第2单元 免疫沉淀类实验
免疫琼脂沉淀实验报告
免疫琼脂沉淀实验报告本实验旨在通过免疫琼脂糖凝胶电泳（immunoprecipitation assay）方法来检测和分离特定抗原在混合蛋白质溶液中的存在，进而分析其在免疫反应中的重要性和功能。
实验原理：免疫琼脂沉淀是一种通过特异性抗体与靶标抗原结合来实现蛋白质分离的方法。
在实验中，我们首先将样本中的混合蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，将这些复合物与琼脂糖糊混合并注射到凝胶电泳槽中进行电泳。
在电泳过程中，抗原-抗体复合物会随着电场的作用向阳极方向迁移，并在凝胶中被固定下来，形成凝胶沉淀带。
通过此方法，我们可以将特定抗原从混合蛋白质中分离出来，并进一步进行鉴定和分析。
实验步骤：1.准备样本：将待检测的混合蛋白质样本制备好，并将其加入含抗原特异性抗体的试管中，形成抗原-抗体复合物。
2.制备琼脂糖糊：制备好5%的琼脂糖糊，加入蛋白质凝胶电泳缓冲液，混合均匀。
3.注射样品：将混合蛋白质样品与琼脂糖糊混合，然后使用注射器将其注入凝胶电泳槽中。
4.进行电泳：设置适当的电场强度和电泳时间，开始电泳。
5.固定凝胶：电泳结束后，将凝胶固定在特定位置，一般使用甲醛等物质进行固定。
6.染色和分析：根据需要，可以使用不同的染色方法对凝胶进行染色，然后使用分析软件或显微镜等设备分析和测量抗原-抗体复合物的大小和相对含量。
实验结果：通过免疫琼脂糖凝胶电泳实验，我们成功地分离和检测到了特定抗原-抗体复合物。
在分析结果中，我们可以观察到在琼脂糖凝胶电泳槽中形成了抗原-抗体复合物的凝胶沉淀带，并且可以通过染色方法对其进行染色，进一步加深对目标蛋白质的分析。
实验讨论和结论：免疫琼脂糖凝胶沉淀实验是一种常用的分离和检测特定抗原的方法。
它通过特异性抗体与抗原的结合，能够实现对目标蛋白质的分离和检测。
该方法相对简单、快速，并且具有较高的特异性和敏感性。
然而，我们在实验过程中需要注意的是选择合适的抗体和琼脂糖凝胶，以确保实验的准确性和可靠性。
免疫共沉淀实验原理及详细步骤
免疫共沉淀实验原理及详细步骤免疫沉淀（immunoprecipitation，简称IP）是一种广泛应用于生物学和生物化学研究中的实验方法，用于检测和分离复合物中的特定蛋白质。
它结合了特异性抗体与蛋白质-抗体相互作用的原理，利用抗体选择性地沉淀出目标蛋白质，并与其相关的复合物。
本文将详细介绍免疫共沉淀实验的原理及步骤。
免疫共沉淀实验利用抗体与目标蛋白质相互结合的特异性，通过该特异性结合，将目标蛋白质及其相关的复合物选择性地沉淀出来。
该实验主要包括以下几个步骤：1.抗体与抗原的结合：在实验中，需要选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。
2.抗体与蛋白质-抗体复合物的沉淀：将抗体结合的蛋白质与复合物从样本中沉淀。
3.洗涤：洗涤沉淀的复合物，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
4.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。
1.细胞预处理：在进行免疫共沉淀实验之前，需要将细胞或组织进行必要的处理，例如刺激剂的刺激或疾病模型的建立。
可以选择不同条件下的实验处理组和对照组进行对比。
同时，还需要对实验样本进行适当的裂解，以确保目标蛋白质的充分释放。
2.抗体选择：选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，也可以是特异性抗体。
此外，需要选择适当的免疫沉淀试剂盒，确保实验的准确性。
3.抗原结合：将适当的抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。
这一步骤可以在实验前进行或将其加入样本中进行。
为确保抗原-抗体结合的充分性，可以进行一定的反应时间和反应温度。
4.免疫沉淀：将抗原-抗体复合物选择性地沉淀出来。
可以采用多种方法进行免疫沉淀，例如蛋白A/G琼脂糖，特效筛选柱等。
通过离心或过滤等方式从沉淀中收集复合物。
5.洗涤：洗涤步骤用于去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
洗涤液的组成可以根据实验需要进行调整。
洗涤步骤需要进行多次，确保洗涤得到干净的复合物。
6.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。
免疫沉淀实验原理
免疫沉淀实验原理
免疫沉淀实验是一种常见的生物学实验方法，主要用于分离和富集含有特定蛋白质的物质。
下面将介绍该实验的原理。
一、免疫沉淀实验的基本原理
免疫沉淀实验基于抗原与特异性抗体的相互作用关系，实现对目标蛋白质的富集。
该实验通常包括以下步骤：
1. 抗原与抗体的结合
在样本中加入特异性抗体，让其与待分离的蛋白质结合形成免疫复合物。
2. 富集免疫复合物
加入一定量的胶体（如聚丙烯酰胺凝胶），通过离心或过滤等方式，将形成的免疫复合物与非特异蛋白质分离。
3. 分析蛋白质
将富集得到的免疫复合物进行进一步的分析，如Western blot、质谱鉴
定等。
二、免疫沉淀实验的优点
1. 可以选择与特定抗体结合的蛋白质，并去除大量并非兴趣蛋白的杂质。
2. 对于目标蛋白含量低的样本，免疫沉淀实验可以提高其检测的灵敏度。
