拟南芥QRAP2基因的克隆_表达_DNA结合能力及体外转录活性分析

论文第50卷第17期 2005年9月拟南芥QRAP2基因的克隆、表达、DNA结合能力及体外转录活性分析魏刚雷娟巩威朱玉贤*(北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室, 北京 100871. *联系人, E-mail: zhuyx@)摘要通过对拟南芥ATH1基因芯片数据的分析, 从拟南芥中鉴定到一个受干旱胁迫高水平诱导的cDNA片段, 并用RACE方法获得了其全长cDNA. PCR及定量实时PCR分析表明, 该基因在经干旱、紫外线照射、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高, 特别是干旱处理后短时间内表达量迅速提高, 3 h后即提高到对照样品的430多倍. 通过多序列比对和系统进化分析, 我们将该基因归于DREB亚家族. 由于该基因编码蛋白含有典型的AP2/EREBP DNA结合结构域, 并在N端有一段富含谷氨酰氨残基的区域, 所以将它命名为QRAP2 (Glutamine-rich AP2). 凝胶阻滞实验结果显示, QRAP2蛋白能够特异结合DRE顺式元件序列但不能与mDRE和GCC等非相关元件结合. 酵母单杂交实验表明, QRAP2蛋白全长序列或其N端112个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域形成的融合蛋白表现出转录激活功能, 而其C端135个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域的融合蛋白则没有表现出转录激活活性. 现有资料的分析表明, QRAP2是AP2/EREBP转录因子家族的新成员, 可能在干旱胁迫条件下参与激活相关下游基因的表达.关键词QRAP2胁迫 DREB酵母单杂交 转录因子干旱是影响植物生长发育的重要环境胁迫因子. 为了适应或抵抗干旱, 植物会做出一系列适应性的反应来减轻缺水带给细胞的伤害. 近年来的研究表明, 许多基因的表达受到干旱胁迫的诱导. 这些基因的编码蛋白既包括水通道蛋白[1]、LEA蛋白[2]、蔗糖合成酶[3]等功能蛋白, 也包括蛋白激酶[4]、磷脂酰肌醇[5]、转录因子[6]等调控因子. 这些基因组成了复杂的调控网络, 并通过一系列信号转导过程, 将干旱胁迫这种非生物因子转变成对于某些或某类特定基因的诱导表达或抑制, 从而调节植物体内相关的生理生化反应, 增强植物对胁迫的耐受性[7].研究表明, 许多干旱或低温应答基因如kin1, cor6.6, rd17, rd29A等基因的诱导表达与其启动子区域含有的DRE元件有直接关联. DRE元件或含有DRE核心序列(CCGAC)的元件可以在植物中传递对干旱、低温已及高盐等胁迫条件的应答, 而这种应答是不依赖于植物体在受到胁迫后自身产生的ABA的作用[8~12]. rd29A(cor78/lti78)基因编码与LEA蛋白非常相似的亲水蛋白, 可以保护细胞免受水分胁迫的伤害. 该基因的启动子区域同时存在依赖ABA的ABRE元件(ABA responsive element)和不依赖ABA 的DRE元件, 实验证实该基因在干旱开始后几小时内的快速诱导表达不依赖于ABA, 而随后阶段的慢性诱导表达却是依赖于ABA的[8,9,13].DREB是属于AP2/EREBP家族的一类转录因子, 具有保守的AP2/EREBP结构域, 能够与DRE元件特异性结合, 调控其下游基因表达[14~16]. 目前已在拟南芥中克隆了多个编码DREB类转录因子基因, 如DREB2a, DREB2b和CBF4等, 它们在干旱、低温、高盐等胁迫条件下均有很显著的诱导表达特性[17~20]. DREB2a与DREB2b在原生质体瞬时表达系统中可以特异诱导启动子区含有DRE元件基因的表达[19], 而CBF4转基因过表达拟南芥能够在正常条件下表达含有DRE元件的胁迫应答基因, 并在干旱、低温、高盐等条件下显示了更强的耐受能力[20]. 