细胞免疫荧光步骤(仅供参照)
细胞免疫荧光的方法(自己实践记录)
细胞免疫荧光I、步骤：一、固定：PBS 5min×3次振荡洗涤制作好的细胞爬片。
固定液覆盖细胞，RT 静置15min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
二、通透化：通透液覆盖细胞，RT 静置30min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
三、封闭：封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。
四、一抗孵育：一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。
4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
五、二抗孵育：FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。
37℃避光孵育<60min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
六、染核：新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置<10min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
七、封片：在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。
八、镜检，4℃避光保存。
II、注：1、细胞密度要合适，状态较好。
2、从孵育二抗开始要避光（关闭室内日光灯即可）。
3、完成后最好及时镜检，照相；分别用不同波长激发荧光，在Photoshop软件下合成一张图。
III、试剂配制：1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加热至60℃，持续搅拌至完全溶解，（通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。
2、通透液：0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS3、封闭液：正常山羊血清稀释于PBS；或商品化封闭液成品。
4、Hoechst：Hoechst33258即可。
5、封片剂：50%(v/v)甘油/PBS。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤细胞免疫荧光实验步骤简单实验步骤如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟3.PBS洗净:3min＊34.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗净:2＊5min6.羊血清封闭：３７度，２０分钟７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时８.４度PBS洗净，３min＊５次９.二抗３７度小于一小时１０.３７度PBS洗净，３＊５min凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)（二）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（三）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光步骤方法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，% TX-100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。
3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS 中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。
5.接下来二抗孵育步骤同上。
6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7.抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。
8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。
如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit 和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。
2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey 血清。
5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
细胞免疫荧光标准操作流程
细胞免疫荧光细胞免疫荧光标准操作流程标准操作流程
20×20盖玻片清洗干净后，无水乙醇浸泡过夜，载玻片置于无水乙醇中浸泡，待用；
1. 爬片；目标细胞（如：转染24h 的细胞）胰酶消化后，用新鲜培养基吹打悬浮；取出盖玻片，酒精灯火焰灼烧至乙醇燃烧干净，盖玻片平放在6孔板内，接种细胞至六孔板，5%CO2培养箱37C 培养24h，细胞贴附在盖玻片上。
2. 收片；细胞贴附24h 后，去除培养基，加入预冷PBS 洗片，重复一次。
3. 固定；加入1ml 预冷的4%多聚甲醛，覆盖盖玻片，冰上孵育10-15min，PBS 洗片3次。
4. 透化；加入0.5ml 遇冷的0.5%Triton-100，冰上孵育5min ，PBS 洗片3次，吸尽表面液体。
5. 封闭；常温下，加入2ml 含10%FBS 的PBS ，孵育1h ，PBS 洗片1次。
6. 一抗孵育；稍晾干盖玻片，加入100ul 稀释好的一抗，室温孵育2h ，PBS 洗涤3次。
7. 二抗孵育；同上
8. 染核；加入0.5ml DAPI 工作液（1ug/ml ，PBS 稀释），覆盖盖玻片，室温孵育5min 。
9. 封片；PBS 洗片三次后，晾干，同时晾干载玻片后，滴上30ul 封片剂，盖上盖玻片，待观察。
Long Qi 2011-11-2。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光1、吸干十二孔板中每孔中的培养基，用PBS洗三次，5min/次，注意摇床要缓慢。
2、吸干PBS，每孔加200~300μl固定液，室温固定20分钟。
3、若暂时不做荧光，吸干固定液，不洗，放-30℃保存。
4、需要做时，将十二孔板取出，稍微解冻之后，加适量的PBS，用钩针抠出要PBS洗三次，5min/次。
5、吸干PBS后，每孔加1ml的5‰Triton破膜液，室温下破膜15~20分钟。
6、吸干破膜液，室温下PBS洗3次，5min/次。
7、加BSA封闭液，30~50μl/爬片，室温下封闭30min。
8、吸干BSA封闭液，不洗，加一抗（一抗用PBS稀释比例为：1：50~1:100，浓度视具体情况而定，30~50μl/爬片）4℃过夜。