3. 具有良好的特异性和选择性，可以避免其他方法的假阳性结果。
4. 可以分离出兼具活性和稳定性的蛋白质。
三、免疫沉淀实验的注意事项
1. 需要选择高质量的抗体，以确保免疫复合物的特异性和稳定性。
2. 实验条件要求严格，包括抗体、反应物、离心速度和时间等方面。
3. 免疫沉淀实验需要一定的经验和操作技巧，如样品处理、自制抗体及其金标记反应。
4. 需要对结果进行验证和比对，并结合其他实验结果进行解释。
以上是免疫沉淀实验的原理、优点以及需要注意的事项，了解清楚这
些信息可以让我们更好地开展免疫沉淀实验，并取得准确可靠的结果。
第二单元 免疫沉淀类实验汇总
北华大学
王雪松
实验二 单向免疫扩散试验
实验原理
将一定量的羊抗人 IgG 抗血清成分混合于琼脂凝胶 中，制成含有特异性羊抗人IgG抗血清的琼脂板，待凝 固后打孔，并在相应孔中加入待检人血清IgG。使待检 血清在琼脂板中向四周呈环状扩散，在两者浓度比例恰 当处形成肉眼可见的白色沉淀环，沉淀环的直径或面积 与待检人血清浓度呈正相关。同时用标准免疫球蛋白或 国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测人血清 IgG浓度。
温育
结果判断
以出现沉淀线的正常人血清最高稀释度为
人血清IgG的扩散效价。
实验讨论
该方法简便易行，结果稳定可靠。根据抗原抗体相遇 后所出现沉淀线的特征，对其进行定性分析。若相邻两孔 内抗原成分完全相同，则形成完全相连的两条沉淀线；若 抗原完全不同，则形成交叉的两条沉淀线；若抗原部分相 同，则形成部分相连的两条沉淀线；当抗原存在多种成分 时，则呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可根据沉淀 线的位置、形状、数目等，初步分析抗原和抗体的纯度、 浓度、扩散速度等理化性状。该方法除用于血清IgG的检 测以外，还曾用于诊断和分析某些疾病，如检测AFP、 HBsAg等，但敏感度低所需时间长。
实验方法
制备抗体琼脂凝胶:用生理盐水配置10～15g/L琼脂，加 0.01%（0.1g/L）NaN3，隔水加热煮沸琼脂，置56℃水浴 中备用。吸取99ml已融化的琼脂于三角烧瓶中，置56℃水 浴中保温，将预温的羊抗人IgG抗血清1ml与琼脂充分混合， 继续保温于56℃水浴中备用。 浇板:将清洁干燥的载玻片置于水平台上，用吸管吸取充分 混匀的抗体琼脂4~4.5ml倾注于玻片上，置室温冷却凝固。 要求浇板时要均匀、平整、无气泡、薄厚均匀。 打孔:待琼脂凝固后，用打孔器打孔，孔径3mm，孔距 10~12mm。要求孔打得圆整光滑，孔缘不能破裂，底部勿 与玻片分离。
深层次了解免疫共沉淀(CoIP)
一、免疫共沉淀实验免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP），是以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
区别于IP实验，CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）二实验过程1、提取蛋白。
2、在细胞裂解液中加入抗X的抗体。
3、孵育后再加入ProteinA或G（于Agarose或magneticbeads等介质上）。
若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“Y—X—抗X抗体一ProteinA或G"4、经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开°（xy抗原、x抗体）。
5、westernblot分析，质谱分析。
三、CO-IP特征优点：1、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态。
2、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。
3、可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
局限性：1、可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用2、两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用；3、必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果四、实验的关键1、实验最需要注意点就是抗体的性质。
特别是多抗的特异性是问题。
2、为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。
3、考虑抗体/缓冲液的比例。
抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。
缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
4、确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
五、注意的问题：1、裂解液(1)、细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂(NP40或TritonX-100)。
