生物制药

生物制药综述高艺娜：浅谈川贝母的研究进展2011年04月08日浅谈蛋白质折叠的研究进程高艺娜（大连民族学院生命科学学院生物08-1班2008031108 116600）摘要蛋白质结构与功能的关系，近年来已经成为结构生物学研究的热点之一。

本文主要介绍了关于蛋白质折叠的研究进程，并对蛋白质折叠的基本概念，机制，研究概况及今后的研究方向做了详细的介绍。

关键词蛋白质；折叠；分子伴侣；机制;研究蛋白质折叠是生物学中心法则中至今尚未解决的一个重大生物学问题。

[蛋白质像是一个微小而精密的机器。

在蛋白质实现它的生物功能之前，它们会把自己装配起来。

虽然蛋白质折叠是对所有的生物体系来说最重要的和最基本的过程，但这个过程对人类而言仍然是个未解之谜。

由20种氨基酸组成的多种多样蛋白质，比核酸分子复杂的多，而且具有形形色色的功能，几乎参与了生命活动的所有方面并起着关键作用。

但最终只有一种或少数几种特定三维构象是具有生物学活性或功能的，这种特定空间结构受到轻微破坏时，生物学功能就受到影响或丧失，新生的蛋白质如何形成有活性或共能的机构以及蛋白质结构与功能的关系等是蛋白质折叠研究需解答并去解决的问题。

1 基本概念结构决定功能，仅仅知道基因组序列并不能使我们充分了解蛋白质的功能，更无法知道它是如何工作的。

蛋白质可凭借相互作用在细胞环境(特定的酸碱度、温度等)下自己组装自己，这种自我组装的过程被称为蛋白质折叠。

2 蛋白质折叠机制的理论模型2.1 框架模型（Framework Model）框架模型[4] 假设蛋白质的局部构象依赖于局部的氨基酸序列。

在多肽链折叠过程的起始阶段, 先迅速形成不稳定的二级结构单元；二级结构框架相互拼接，肽链逐渐紧缩，形成了蛋白质的三级结构。

这个模型认为即使是一个小分子的蛋白也可以一部分一部分的进行折叠, 其间形成的亚结构域是折叠中间体的重要结构。

2.2 疏水塌缩模型（Hydrophobic Collapse Model）在疏水塌缩模型中，疏水作用力被认为是在蛋白质折叠过程中起决定性作用的力的因素。

在形成任何二级结构和三级结构之前首先发生很快的非特异性的疏水塌缩。

2.3 扩散-碰撞-粘合机（Diffusion-Collision-Adhesion Model）该模型认为蛋白质的折叠起始于伸展肽链上的几个位点，在这些位点上生成不稳定的二级结构单元或者疏水簇，主要依靠局部序列的进程或中程（3-4个残基）相互作用来维系。

球形中间体调整为熔球态结构。

最后熔球态转变为完整的有活力的天然态。

2.3 成核-凝聚-生长模型(Nuclear-Condensation-Growth Model）根据这种模型，以“折叠晶核”为核心，整个肽链继续折叠进而获得天然构象。

晶核的形成是折叠起始阶段限速步骤。

2.4 拼版模型（Jig-Saw Puzzle Model）高艺娜：浅谈川贝母的研究进展此模型的中心思想就是多肽链可以沿多条不同的途径进行折叠, 最终都能形成天然构象, 而且沿每条途径的折叠速度都较快。

另一方面, 外界生理生化环境的微小变化或突变等因素可能会给单一折叠途径造成较大的影响，但不会从总体上干扰多肽链的折叠。

3 蛋白质折叠研究的概况蛋白质作为生命信息的表达载体，它折叠所形成的特定空间结构是其具有生物学功能的基础，既这个一维信息向三维信息的转化过程是表现生命活力所必需的。

自从20世纪60年代，Anfinsen基于还原变性的牛提出了“多肽链的氨基酸序列包含了形成其热力学上稳定的天然构象所必需的全部信息”的“自组装学说”以来，随着对蛋白质折叠研究的广泛开展，人们对蛋白质折叠理论有了进一步的补充和扩展。

