第十章层析分离技术

6 凝胶的保存
A 湿法保存 防腐剂硫柳汞,0.005%,使用时水洗除去; 加入氯仿, 使用时60度水浴除去;
60~70%乙醇溶液。
B 干法保存
凝胶
抽去过量水
加入乙醇（0~95%）
抽干
60~80℃烘干
凝胶层析分离血红蛋白和鱼精蛋白（示教）
• Sephadex G-50凝胶柱及样品准备 • 上样 洗脱 • 观察红色的色带(分子量大的血红蛋白)先 洗脱下来,黄色的色带(分子量小的DNP-鱼 精蛋白)后洗脱下来 • 注意勿搅动床面,避免干柱
二、基本原理
• 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的
差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和
力、分配系数等），使各组分在两相（一相为 固定相，另一相流动相）中的分布程度不同， 从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的 目的。
◆固定 相：
固定相是层析的一个基质，可以是固体物质 （如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体 物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质 能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等 作用。
凝胶层析又称凝胶过滤、分子筛层析、排阻层
析、凝胶渗透层析，等等。以多孔性凝胶填料为
固定相，按分子大小顺序分离样品中各组分的液
相色谱方法。
基本原理
凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的
混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不 能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下 移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能 不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过 的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。
为了精确的衡量混合物中各成分在柱内的洗
脱行为，采用分配系数Kd度量。
Kd = (Ve-Vo) / Vi Ve＝某一成分从层析柱内完全被洗脱出来时 洗脱液的体积 Vo＝层析柱内凝胶颗粒之间空隙的总容积
Vi＝层析柱内凝胶颗粒内部的总容积
1 外水体积V0:
凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体
积，即凝胶颗粒间液体流动相的体积。
取用上述方法制好的薄层板
用毛细管吸少许样品液
距离薄层板一端约1cm处点样
将点好的样晾干或吹干
放入展开槽中展开
取出色层板
实例
叶绿素的柱色谱分离
原理：
绿色植物的叶和茎中含有胡萝卜素(C40H56)、叶黄素
(C40H56O2)、叶绿素a(C55H72MgN4O5)和叶绿素b
(C55H70MgN4O6)。这些色素易被80%丙酮或石油醚－乙醇混 合液萃取，从植物茎、叶中浸提出来。对于浸提出来的 色素混合物，然后采用氧化铝柱色谱(LCC)进行分离。
具有成本低、操作方便、提取率高、设备简单 等优点。 主要应用于蛋白质、氨基酸、核酸、酶等大
极性物质的分离。
（2）离子交换剂
离子交换树脂是人工合成的不溶于酸、碱和有机溶
剂的高分子聚合物，化学性质稳定，具有离子交换 的能力。 包括活性基团和固定基团两部分，活性基团能够移 动，可以与外界离子进行可逆地交换，固定基团构 成树脂的骨架。通式为：R-活性基团
◆流动相：
在层析过程中，推动固定相上待分离的物 质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为 流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析 时称为展开剂。
三、层析法的分类
气相(气-液;气-固)层析 两相所处状态
液相(液-液;液-固)层析
分离机制
薄层吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析
柱层析
操作步骤:
1 层析柱的选择
◆层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要 求来进行选择。 ◆ 长度不超过100 cm，为得到高 分辨率，可串联使用。层析柱的 直径和长度比一般在1:25～1:100 之间。
2 凝胶前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡
24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物
同和展开剂对吸附成分解吸能力的不同，
使各成分达到分离。
b 操作
准备薄层板 点样 展开 检识
取7.5×2.5cm左右的载玻片2片，洗净晾干。
称一定量的硅胶 加入0.5%羧甲基纤维素钠水溶液 涂于洁净的载玻片上， 制成厚薄均匀的薄层板 放入烘箱（110℃）恒温0.5h
调成均匀的糊状 室温放置0.5h 取出，冷却后备用
①有丰富可供活化的化学基团，并在温和条件 下与配基共价结合
② 惰性的，具有多孔网状结构；
③ 具有良好的机械性能和理化稳定性
常见的载体商品：
配基具有的特点：
对欲纯化的生物物质具有专一亲和性；
具有被修饰的功能基团。
（3）操作步骤
寻找配基 共价结合到载体上 装入层析柱内
上样
洗涤杂质
洗脱
再生
收集
与配基亲和性强的洗脱液如：
操作流程
用20mL95% 乙醇浸泡8h 提取液置于 分液漏斗 过滤
取青菜叶
加10mL石油醚
加50mLH2O
加无水硫 酸钠干燥 湿法 装柱 加样品
水洗醚层
静置分层 放出水层
加石油醚-丙酮溶液洗脱
收集洗脱液
硅胶柱操作:(示教)
薄层层析:（示教）
提问:
1 如何装硅胶柱?