免疫共沉淀实验方法
免疫共沉淀实验方法免疫共沉淀实验方法是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，通过利用抗体与目标蛋白之间的特异性结合来寻找与目标蛋白相互作用的蛋白质。
下面将详细介绍免疫共沉淀实验方法的步骤和注意事项。
步骤一：制备样品首先需要制备含有目标蛋白的样品，可以是细胞提取物、组织提取物或纯化的蛋白。
样品需要在低温下保存，并在实验前加入适量的蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂以保持蛋白的完整性。
步骤二：制备抗体制备抗体需要选择与目标蛋白特异性结合的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
抗体需要在低温下保存，并在实验前进行免疫球蛋白纯化和浓度调整。
步骤三：免疫共沉淀实验1. 将制备好的样品加入到含有抗体的蛋白A/G琼脂糖中，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置2小时或过夜。
2. 将混合物加入到预先平衡好的蛋白A/G琼脂糖中，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置2小时或过夜。
3. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
4. 重复步骤3，洗涤3次。
5. 加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
6. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
7. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
8. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
9. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
10. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
11. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
12. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
13. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
免疫沉淀反应实验报告
免疫沉淀反应实验报告免疫沉淀反应实验报告免疫沉淀反应是一种常用的实验方法，用于检测特定抗原与抗体之间的相互作用。
本实验旨在通过免疫沉淀反应，探究抗原与抗体之间的结合情况，从而深入了解免疫系统的工作原理。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 抗原样品：选择目标抗原，如蛋白质或细胞表面分子。
- 抗体：选择与目标抗原特异性结合的抗体。
- 免疫沉淀缓冲液：用于提供适宜的反应环境。
- 洗涤缓冲液：用于去除非特异性结合物。
- SDS-PAGE凝胶：用于分离蛋白质。
- 蛋白质标记的二抗：用于检测目标抗原与抗体的结合。
- 蛋白质标记的探针：用于检测目标抗原的存在。
2. 实验方法：- 步骤一：制备免疫沉淀复合物将抗原样品与特异性抗体加入免疫沉淀缓冲液中，孵育一段时间，使抗原与抗体结合形成免疫沉淀复合物。
- 步骤二：免疫沉淀将免疫沉淀复合物加入待测样品中，使目标抗原与抗体结合，形成沉淀物。
- 步骤三：洗涤使用洗涤缓冲液洗涤沉淀物，去除非特异性结合物。
- 步骤四：蛋白质分离将洗涤后的沉淀物进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白质分离。
- 步骤五：蛋白质检测使用蛋白质标记的二抗与蛋白质标记的探针，检测目标抗原的存在。
实验结果与讨论：通过免疫沉淀反应实验，我们成功地观察到了抗原与抗体之间的结合现象。
在实验中，我们选择了一种特定的抗原，并与其特异性结合的抗体进行反应。
在免疫沉淀复合物形成后，我们将其加入待测样品中，并进行了洗涤和蛋白质分离的步骤。
通过SDS-PAGE凝胶电泳，我们成功地将目标抗原与抗体结合的蛋白质分离出来。
接下来，我们使用蛋白质标记的二抗与蛋白质标记的探针，对目标抗原进行了检测。
结果显示，目标抗原的存在得到了确认，进一步验证了抗原与抗体之间的结合情况。
这个实验结果对于研究免疫系统的工作原理具有重要意义。
免疫系统是人体抵御外界病原体入侵的重要防线，而抗原与抗体之间的结合是免疫系统中的关键步骤。
通过深入了解抗原与抗体的相互作用，我们可以更好地理解免疫系统的工作机制，为疾病的预防和治疗提供理论依据。
实验-免疫沉淀反应简写版
Immunology
4. 小心打孔，勿使琼脂层脱离玻片，或底 层开裂；打孔要一次打到底，挑胶时要 细心，最好一次性挑出。
5. 加样加满即可，勿使液体溢出。 6. 为使沉淀线保持清晰度，可将已形成的
沉淀线琼脂板放在4℃冰箱。
Immunology
21
双向免疫扩散--人IgG检测
结果描述与分析
该法常用于分析血清蛋白种类。
Immunology
(immunoelectrophoresis)
3.