本文克隆了拟南芥中一个富含谷氨酰胺的DREB类转录因子QRAP2基因. 研究发现该基因受干旱强烈诱导表达, 它所编码的蛋白能在体外与DRE序列特异性结合并在酵母中显示了转录激活功能, 我们推测该基因在拟南芥干旱应答途径中具有重要作用.1材料与方法(ⅰ) 植物材料. 哥伦比亚野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana, Columbia ecotype)于全自动培养箱(Conviron公司)中培养. 培养条件为22℃, 光照第50卷第17期 2005年9月论文强度100 µE·m−2·s−1, 光照时间16 h. 将处于6~8片莲座叶生长期的拟南芥植株分别进行冷、热、干旱、乙烯、水杨酸、脱落酸、紫外线、NaCl条件下的处理, 具体处理方法参照Gong等人[14]的方法. 处理后的植株保存于液氮中备用.(ⅱ) 氨基酸多序列比对与系统发生分析. 氨基酸多序列比对与系统进化树分析使用Clustal W 1.8.3软件[21]. 参与分析蛋白序列的编码基因的AGI号分别为: ANT, At4g37750; SMZ, At3g54990; SNZ, At2g39250; RAV1, At1g13260; RAV2, At1g68840; RAP2.1, At1g46768; TINY, At5g25810; DDF1, At1g12610; DDF2, At1g63030; CBF1, At4g25490; CBF2, At4g25470; RAP2.4, At1g78080; At2g20880, DREB2B, At3g11020; ABI4, At2g40220; AtERF1, At4g17500; AtERF2, At5g47220.(ⅲ) RNA的提取. 使用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN公司)提取拟南芥植株的总RNA, 方法参照QIAGEN公司产品使用手册.(ⅳ) RACE方法获得全长mRNA序列. 根据NCBI (/)预测的QRAP2 的ORF序列设计RACE实验所用的基因特异引物序列为: FP1, 5′-TGAGCAACGACAAGACCCGACAAT- 3′; FP2, 5′-GGAAAGCGAGCTGCATGATTCAAAC- 3′; RP1, 5′-GGCTGTGGCGTTTCAGGTTCTTTCT-3′; RP2, 5′-CCTTGCATTGTCGGGTCTTGTCGTT-3′. 以5 µg 经干旱处理3 h后提取的拟南芥总RNA为起始材料, 使用GeneRacer试剂盒(Invitrogen公司)获得5′和3′端分别连接上特殊接头序列的cDNA模板, 具体操作方法按照Invitrogen公司产品使用手册进行. PCR扩增采用50 µL 反应体系, 5′ RACE扩增第1轮使用带有接头序列的cDNA作为模板, GeneRacer 5′引物和RP1作为引物; 然后以第1轮扩增产物作为模板进行套式 PCR, 引物采用GeneRacer 5′套式引物和RP2. 3′ RACE扩增方法类似, 2轮PCR的引物分别为GeneRacer 3′引物与FP1, GeneRacer 3′套式引物与FP2. PCR反应条件为: 94℃预变性2 min; 94℃ 30 s, 65~68℃30 s, 72℃ 90 s, 共30个循环; 72℃ 10 min, 4℃保存. 循环中退火温度根据所选引物而定. 所得5′和3′套式PCR扩增产物经1.2% 琼脂糖凝胶电泳检查, 分别经回收纯化后克隆至pGEM-T easy 载体中测序.(ⅴ) RT-和定量Real-time RT-PCR(QRT-PCR)分析. 分别提取各种条件下处理的拟南芥材料的总RNA 3 µg进行反转录反应. 实验采用Invitrogen 公司的SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒, 生成的第1链cDNA用作RT-PCR 的模板. 