的翻译控制，具有Amp r抗性，酶切位点丰富，含T7lac启动子，含有T7.Tag和His-Tag融合标签，便于检测和纯化目标蛋白；pPIC9K：巴斯德毕赤霉菌中表达的优良载体，是真核表达常用载体，

复制起始位点，具有4可在酵母及原核生物中表达，具有Amp r和Kan r抗性标记，含Col E

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个多克隆位点，含强启动子AOXI，能被甲醇诱导，含α因子信号肽序列，为分泌型表达；○λ噬菌体载体：基因组为线性双链DNA，约50kb，可编码61个基因，宿主E.coli，两端各有12个碱基组成的5'端凸出的互补粘性末端（cos位点），可成环，允许插入多达2kb的外源基因片段；

○腺病毒载体：无包膜的线性双链DNA病毒，由252个壳粒以二十面体排列而成，基因组长度36Kb，分布着4个早期转录元（E1、E2、E3、E4）负责承担调节功能，另有一个晚期转录元负责结构蛋白编码，腺病毒载体特点为：宿主范围广，基因组较稳定，较少发生重排，传代稳定性较好，转导效率高，与人类基因同源，因此能为人类蛋白质进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供较理想的环境。

16.宿主细胞与表达系统中酵母目的基因表达的影响因素：◎外源基因剂量；◎外源基因的表达效率（启动子、分泌信号、终止序列）；◎外源戴白糖基化（N-糖基化、O-糖基化）；◎宿主菌株的影响（宿主菌的生长力要强、宿主菌内源蛋白酶活性应较低、宿主菌的性能应稳定，避免使用恢复突变率高的菌株、应有较强的分泌能力）。

17.基因工程药物的生产工艺：◎中试：是指从实验室研究到产业化必须经过中间放大试验的系列工艺研究和验证，这种中间放大试验简称“中试”，中试研究就是将基因工程从实验室阶段向生产阶段过渡的一个中间阶段，目的是建立一条完全模拟实际生产条件的小型生产流水线，并对一系列参数和条件进行优化；◎基因重组蛋白的发酵生产—高密度发酵：发酵条件的改造、构建产酸能力弱的工程菌、构建蛋白水解酶活力低的工程菌；◎重组蛋白的分离纯化：＃建立分离纯化工艺的各种因素（发酵液特点：产物浓度低组分复杂；不同菌种、不同培养基和不同工艺条件下得到的发酵液成分存在差异；不同类型产品的物化