Immunology
免疫比浊(immunonephelometry)
一定量抗体中分别加入递增量的抗原， 经一定时间形成免疫复合物，液体混 浊。用浊度计测量反应体系的浊度， 可绘制标准曲线并依据浊度推算样品 中抗原含量。
几分钟至十几分钟 凝集块
沉淀反应 可溶性抗原 数小时至数天
沉淀物
Immunology
原理：
凝胶内沉淀试验
将可溶性抗原与相应分别放入凝胶（如琼脂、 琼脂糖等）内进行扩散，形成浓度梯度，在抗 原抗体浓度比例恰当的位置，形成肉眼可见的 免疫沉淀线、沉淀环。
分类：
①单向琼脂扩散试验(single gel diffusion test) ②双向琼脂扩散试验(double gel diffusion test）
将抗原和抗体分别加入琼脂板相对应的小孔 中，二者相互扩散、相遇，在比例合适处形成可 见的沉淀线。
Immunology
(double immunodiffusion)
Immunology
对流免疫电泳
当抗原和抗体在琼脂介质中电泳时 ， 由于抗体的 PI 比较高，在适当的 pH 值下， 抗体带正电荷而抗原带负电荷，故在电场中 抗体向阴极方向移动而抗原向阳极运动，直 至相遇后形成沉淀线
免疫沉淀实验原理及步骤
免疫沉淀实验原理及步骤嘿，咱今儿就来聊聊免疫沉淀实验这档子事儿！这免疫沉淀实验啊，就好比是一场精准的捕捞行动。
你想啊，细胞里面那可是个热闹的小世界，各种蛋白质啊就像一群小鱼在里面游来游去。
咱要研究其中的某一种蛋白质，那可不得想个法子把它单独拎出来嘛！这免疫沉淀实验就是咱的秘密武器啦！先来说说原理哈。
简单说，就是利用抗体这个厉害的“捕鱼网”，去专门抓住我们想要的那种蛋白质。
这抗体可神奇了，它就像有一双火眼金睛，能准确无误地和目标蛋白质结合在一起。
然后呢，我们再通过一些手段，把这个带着目标蛋白质的“抗体-蛋白质复合物”给沉淀下来，这不就把目标给抓住啦！那具体步骤是咋样的呢？听我细细道来。
第一步，得准备好咱的“捕鱼工具”，也就是抗体啦。
这抗体可得选对喽，不然可就白忙活啦！然后把细胞裂解，让那些蛋白质都跑出来，这就相当于把小鱼们都赶到大海里啦。
第二步，把抗体加进去，让它去寻找目标蛋白质，这就开始捕鱼行动咯！等它们结合好了，就形成了那个复合物。
第三步，加入一些能让复合物沉淀下来的东西，就像撒下一张大网，把它们一网打尽。
第四步，把沉淀下来的东西收集起来，这可就是我们的宝贝啦！然后通过各种检测手段，去看看我们抓到的是不是我们想要的那条“鱼”。
你说这免疫沉淀实验是不是很有意思呀？就像一场充满挑战和惊喜的冒险！它能帮助我们深入了解细胞里那些神秘的蛋白质，解开好多生物学的谜团呢！在做这个实验的时候啊，可得细心再细心，就像渔夫捕鱼一样，稍有疏忽可能就错过了好猎物。
而且要注意各种条件的控制，温度啦、时间啦，都得把握好，不然可就前功尽弃啦！总之呢，免疫沉淀实验是生物学研究中非常重要的一个手段，它让我们能更近距离地观察和研究那些神奇的蛋白质。
怎么样，听我这么一说，是不是对免疫沉淀实验有了更清楚的认识啦？赶紧去试试吧，说不定你就能发现新的秘密呢！。
免疫共沉淀实验流程及步骤
免疫共沉淀实验流程及步骤
1) 制备细胞裂解液：收集4x107细胞，用PBS洗涤后，加入1 ml RIPA buffer(含蛋白酶抑制剂)，充分混匀，冰上裂解30 min;4℃，12000 rpm离心10 min，收集上清液。
2) 免疫共沉淀：在细胞裂解液中加入50 μl 50% Protein A/G Beads，4℃翻转混合孵育1 h进行预清除，离心后取0.5 ml上清液，加入3 μg诱饵蛋白X抗体，另取0.5 ml上清液加入等量同源的IgG 抗体作为对照，4℃摇晃结合过夜;第二天每管加入50 μl 50% ProteinA/G Beads，4℃摇晃结合3 h;用RIPA Buffer洗涤5次，每次5 min。
3) Western Blot分析或MS质谱分析：沉淀中加入25 μl 2×SDS loading Buffer，煮沸10 min后离心取上清，用靶蛋白Y的抗体进行Western Blot分析，以检测目标蛋白是否存在相互作用;或进行MS质谱分析，以找到更多与诱饵蛋白X在体内存在相互作用的蛋白。
第2单元 免疫沉淀类实验概要
实验器材和材料
试剂： 待检人血清、免疫球蛋白工作标准（IgG含量为 10.10mg/ml）、羊抗人IgG抗血清（单扩效价1:100）、琼 脂糖或琼脂粉、生理盐水、NaN3 。 仪器： 水浴箱、温箱 。 材料： 载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸球、三角烧 瓶、湿盒半对数坐标纸等 。
免疫浊度分析系统基本技术流程图
开机 依次打开主机电源、电脑及打印机开关，仪器自行启动， 完成初始化和自检，即可开始工作
参数设置
设置仪器项目和单位等相关参数
试剂装载
将试剂盒放入试剂舱内，根据已定程序扫描相关信息
校准
按已设定的参数和程序进行校准
标本装载
将标本放入标本架，根据已定程序输入工作单
标本测定
按已设定的参数和程序进行测定
实验三
对流免疫电泳
实验原理
在偏碱性的缓冲液和适当的直流电场中，抗原和抗 体的扩散具有一定的特点。在pH8.6以上的缓冲液中，大 部分蛋白质抗原解离带负电荷，在电场中向正极泳动； 而大部分抗体属于 IgG ，在此种 pH 条件下只带微弱的负 电荷，由于其分子量大，暴露的极性基团少，在电场中 泳动缓慢，且受电渗作用的影响，带正电荷的液体推动 抗体分子向负极泳动。由此抗原、抗体就达到了定向对 流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的白色沉 淀线。