用UBQ10作为对照来平衡cDNA模板的用量. PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检查. QRT- PCR使用SYBR green PCR试剂盒(Applied Biosys-tems公司)标记反应产物, PCR分析仪器为DNA En-gine Opticon-Continuous Fluorescence Detection Sys-tem (MJ Research公司).(ⅵ) QRAP2的原核表达及纯化. 以pGEX-4T-1为原核表达载体, 设计引物(ORFP1, 5′-AGTAGG- ATCCATGGACTTTGACGAGGAG-3′; ORFP2, 5′-CA- CGCTCGAGTCAAAAGAAAGGCCTCA-3′), 扩增QRAP2的全长读码框, 分别在引物两端引入Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位点, 构建可表达GST-QRAP2融合蛋白的载体. 以干旱处理的拟南芥总RNA样品反转录后的第1链cDNA为摸板, PCR扩增目的片段. 产物经纯化后用Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后连入pGEX-4T-1, 测序正确后用于原核表达. 将重组质粒pGEX-4T-1-QRAP2转入大肠杆菌BL21, 挑取转化的单克隆菌株, 接入LB培养基中, 37℃, 240 r/min振荡过夜. 将所培养菌液按1︰50转接入2×YPD培养基, 37℃, 240 r/min摇床培养约2 h, 当菌液A600达到0.6~0.8时, 加入IPTG至终浓度为0.4~1 mmol/L进行诱导, 菌体继续在37℃, 240 r/min培养4~6 h后离心收集菌体, 冰浴中超声波破碎菌体, 离心后的上清液用于重组蛋白的纯化. GST-QRAP2融合蛋白经Glutathione Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Bio-tech)纯化, 具体方法参照产品说明书.(ⅶ) EMSA. 取50 ng已纯化的表达蛋白, 加入1 µg 非特异性封闭探针poly(dA- dT), 2 µL 5×结合缓冲液(125 mmol/L HEPES-KOH, 50% 甘油, 200 mmol/L KCl, 2.5 mmol/L EDTA, 5 mmol/L DTT, pH 7.9), 混匀后加入1 pmol 32P标记探针, 最终总反应体系为10 µL. 所用探针序列为: GCC, TAAGAGCCG- CCACT; DRE: ATACTACCGACAT; DRE-2: ATAC- TGCCGACAT; mDRE: ATACTACTTATAT. 混匀反应物后, 在室温下结合2 h 后进行6% 非变性 PAGE 电泳, 电泳缓冲液为0.5×TBE(45 mmol/L Tris-borate, 1 mmol/L EDTA). 电泳后的凝胶经干胶后放入磷屏曝光24 h, 结合活性根据Typhoon 9210 (Amersham Pharmacia Biotech) 所检测的同位素信号强度定量.(ⅷ) 酵母单杂交转录激活活性分析. 按照Ye论文第50卷第17期 2005年9月等人[22]改进的方法进行转录激活活性分析. 将含有pG221质粒的酵母菌株EGY48接进50 mL SC-Ura培养基中, 30℃, 250 r/min培养16~18 h, 至平台期(A600 >1.5). 1:10转接使得最终A600 = 0.2~0.3. 30℃, 230 r/min培养3 h, 使得最终A600 = 0.4~0.6. 取菌液50 mL室温1000×g离心5 min; 弃上清, 30 mL ddH2O重悬, 室温1000×g离心5 min, 弃上清, 加入1.5 mL 预冷的1×TE/LiAc重悬制得酵母感受态细胞. 