2 薄层板如何制作?
2 凝胶柱层析
0<Kd<1 分子部分受阻
凝胶介质
是一种特殊的分散体系，其中胶体颗粒分子链以化
学键连接，形成空间网状结构，液体或气体充满于
结构空隙之中。
天然凝胶（如琼脂糖凝胶）
人工合成凝胶（如葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺 凝胶）
葡聚糖凝胶的特点： 1具有良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中 最常用的凝胶。 2 多聚糖链之间通过1-氯-2,3-环氧丙烷交联而成。 3 葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖 的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小， 吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨 胀就越大 4 具有弱酸性，洗脱缓冲液中加入NaCl提高离子强度。
操作形式
薄层层析
纸层析
薄膜层析
四、常见的层析技术
1 柱层析
(1) 原理 利用混合物中各组分在层析介质中的吸附或溶解性
能的不同或亲和作用性能的差异,使混合物的溶液流
经该介质时，待测组分与层析介质进行反复的吸附
或分配,从而将各组分分开。
(2) 分类 吸附柱色谱（常用）
分配柱色谱
(3) 组成
(4)操作步骤
2 内水体积： 凝胶颗粒中孔穴的体积，即是凝 胶层析中固定相体积。 3 基质体积：凝胶颗粒实际骨架体积。 4 柱床体积：凝胶柱所能容纳的总体积。
Vt＝Vo＋Vi＋Vg
Vt＝Vo＋Vi
Kd = (Ve-Vo) / Vi
Kd=0，Ve= V0 分子被完全排阻于凝胶 颗粒之外，分布于流动 相之中。
Kd = 1，Ve = V0+Vi 分子均匀分布在流动 相和固定相中
缺点
配基与基质的共价结合需要烦琐的操 作步骤
（4）应用 分离和纯化； 纯化人工合成的多肽和蛋白质；
解释酶作用机制；
4 离子交换层析
概述 离子交换剂 原理 操作步骤
（1） 概述
交换离子层析是以离子交换剂为固定相，
利用流动相中组分离子与固定相上的离子
进行可逆结合的能力大小而使化合物分离开
来的一种层析技术。
早在古希腊时期人们就会用特定的黏土纯Baidu Nhomakorabea海 水.算是比较早的离子交换法.这些黏土主要是 沸石。
Sober 和 Peterson于1956年首次将离子交换基团结 合到纤维素上，制成了离子交换纤维素，成功地应用 于蛋白质的分离。从此使生物大分子的分级分离方法 取得了迅速的发展。
第十章
层析分离技术
一、概述
1903-1906年，俄国植物学家Michael Tswett利用碳 酸钙分离色素的时候发现了层析现象。
◆后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 ◆1944年出现纸层析。
◆层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液
相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。
层析技术，又称色谱技术，是一种物理分离方 法，利用混合物中各组分的理化性质差异，使各 组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为 固定相，另一个相则流过此固定相并使各组分以 不同速度移动，从而达到分离的目的。
R-COOH＋Na+
R-COONa＋H+
阴离子交换剂 阴离子交换剂中的可解离基因是伯胺(-NH2)、仲 胺(-NHCH3)、叔胺[-N(CH3)2]和季胺[-N(CH3)2] 等碱性基团。
（3）交换原理
(4)操作步骤
A 树脂的前处理
树脂干粉 加水浸泡2h 减压抽气泡 加2N HCl搅拌4h 水洗至中性
去离子水洗至澄清 水洗至中性
加2N NaOH搅拌4h
加酸或碱转型(备用)
B 装柱
玻璃柱子垂直固定 树脂放入烧杯 加水搅拌
倒入垂直的玻璃柱内
树脂沉降