“自组装热力学假说”得到了许多体外实验的证明，的确有许多蛋白在体外可进行可逆的变性和复性，尤其是一些小分子量的蛋白，但是并非所有的蛋白都如此。

而且由于特殊的环境因素，体内蛋白质的折叠远非如此。

3.1 体外蛋白质折叠研究概况近年来，以溶菌酶为材料深入研究了体外的蛋白质折叠过程。

伸展态的溶菌酶在体外的折叠过程为；α结构域中的两个α螺旋先形成，其次是形成另外2个α螺旋，再次是形成β结构域。

整个过程约需2秒钟【3】。

这些研究表明 ,对大多数小分子蛋白质来说，变性的蛋白质在没有外来援助的情况下可以通过再折叠达到天然状态。

一．无秩序态的瓦解和二级结构的形成。

二．二级结构的稳定阶段。

三．多途径折叠。

不同蛋白质二级结构单元的联合和装配方式不同，即通过多途径导致从变性态转变为天然态。

四．走向天然态。

通过稳定二级结构的相互作用进入天然状态。

这一阶段是折叠的最后过程，比早期过程慢。

在这一阶段，侧链被包装在特定的位置，分子变得越来越紧密，成为有特定三维结构和生物功能的蛋白质分子。

3.2 体内蛋白质折叠研究概况体内蛋白质折叠的环境与体外是很不同的。

体外蛋白质折叠的环境单纯 ,折叠从完整的肤链开始。

一般情况下，体外折叠效率低而体内折叠效率高。

进一步的研究表明 ,至少有二类蛋白质因子参与了体内的蛋白质折叠过程-类是酶 ,包括蛋白质二硫键异构酶和脯氨酞顺-反异构酶。

另一类是分子伴侣（molecular chaperone)。

分子伴侣是广泛存在于原核和真核生物中的蛋白质，是由若干在结构上不相关的蛋白质家族组成的。

它们能结合其它蛋白质并使其稳定处于非天然态构象，然后通过有控制地释放而促进这些蛋白质的正确折叠，但自身并不成为被折叠的蛋白质的一部分[4]。

近几年关于分子伴侣的研究进展很快，已鉴定的很多，其中研究得最多的2个分子伴侣家族是Hsp70和Hsp60.4 蛋白质折叠今后的研究方向4.1 蛋白质折叠的最新进展近年来，研究人员用实验、理论、计算机模拟等不同手段致力于蛋白质折叠及其相关问题的研究，取得了许多重要的进展。

蛋白质折叠技术的研究促进了人们对蛋白质折叠机理的认识。

例如著名的蛋白质折叠的能量漏斗模型、阐明了单域小蛋白的两态折叠机制等。

王炜等[12]用球柱形约束模拟细胞拥挤环境，构建了一个蛋白质折叠和二聚化的理论模型。

他们发现当两个单体蛋白质链相距较远时，它们经历无规的布朗扩散运动，而当其靠近时，则经历协作的折叠和聚合。

随着有效分子浓度增加，二聚蛋白的热力学稳定性增强，二聚化动力学过程被加快。

从中确定细胞中分子浓度与蛋白质二聚化动力学的优化关系。

Bryan等[13]通过构建了两种高度相似的氨基酸序列而空间结构和功能迥异的链球菌蛋白质GA88和GB88。

二者氨基酸残基相似高达88%，但GA88主要是由α螺旋构成，GB88则由α+β构成，并且它们对PH敏感度不同。

这给我们提供一个难得机会探索蛋白质的折叠，通过比较二者变性、复性的过程，发现在肽链序列上相隔较远的氨基酸残基间的疏水作用力对维持和稳定蛋白质分子的构象具有重要影响。

预测蛋白质结构成为研究蛋白质折叠的一个热点。

目总体上说, 蛋白质结构的从头预测法涉及三方面的工作[15]一是归结出能更好地反映氨基酸间相互作用和环境条件等的数学模型;其次是建立更有效地区分目标结构正确与否的识别方法;三是发展更高效的搜索方法用于功能构象的搜索。