将0.1 µg 待转化pYF503质粒及0.1 mL 酵母感受态细胞混匀, 加入0.6 mL PEG/LiAc 溶液, 200 r/min, 30℃培养30 min, 加入70 µL DMSO, 轻轻颠倒混匀, 42℃热激15 s, 冰上放置1~2 min, 14000 r/min离心5 s. 弃上清, 加入0.5 mL 1×TE溶液重悬, 取100 µL涂在SC- Ura-Trp培养基上30℃培养2~3 d. 将长出的酵母菌落在SC-Ura-Trp+Xgal显色平板上划线, 30℃培养2 d 后观察显色情况.2结果与讨论2.1 QRAP2的克隆及序列分析根据对拟南芥ATH1芯片数据的分析, 发现一个干旱处理后表达量提高10倍以上的cDNA, 将其命名为QRAP2. 通过RACE方法, 获得该基因的全长, 1218 bp. 在该cDNA起始密码子ATG上游21 bp处出现了一个终止密码子, 可读框下游876 bp后出现终止密码子, 推测编码一条含292氨基酸残基的多肽. 序列已递交到GenBank数据库, 登录号为DQ011579. 该基因的AGI 号为At4g28140. 多序列比对结果显示, QRAP2编码蛋白含有一段典型的AP2/EREBP保守结构域(图1(a)), 该结构域在氨基酸水平上与多个已报道的拟南芥AP2家族转录因子具有很高的相似性(图1(b)). 系统进化树分析表明, QRAP2在氨基酸水平上与DREB亚家族转录因子更为接近, 而与AP2和RAV 2个亚家族则距离相对较远(图1(c)).2.2 QRAP2 mRNA的转录水平检测RT-PCR与QRT-PCR结果表明, QRAP2在未处理的拟南芥植株中表达量极低, 而在经干旱、紫外线照射、ABA(脱落酸)、NaCl以及SA(水杨酸)等处理后表达量分别提高了431, 128, 102, 65, 4倍(图2(b)). 我们进一步研究了QRAP2在不同干旱处理时间下的表达状况, 发现该基因在干旱处理30 min时表达量即提高了32倍, 短时间内表达量急剧升高, 在3 h时表达量升高到对照样本的400多倍, 而接下来QRAP2的表达量开始逐渐下降, 并在24 h后降为对照样本的7倍(图3(b)). 对照CBF1, CBF2, CBF3, DREB2A 等已报道的DREB亚家族成员在受到干旱, 低温等胁迫条件下的表达情况, 发现这类基因都具有同QRAP2相似的表达模式, 即短时间内表达量迅速提高, 在2~5 h内达到最高值, 而后表达量逐渐下降, 并在24 h以后降至本底或略高于本底水平[19,23]. 另外, Takahashi 等人[24]应用cDNA 微阵技术检测到At4g28140在甘露醇(造成与干旱相似的渗透压胁迫)和高盐胁迫下有很强的诱导表达(表达量提高5倍以上), 与本研究中QRAP2 表达谱的RT-PCR研究结果基本相符. Marathe 等人[25]同样用ATH1 芯片检测到At4g28140 在拟南芥受到植物病毒CMV-Y侵染后表达水平下降到一半以下, 推测该基因可能参与植物防御反应.2.3原核表达的QRAP2重组蛋白与DNA结合特性分析与未诱导的已转入pGEX-4T-1-QRAP2质粒的大肠杆菌菌体总蛋白相比, 经IPTG诱导的菌体总蛋白表达出一表观分子量约为60 kD的蛋白条带, 相当于QRAP2蛋白(理论分子量33 kD)加上GST 标签蛋白(理论分子量26 kD). 该蛋白主要存在于包涵体中, 小部分溶于上清. 通过Glutathione Sepharose 4B亲和柱层析, 从上清中纯化了该重组蛋白. 用纯化的QRAP2重组蛋白进行EMSA实验, 实验结果表明QRAP2与DRE元件序列和DRE2元件序列均有很强的结合能力, 而几乎完全不能与GCC及mDRE元件序列(DRE元件结合中心区4个碱基CGAC突变为TTAT)相结合(图4). DRE与DRE2序列都含有核心序列CGAC, 这4个碱基对于QRAP2蛋白与DNA的结合至关重要. DREB和ERF是AP2家族中很相近的2个亚家族, 它们在AP2/ERF结构域上的细微差别使得它们对于DRE和GCC元件具有明显不同的结合偏好[16,26]. 