在试验过程中，通过类似双扩的方法，观察各种抗原和 抗体之间的反应及变化。
1 2
玻片上方两孔分别为未处理抗原（1）和未处理抗原制备的抗体（2）； 玻片下方两孔分别为处理后抗原制备的抗体（3）和处理后抗原（4）。
3 4
结果讨论提纲
有哪些理化因素能够导致抗原性发生变化，变化的特点和 意义是什么？
加样：用10μl微量加样器分别取抗原、抗体加入孔中。中心孔加入抗体， 周围孔分别加入不同稀释度的抗原。 温育：将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，37℃温箱温育24h，观察 沉淀线。
免疫共沉淀原理及实验方法
免疫共沉淀原理及实验方法1.利用抗体的高度特异性与抗原结合，将抗原特异性地富集。
2.抗原-抗体复合物与磁珠或珠标记结合，通过磁力或离心作用将复合物分离沉淀下来。
1.材料准备：准备所需的细胞或组织样品，以及抗体、磁珠或珠标记等实验试剂。
2.细胞或组织提取：将细胞或组织样品裂解，并用适当的缓冲液重悬，获得蛋白质提取液。
3.抗体结合：将蛋白质提取液与所需的抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.沉淀：将磁珠或珠标记加入抗原-抗体复合物中，使其结合，再利用磁力或离心作用将复合物沉淀下来。
5.洗涤：用适当的缓冲液洗涤沉淀物，去除非特异性的蛋白质。
6. 分离与检测：将沉淀物分离出来并进行进一步的分析、检测，如Western blotting、质谱分析等。
1.高特异性：通过使用特异性抗体，可以选择性地沉淀目标蛋白质，减少非特异性的干扰。
2.高灵敏度：沉淀后的蛋白质富集度高，有利于进一步的鉴定和分析。
3.可用于分析蛋白质相互作用：通过免疫共沉淀技术，可以研究蛋白质与其他分子的相互作用关系，揭示机体内蛋白质功能和信号传导的调控机制。
免疫共沉淀技术在生命科学研究中扮演着重要的角色。
例如，通过免疫共沉淀可以研究蛋白质与DNA、RNA或其他蛋白质的相互作用关系，从而了解基因调控、信号传导和代谢途径等重要生物学过程的调控机制。
此外，免疫共沉淀还可以用于筛选靶蛋白质、鉴定疾病标志物，以及评估一些药物对蛋白质相互作用的影响。
综上所述，免疫共沉淀技术是一种重要的实验方法，通过利用特异性抗体与所要研究的蛋白质结合，实现蛋白质的富集、分离和鉴定。
该技术广泛应用于细胞生物学、分子生物学和疾病研究等领域，对揭示分子相互作用、信号传导机制和疾病发生发展具有重要意义。
免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法
免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作方法实验原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如protein A/G特异性地结合到免疫球蛋白（抗体）FC片段的现象而开发出来的特异分离富集抗原的方法。
目前多用预先结合固化在Agarose beads上的protein A/G（Agrose-proteinA/G），使之与抗体结合，再通过抗体特异性结合抗原而形成Agrose-proteinA/G 、抗体、抗原复合物，利用Agarose beads的重量，通过离心即可特异分离富集目的抗原。
实验步骤：1.处理细胞：依据实验目的，设计实验，处理好细胞模型。
一般3×106细胞/处理(即六孔板一个孔，约200ug总蛋白)。
2.配IP 裂解液：200ul/孔（6孔板），并加入蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂。
注意抑制剂的要现加现用。
3.收集细胞：冰上操作，裂解细胞前用1×PBS（4度）洗1遍，每孔加入200ul IP裂解液，冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中。
4.超声：强度37％，5秒×4次（程序07）。
目的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA,但可能会影响蛋白质之间的相互作用，进行共免疫沉淀实验时要注意这一点。
5.离心细胞裂解液：4度10000rpm 10 分钟。
6.Agrose-proteinA/G清洗：一般1ug抗体对应15ul Agrose-proteinA/G（不同公司产品可能不同，注意结合说明书及实验结果考虑），预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G用量与结合抗体的用量一致。
取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪枪头）并用500ul1×PBS（4度）洗两遍，5000rpm×2分钟，吸掉上清备用。
免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法
免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作方法实验原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如protein A/G特异性地结合到免疫球蛋白（抗体）FC片段的现象而开发出来的特异分离富集抗原的方法。