备用
注:树脂在柱内均匀分布。
C 上样 向层析柱内小心加入样品 D 洗脱及收集 选择合适洗脱液对样品进行洗脱
用自动部分收集器自动或手动收集，合并相同的管。
床面齐，然后连接溶剂池，保持一定高度的液面。
D 洗脱
用适当的洗脱液把各组分依次从柱子上洗脱下
来。一般情况下，使用梯度洗脱法，即先用一种
洗脱液将一个组分洗脱下来，然后更换新洗脱液
洗脱另一个组分。也可以逐渐改变溶剂的性质，
使洗脱液形成一个离子强度、pH或极性递增梯度
从而使各组分依次被洗脱下来。
E 收集及分析
5 亲合层析
概述 基本原理 操作步骤 应用
（1）概念 利用生物分子之间专一的亲和力而进行分 离的层析技术。
对蛋白质、酶等生物大分子特别有效。
（2）基本原理——生物专一吸附
要成功地利用亲合层析技术分离纯化物质需要具备：
良好的固相载体
三 要 素
配基：强的亲和力，如抗原-抗体、 激素-受体、DNA-互补的DNA或RNA、 凝集素-糖蛋白。 耦合反应：
4 上样
A 装好层析装置后，打开下端出口，使溶液流出至 刚好达到凝胶胶面； B 沿柱壁缓慢加入样品，打开下端出口，使样品 溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓 冲液洗涤柱壁； C 打开起始缓冲液阀门，连续洗脱；
D 用自动部分收集器自动或手动收集，合并同 一高峰各管。
5 凝胶的再生 用过的凝胶经0.5N的NaOH和HCl溶液分别处理后 可以恢复其性能。
及蒸馏水。 碱洗：用0.5 N NaOH 溶液浸泡半个小时，然后用 蒸馏水洗至中性。 酸洗：用0.5 N HCl 溶液浸泡半个小时，然后用 蒸馏水洗至中性。 平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与 起始缓冲液相同。
3 装柱 将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。 将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至 1/4~1/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵 入凝胶至沉降到所需高度。 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平 衡，柱床稳定。
可以用人工的方法将流出液收集到一系列的试管
中或使用自动部分收集器收集流出液。收集完毕
后可以通过合适的方法馏分进行检测。
梯 度 制 造 器
(1) (3)
(2)泵
adaptor
记录器
(4)
缓 冲 液
A
管 柱
胶 体
监 视 器
(5)
自 动 收 集 器
薄层层析（Thin layer chromatography) a 原理 利用吸附剂对样品中各成分吸附能力的不
特异性洗脱
凝集素为配体分离糖蛋白 单糖洗脱 与待分离物质亲和力强的物质作
洗脱方式
为洗脱剂：如染料作为配基分离 脱氢酶
DNA+
非特异性洗脱：改变洗脱缓冲液的pH、温度、 离子强度来洗脱。
再生方法：
用大量洗脱剂连续洗涤柱子一断时间，然 后再用平衡缓冲液平衡，再生成功。
纯化过程简单、迅速
优点
分离效率高 分离条件温和 针对某一分离对象需要专一的吸附剂和 相应的实验条件
A 准备材料
柱子 层析材料
B 装柱
先关闭柱出口，用溶剂灌注至1/3体积，并使 支持板下的“死体积”不存在气泡，再慢慢地
向溶剂中加层析材料，注意不要使气泡留在
柱内。为避免分层，最好一次装完到需要的 高度。最后加一张圆形滤纸或尼龙布，以免 加样时扰乱床表面。
C 上样
上样前，加溶剂使样品溶解或对样品液过滤，然后 将样品小心加到层析床的表面，打开旋塞使液面与
强酸性阳离子交换树脂
阳离子交换树脂 中酸性阳离子交换树脂 弱酸性阳离子交换树脂
分 类
强碱性阴离子交换树脂 阴离子交换树脂 中碱性阴离子交换树脂 弱碱性阴离子交换树脂
阳离子交换剂
阳离子交换剂中的可解离基团是磺酸（-SO3H）
、磷酸（-PO3H2）、羧酸（COOH）和酚羟基
（-OH）等酸性基团。
交换剂在交换时反应如下：