因此, 本研究证明QRAP2属于DREB而不是ERF亚家族.2.4 QRAP2转录激活活性分析将表达GAL4结合结构域与QRAP2的融合蛋白的质粒转入酵母中, 能够使GAL4顺式序列调控下的报告基因LacZ得到表达, 形成蓝色菌落(图5), 表明QRAP2具有转录激活活性. 通过对QRAP2编码蛋白序列的分析, 我们发现在N端67~107这一段区域中第50卷 第17期 2005年9月论 文图1 QRAP2 蛋白序列分析(a) 根据氨基酸序列预测的QRAP2的结构域框架图; (b) 部分拟南芥DREB 转录因子中AP2/EREBP 结构域多序列比对结果;(c) QRAP2基因在拟南芥AP2/EREBP 家族系统树中的定位分析谷氨酰胺残基含量高达43.9%, 并有一串8个连续的谷氨酰胺残基. Gerber 等人[27]发现富含谷氨酰胺残基, 特别是形成6个以上连续谷氨酰胺残基串的短肽具有很强的转录激活活性. QRAP2的转录激活活性也很可能与这一段富含谷氨酰胺残基的区域有关. 进一步的实验证实了这一推测. 当GAL4结合结构域与QRAP2 N 端112个氨基酸残基融合表达时, 可以激活LacZ 的表达; 而GAL4结合结构域与QRAP2 C 端113~292位氨基酸残基融合表达时, 不能激活LacZ 的表达.综上所述, QRAP2是拟南芥中受干旱、紫外线照射、脱落酸、高盐以及水杨酸等多种胁迫条件诱导的论文第50卷 第17期 2005年9月图2 不同胁迫条件下拟南芥QRAP2的表达谱分析(a) 不同胁迫条件下QRAP2的RT-PCR 结果; (b) 不同胁迫条件下QRAP2的Real-time RT-PCR(QRT-PCR)结果. 图中纵坐标为QRAP2在经胁迫条件处理的样本中的相对表达量与未处理样本(CK)中相对表达量的比值图3 不同干旱时间处理后拟南芥QRAP2的表达谱分析(a) 不同干旱时间处理后QRAP2的RT-PCR 结果; (b) 不同干旱时间处理后QRAP2的QRT-PCR 结果. 图中纵坐标为QRAP2不同干旱时间处理下样本中的相对表达量与未处理样本(0 h)中相对表达量的比值AP2/EREBP 转录因子家族新基因, 经干旱诱导后其表达量在短时间内迅速升高超过400倍, 而其编码蛋白具有特异结合DRE 元件和转录激活活性, 极有可能作为转录因子在胁迫条件下参与激活下游相关应答基因从而在植物抗逆过程中发挥关键性作用.AP2/EREBP 家族转录因子的许多成员参与了植物抗逆反应, 如已报道的CBF 成员参与植物低温胁迫反应, DREB2A, DREB2B 参与植物干旱、高盐胁迫反应, ABI4 参与ABA 依赖型的转录调控过程. 这些基因大部分在正常条件下表达量较低, 受到相应胁图4 QRAP2 蛋白与DNA 元件结合能力分析1, GST 与DRE 混和; 2, QRAP2蛋白与DRE 混和; 3, QRAP2蛋白与DRE2混和; 4, QRAP2 蛋白与mDRE 混和; 5, QRAP2 蛋白与GCC 混和图5 酵母单杂交鉴定QRAP2转录激活活性将图中所示的基因或基因片段分别克隆到pYF503中(GAL4 AD 为GAL4 激活结构域, empty vector 表示无基因克隆到pYF503中), 转入酵母中表达N 端带有GAL4 DNA 结合结构域的融合蛋白, 按文献[22]所示方法进行分析迫条件的诱导后表达. 由于它们能够识别特定的DNA 顺式元件并具有转录激活活性, 能激活相应的效应基因从而作出对胁迫条件的应答. 大多数已研究的转录调控因子基因在过表达植株中均能上调含相应特定DNA 启动子元件的效应基因的表达, 如AP2/EREBP 家族转录因子CBF 提高转基因植物耐冷性就是通过诱导COR 基因高表达而实现的[28]. 本研究表明, 对此类转录因子基因功能的研究将有助于第50卷第17期 2005年9月论文阐明植物胁迫应答的调控机理.致谢本工作为国家自然科学基金资助项目(批准号: 30221120261).参考文献1 Schäffner A R. 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