目前多用预先结合固化在Agarose beads上的protein A/G（Agrose-proteinA/G），使之与抗体结合，再通过抗体特异性结合抗原而形成Agrose-proteinA/G 、抗体、抗原复合物，利用Agarose beads的重量，通过离心即可特异分离富集目的抗原。
实验步骤：1.处理细胞：依据实验目的，设计实验，处理好细胞模型。
一般3×106细胞/处理(即六孔板一个孔，约200ug总蛋白)。
2.配IP 裂解液：200ul/孔（6孔板），并加入蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂。
注意抑制剂的要现加现用。
3.收集细胞：冰上操作，裂解细胞前用1×PBS（4度）洗1遍，每孔加入200ul IP裂解液，冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中。
4.超声：强度37％，5秒×4次（程序07）。
目的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA,但可能会影响蛋白质之间的相互作用，进行共免疫沉淀实验时要注意这一点。
5.离心细胞裂解液：4度10000rpm 10 分钟。
6.Agrose-proteinA/G清洗：一般1ug抗体对应15ul Agrose-proteinA/G（不同公司产品可能不同，注意结合说明书及实验结果考虑），预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G用量与结合抗体的用量一致。
取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪枪头）并用500ul1×PBS（4度）洗两遍，5000rpm×2分钟，吸掉上清备用。
免疫沉淀类实验
结果判定： 待测标本中所含抗原量根据标本孔的沉淀环直径查
标准曲线，将查得的Ig含量乘以标本的稀释倍数，即待 检标本血清中Ig的实际含量。
实验讨论
单向免疫扩散试验方法简便、易于操作，且重复性和 线性均可信赖。但敏感度稍差，观察结果所需时间较长， 每次需做参考血清对照，不可一次做成，长期使用。应用 此方法除检测人血清IgG 含量外，还可用于健康人群或患 者血清中IgA、IgM 、补体、白蛋白、蛋白酶等蛋白质含 量的定量测定。
? 操作示意图
浇板
打孔 加样 温育
1
2
6
3
5
4
结果判断 中央孔—抗体成分
周围孔—不同稀释度的抗原 成分（第1~5孔）
第6孔—阴性对照
结果判断
以出现沉淀线的正常人血清最高稀释度为 人血清IgG 的扩散效价。
实验讨论
该方法简便易行，结果稳定可靠。根据抗原抗体相遇 后所出现沉淀线的特征，对其进行定性分析。若相邻两孔 内抗原成分完全相同，则形成完全相连的两条沉淀线；若 抗原完全不同，则形成交叉的两条沉淀线；若抗原部分相 同，则形成部分相连的两条沉淀线；当抗原存在多种成分 时，则呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可根据沉淀 线的位置、形状、数目等，初步分析抗原和抗体的纯度、 浓度、扩散速度等理化性状。该方法除用于血清 IgG 的检 测以外，还曾用于诊断和分析某些疾病，如检测 AFP 、 HBsAg等，但敏感度低所需时间长。
北华大学 王雪松
实验三 对流免疫电泳
实验原理
在偏碱性的缓冲液和适当的直流电场中，抗原和抗 体的扩散具有一定的特点。在 pH8.6 以上的缓冲液中，大 部分蛋白质抗原解离带负电荷，在电场中向正极泳动； 而大部分抗体属于 IgG ，在此种 pH 条件下只带微弱的负 电荷，由于其分子量大，暴露的极性基团少，在电场中 泳动缓慢，且受电渗作用的影响，带正电荷的液体推动 抗体分子向负极泳动。由此抗原、抗体就达到了定向对 流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的白色沉 淀线。
病原生物与免疫学实验免疫实验二：沉淀反应与溶血试验
Ab
？
Ag
标本
阳性对照
Ab
？
Ag
：标本中无Ag
Ab
？
Ag
：标本中有Ag （相同抗原?）
2、双向琼脂扩散试验（定性） （请按照实验指导讲义方法进行操作）来自Ab？Ag
标本
阳性对照
Ab
？
Ag
：标本中无Ag
Ab
？
Ag
：标本中有Ag （相同抗原）
1. Make a agar plate (without Ab or Ag)
溶血素 SRBC
不溶血 （标本中有 Ag）
？ 无Ag Ab
补体
溶血素 SRBC
溶血 （标本中无 Ag）
无沉淀线：无Ag，无AFP）
（二）补体参与的免疫反应
1、溶血反应
补体 SRBC + Ab
SRBC-Ab
（溶血素）
溶血
请按照实验指导讲义方法进行操作
2人/组 注意观察溶血现象 请分析：为何第3、4管不溶血，分别缺什么成分？
2、补体结合试验（检测原理）
反应系统（待测系统）
？ 有Ag Ab
补体
指示系统
？
Ag
：no Ag(AFP) in sample serum
Ab
？
Ag ：same Ag(AFP) in sample serum
Result (2): Ag Ab Ag
：no Ag(AFP) in sample serum
Ag
?
?
Ab
?
?