M.J. Aman等[16]发现蛋白质折叠是多肽链中氨基酸残生物制药综述 3基发生窄频带计量事件的结果。

优先发生反应的氨基酸残基并不会导致蛋白质的折叠。

在这一点上，值得注意的是优先反应的氨基酸残基具有引导蛋白质折叠的潜能。

4.2 研究意义与研究前景蛋白质折叠的理论意义是将揭示生命体内的第二套遗传密码。

蛋白质折叠的研究,比较狭义的定义就是研究蛋白质特定三维空间结构形成的规律、稳定性和与其生物活性的关系。

在概念上有热力学的问题和动力学的问题;蛋白质在体外折叠和在细胞内折叠的问题;有理论研究和实验研究的问题。

它还存在重要的潜在应用前景,有以下几个方面。

一．利用 DNA重组技术可以将外源基因导入宿主细胞。

但重组基因的表达产物往往形成无活性的、不溶解的包涵体。

折叠机制的阐明对包涵体的复性会有重要帮助。

二.许多疾病,如阿兹海默症,疯牛病,可传播性海绵状脑病,还有帕金森氏症等正是由于一些细胞内的重要蛋白发生突变,致7 展望及小结蛋白质聚沉或错误折叠而造成的。

因此,深入了解蛋白质折叠与错误折叠的关系对于这些疾病的致病机制的阐明以及治疗方法的寻找将大有帮助。

三.DNA重组和多肽合成技术的发展使我们能够按照自己的意愿设计较长的多肽链。

但由于我们无法了解这一多肽将折叠为何种构象，从而无法按照自己意愿设计我们需要的、具有特定功能的蛋白质。

四.基因组序列的发展使我们得到了大量的蛋白质序列, 结构信息的获得对于揭示它们的生物学功能是十分重要的。

依靠现有手段( X- ray晶体衍射，NMR及电镜)测定蛋白质的结构需要较长的时间, 因此结构解析的步伐已落后于发现新蛋白的步伐。

另外, 我们对于蛋白质相互作用、配体与蛋白质的作用等结构与功能关系的研究也有赖于蛋白质折叠机制的阐明。

高艺娜：浅谈川贝母的研究进展参考文献：[1] 王天志,杜蕾蕾,王曙.川贝母的研究进展[J].华西药学杂志,2001,16(3):200-203[2] 张荣发.川贝母的研究进展[J].中国药业，2006，15(8):62-63. [3] 李萍,季晖,徐国钧等.贝母类中药的镇咳祛痰作用研究.中国药科大学学报，1993，24(6)3,24(6):360-361[4] LIN Ge,Yee2PingHo,LIPing,etal1Puqiedinone,a novelalphacevanine alkaloid from the bulbs ofFritillaria puqiensis,an antitussivtraditional Chinese medicine.Prods,1995,58(11):1662-1664[5] LI Song-in,LIN Ge,CHANShun-an,Determination of the majorisosteroidal alkaloids in bulbs ofFritillaria by high2 performance liquid chromatography coupled with evaporativelightscatteringdetection[J]Chromatography2001,909(2):2071[6] Shun-wan,LISong-lin,LIN Ge,etalPharmacokinetic study and determination of imperialine,the major bioactivecomponent in an titussive Fritillariacirrhosa,in rat by High Performance Liquid Chromatography coupled with evaporativelight scatteringdetectorlAnaBiochem ,2000,285(1):1721[7] 王艳红,郑有兰.中药几种贝母中 8种无机元素的含量分析[J].微量元素与健康究,2004,21(6):30-32.[8] 王超群,易敏之. 川贝母枇杷糖浆中贝母素甲的含量测定[J].江西中医学院学报,2006,18(1):32-34[9] 黄镇光,郑坚雄.念慈庵蜜炼川贝枇杷膏中贝母素乙含量测定 [J].中药材,2000,23(6):356. [10] 蓝日盛,辛宁,樊泽华.不同采收期及加工方法的川贝母有效成分含量测定 [J].广西中医学院学报,2000,17(3):93-94.[11] 李松林,李萍,林鸽,等.药用贝母中几种活性异甾体生物碱的分布[J].药学学报,1999,34(11):842- 847.[12] 李文彦,毕开顺,乔延江,等. 柱前衍生化高效液相色谱法测定伊贝母中西贝素的含量[J].中国药学杂志 1997,32(6):363-365.[13] 张庆林,王爱芹,宋京.高效液相色谱法分析小鼠血浆中贝母乙素及其药代动力学研究[J].中国中药杂志,2000,35(10):688-689.[14] 朱丹妮,谭丰萍,高山林.HPLC-ELSD分析测定贝母类药材中生物碱成分[J].药物分析杂志,2000,20(2): 87-91.[15] 赵霞,陆阳,陈泽乃.毛细管电泳法定量分析贝母中几种生物碱[J].中草药,2001,32(2):116-118.[16] 陈士林,贾敏如等.川贝母野生抚育之群落生态研究[J].中国中药杂志,2003,28(5):398-402.[17] Teksen M,AytacZ.New Fritillaria L.taxafrom Turkey[J].Isra-l J PlantSci,2004,52(4):347-355.[18] Jiang Y,Li H, Li P.Ster oidal alkal oidsfrom the bulbs of Fritillariapuqiensis[J].JNatProd,2005,68(2):264-267.[19] 李强,傅华龙.组培川贝母鳞茎形成和发育过程中的同功酶分析[J].应用与环境生物学报,2002,8(6): 610-613.[20] 李强,凌丽俐,傅华龙等.低温诱导对组培川贝母胚状体成苗的影响[J].四川大学学报:自然科学版,2003,40 (2):367-370.[21] 李慧,黄培军.川贝母及其伪品的性状鉴别[J].食品与药品,2006,8(1):76.[22] 刘震东,程世琼,王曙.聚酰胺薄膜色谱鉴别栽培的川贝母[J].华西药学杂志,2006,21(1):64-66.[23] 王晓杰.用川贝母组方治疗肝硬化腹水[J].中医杂志,2004,45(6):410.生物制药综述 5[24] 陈晋宇.川贝母治小便淋沥[J].中医杂志,2004,45(6):412.[25] 朱金宏.活血散结法治疗乳腺小叶增生症 180例[J].河南中医,2006,26(3):40.基发生窄频带计量事件的结果。