Ag
：same Ag(AFP) in sample serum
＋
Ab
Ag
－ pH 8.6
免疫沉淀实验方法
免疫沉淀实验方法
免疫沉淀（immunoprecipitation）是一种用于检测蛋白质-蛋白质或蛋白质-RNA相互作用的实验方法。
下面是一种常见的免疫沉淀实验步骤：
1.细胞裂解：将需要研究的细胞或组织裂解，释放内部的蛋白质。
常用的裂解缓冲液包括RIPA缓冲液或NP-40缓冲液。
2.抗体结合：将目标蛋白的特异性抗体加入细胞裂解物中，使抗体与目标蛋白结合。
3.免疫沉淀：加入蛋白A/G琼脂糖或磁珠，使其与抗体结合，形成免疫复合物。
通过离心或磁珠分离的方式，将免疫复合物从细胞裂解物中抽取出来。
4.洗涤：将免疫复合物用洗涤缓冲液多次洗涤，去除非特异性结合的蛋白质。
5.洗脱：用洗脱缓冲液溶解免疫复合物，将目标蛋白质从蛋白A/G琼脂糖或磁珠上洗脱下来。
6.蛋白质分析：用SDS-PAGE电泳和蛋白质染色、Western blot等方法，对洗脱的目标蛋白进行分析。
除了上述基本步骤外，实验过程中可能需要根据具体要求进行一些优化操作，例如对裂解条件、抗体选择和洗涤条件等进行调整。
免疫沉淀反应实验报告
免疫沉淀反应实验报告沉淀实验实验报告实验一自由沉淀实验一、实验目的(1)加深对自由沉淀特点、基本概念及沉淀规律的理解;(2)掌握颗粒自由沉淀的实验方法;(3)对实验数据进行分析、整理、计算和绘制颗粒自由沉淀曲线。
二、实验原理如果不明白也可以仔细阅读课本p33的内容。
浓度较稀的、粒状颗粒的沉淀属于自由沉淀，其特点是静沉过程中颗粒互不干扰、等速下沉，其沉速在层流区符合stokes(斯笃克斯)公式。
非絮凝性或弱絮凝性固体颗粒在稀悬浮液中的沉淀，属于自由沉淀。
由于悬浮固体浓度低，而且颗粒之间不发生聚集，因此在沉降过程中颗粒的形状、粒径和密度都保持不变，互不干扰地各自独立完成匀速沉降过程。
自由沉淀实验一般在沉淀柱里进行，其直径应足够大，一般应使d?100mm，以免颗粒沉淀受柱壁干扰。
在沉淀柱内，某个沉淀时长t对应着一个颗粒沉速u0 = h / t。
此时颗粒物的总去除效率为e?(1?p0)?1u0?p00udp式中 e----总沉淀效率;p0----沉速小于u0的颗粒在全部悬浮颗粒中所占的百分数(也就是我们测定的残留率);1-p0----沉速大于或等于u0的颗粒去除百分数;u0----某一指定颗粒的最小沉降速度;u----小于最小沉降速度u0的颗粒沉速。
工程上常用下式计算e?(1?p0)??p?u u0三、实验设备与试剂1. 沉淀用有机玻璃柱，内径d=150mm，高h=1700mm。
工作水深即由柱内液面至取样口的距离。
2. 配水系统一套。
3. 计量水深用标尺、计时用秒表;4. 本实验使用浊度来代替悬浮物的测定。
1四、实验步骤按照实际的实验步骤来写，下面的是参考。
1. 检查沉淀装置连接情况、保证各个阀门完全闭合;各种用具是否齐全。
3. 准备实验用原水。
先将一定量的高岭土和自来水投入到配水箱中，然后启动搅拌装置使分散均匀。
4. 配水箱中水质均匀后，启动水泵，同时打开进水管及沉淀柱底部的放空阀门，适当冲洗管路中的沉淀物。
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实验器材和材料
❖ 试剂： 人血清、抗人血清、 pH8.6 0.05mol/L巴比妥缓冲液 、用 巴比妥缓冲液配置1%琼脂 。
❖ 仪器： 电泳槽、电泳仪、水浴箱 。
❖ 材料： 孔型模板、打孔器、滤纸、纱布条、微量加样器、载玻片、 吸管、吸球等 。
❖ 扩散:将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，37℃温箱温育 24h，观察结果。如果沉淀环不清晰，可用生理盐水浸泡 2~3h。
❖操作示意图
浇板
打孔 加样
扩散
1234
5 6 78 结果判断 第1、2、3、4、5孔—标准蛋白 第6、7孔—待检抗原 第8孔—阴性对照
结果判断
绘制标准曲线： 以各稀释度工作标准的沉淀环直径为横坐标，相应
❖ 操作示意图
浇板
打孔 加样
温育
1
2
6
3
5
4
结果判断
中央孔—抗体成分
周围孔—不同稀释度的抗原 成分（第1~5孔）
第6孔—阴性对照
结果判断
以出现沉淀线的正常人血清最高稀释度为 人血清IgG的扩散效价。
实验讨论
该方法简便易行，结果稳定可靠。根据抗原抗体相遇 后所出现沉淀线的特征，对其进行定性分析。若相邻两孔 内抗原成分完全相同，则形成完全相连的两条沉淀线；若 抗原完全不同，则形成交叉的两条沉淀线；若抗原部分相 同，则形成部分相连的两条沉淀线；当抗原存在多种成分 时，则呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可根据沉淀 线的位置、形状、数目等，初步分析抗原和抗体的纯度、 浓度、扩散速度等理化性状。该方法除用于血清IgG的检 测以外，还曾用于诊断和分析某些疾病，如检测AFP、 HBsAg等，但敏感度低所需时间长。
第二单元
免疫沉淀实验
实验一 双向免疫扩散试验
实验原理
在琼脂凝胶中，待检人血清IgG和羊抗人 IgG抗血清在不同孔内各自向四周扩散，在比例 恰当处形成肉眼可见的白色沉淀线，证明两者 发生特异性结合反应。
实验器材和材料
❖试剂 健康人血清，用生理盐水做1:5~1:40系列倍比稀释 、羊抗 人IgG抗血清、10~15g/L琼脂糖或琼脂粉 。
பைடு நூலகம் 实验器材和材料
❖ 试剂： 待检人血清、免疫球蛋白工作标准（IgG含量为 10.10mg/ml）、羊抗人IgG抗血清（单扩效价1:100）、琼 脂糖或琼脂粉、生理盐水、NaN3 。
❖ 仪器： 水浴箱、温箱 。
❖ 材料： 载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸球、三角烧 瓶、湿盒半对数坐标纸等 。
北华大学 王雪松
实验三 对流免疫电泳
实验原理
在偏碱性的缓冲液和适当的直流电场中，抗原和抗 体的扩散具有一定的特点。在pH8.6以上的缓冲液中，大 部分蛋白质抗原解离带负电荷，在电场中向正极泳动； 而大部分抗体属于IgG，在此种pH条件下只带微弱的负 电荷，由于其分子量大，暴露的极性基团少，在电场中 泳动缓慢，且受电渗作用的影响，带正电荷的液体推动 抗体分子向负极泳动。由此抗原、抗体就达到了定向对 流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的白色沉 淀线。
实验方法
❖ 制备抗体琼脂凝胶:用生理盐水配置10～15g/L琼脂，加 0.01%（0.1g/L）NaN3，隔水加热煮沸琼脂，置56℃水浴中 备用。吸取99ml已融化的琼脂于三角烧瓶中，置56℃水浴 中保温，将预温的羊抗人IgG抗血清1ml与琼脂充分混合， 继续保温于56℃水浴中备用。
❖ 浇板:将清洁干燥的载玻片置于水平台上，用吸管吸取充分 混匀的抗体琼脂4~4.5ml倾注于玻片上，置室温冷却凝固。 要求浇板时要均匀、平整、无气泡、薄厚均匀。
孔中的IgG含量为纵坐标，在半对数纸上按Fahey法绘 制出标准曲线。
结果判定： 待测标本中所含抗原量根据标本孔的沉淀环直径查
标准曲线，将查得的Ig含量乘以标本的稀释倍数，即待 检标本血清中Ig的实际含量。
实验讨论
单向免疫扩散试验方法简便、易于操作，且重复性和 线性均可信赖。但敏感度稍差，观察结果所需时间较长， 每次需做参考血清对照，不可一次做成，长期使用。应用 此方法除检测人血清IgG含量外，还可用于健康人群或患 者血清中IgA、IgM、补体、白蛋白、蛋白酶等蛋白质含 量的定量测定。
北华大学 王雪松
实验二 单向免疫扩散试验
实验原理
将一定量的羊抗人IgG抗血清成分混合于琼脂凝胶 中，制成含有特异性羊抗人IgG抗血清的琼脂板，待凝 固后打孔，并在相应孔中加入待检人血清IgG。使待检 血清在琼脂板中向四周呈环状扩散，在两者浓度比例恰 当处形成肉眼可见的白色沉淀环，沉淀环的直径或面积 与待检人血清浓度呈正相关。同时用标准免疫球蛋白或 国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测人血清 IgG浓度。
❖仪器 水浴箱、温箱 。
❖材料 载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸球、湿盒等 。
实验方法
❖ 制备琼脂凝胶：用生理盐水配置10～15g/L琼脂，隔水加热煮沸备用。 ❖ 浇板：将载玻片置于水平台上，用吸管吸取4~4.5ml融化的琼脂倾注于
玻片上，滴加时注意速度不要过快，要使琼脂盖满整张玻片，使其均匀、 饱满，勿溢出并避免产生气泡。 ❖ 打孔 ：待琼脂凝固后，将梅花形打孔模板置于琼脂板下，用直径3mm 的打孔器打孔，使其孔径为3mm，孔距为4mm，孔要求圆整光滑，孔 缘不能破裂，底部勿与载玻片脱离。 ❖ 加样：用10μl微量加样器分别取抗原、抗体加入孔中。中心孔加入抗体， 周围孔分别加入不同稀释度的抗原。 ❖ 温育：将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，37℃温箱温育24h，观察 沉淀线。
❖ 打孔:待琼脂凝固后，用打孔器打孔，孔径3mm，孔距 10~12mm。要求孔打得圆整光滑，孔缘不能破裂，底部勿 与玻片分离。
❖ 加样:稀释人免疫球蛋白工作标准品：取冻干人免疫球蛋白 工作标准品1支加蒸馏水0.5ml，待完全溶解后，用生理盐 水稀释成不同的稀释度。其稀释范围为1:5、1:10、1:20、 1:40，IgG相应含量为2020、1010、505、252mg/L。稀释 待检血清：将待检血清用生理盐水做1:40稀释。用微量加 样器分别吸取各稀释度的人免疫球蛋白工作标准品10μl加 入到标准抗原孔，制备标准曲线。再用同样的方法吸取已 稀释好的待检血清10μl加入到待检血清孔。