注意十二孔板保持平整，以免一抗流到爬片外。
9、第二天从4℃冰箱中取出十二孔板，PBST洗3次，3min/次，然后每孔加1:50稀释的FITC，室温下避光孵育1h。
10、PBST洗3次后，DAPI染核6分钟，30μl/爬片。
染核后PBST洗3次，5min/次。
11、载玻片上滴一滴GL YCEROL封片液，即可镜下观察。
说明：①5‰Triton破膜液：例如配20μl的Triton原液用4000μlPBS稀释。
②FTIC现配现用，用PBS稀释，比例为1：50~1:75，具体浓度依据荧光亮度来调整。
耗材：1、十二孔板2块，一块要求无菌（种细胞），另一块洁净（外用漂洗爬片）。
2、外用PBS3、固定液4、细胞爬片5、避光盒6、钩针7、5‰Triton破膜液8、BSA封闭液9、一抗10、PBST11、FITC12、DAPI13、GL YCEROL封片液。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤第一步：样本准备1.根据实验需要，选择并培养适当的细胞系或组织样本。
2.将细胞或组织培养在适当的载玻片、孔板或离心管中。
3.使细胞或组织粘附在载玻片等表面上。
第二步：固定和渗透化处理1.使用适当的缓冲液（如甲醛）或有机溶剂（如甲醇）将细胞/组织进行固定处理。
2.在室温或低温下，将缓冲液中的固定液置于载玻片或孔板中，进行固定处理。
3.固定后，用洗涤缓冲液（如PBS）洗涤细胞/组织，去除多余的固定液。
4.在细胞内透明化的同时，保持细胞结构完整。
第三步：抗体染色1.准备合适的一抗和二抗。
一抗是特异性与待检测蛋白结合的抗体，二抗是带有荧光染料的抗体。
2.将一抗稀释到适当的浓度，并加入到载玻片或孔板中，与细胞孵育。
3.将载玻片或孔板中的一抗与细胞孵育30-60分钟，使抗体与待检测的蛋白相结合。
4.在恰当的洗涤缓冲液中洗涤载玻片或孔板，去除多余的一抗。
5.同样的方法，添加二抗到载玻片或孔板中，并孵育30-60分钟，使二抗与一抗结合。
6.再次使用洗涤缓冲液洗涤载玻片或孔板，去除多余的二抗。
第四步：显微镜观察1.利用适当的显微镜镜头，观察载玻片或孔板上的细胞，并选取合适的区域进行观察。
2.使用适当的荧光滤波片，观察细胞中的荧光信号。
3.根据实验设计的需要，进行图像记录和分析。
细胞免疫荧光实验是一种常见的实验技术，可以用于研究细胞中的蛋白质表达和定位，提供有关蛋白质在细胞内的空间分布和功能的信息。
不同的实验目的和需求可能会有一些细微的差异，因此可以根据具体的实验目的进行相应的调整或优化步骤。
细胞免疫荧光步骤
5.接下来二抗孵育步骤同上。
6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
10.洗去一抗。
11.上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。
12.底物显色（选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做）MTris70℃溶解，-20℃保存
ddH2O
8.封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时，也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。
9.一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。
13.洗去二抗，染核
14.DAPI或者Hoechst染核
15.洗去染核液，加PBS，上镜观察。
方法四：
(1)细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm，5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
细胞免疫荧光 详细步骤
细胞免疫荧光步骤：1、细胞在盖片上生长融合到95％－100％时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4％的甲醛室温固定20－30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2％Triton X－100透化2－5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗（用1％BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗（用1％BSA稀释）30分钟，闭光！！！11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95％甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光!!!11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
细胞免疫荧光的方法(自己实践记录)
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
细胞免疫荧光步骤
方法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。
3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。
5.接下来二抗孵育步骤同上。
6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7.抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。
8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。
如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。
2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。
5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
三种细胞免疫荧光染色操作步骤
三种细胞免疫荧光染色操作步骤三种细胞免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下:1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注:4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致:1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意:有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
细胞免疫荧光的操作流程
细胞免疫荧光的操作流程一、准备实验材料1、抗体：根据需要使用的抗體，可以选择合适的抗體。
2、细胞：根据实验需要，选择合适的细胞进行实验，并在37℃5%CO2的培养箱条件下保持培养，直到实验需要。
3、用于洗涤细胞的生理盐水或PBS缓冲液：使用无菌的生理盐水或PBS缓冲液洗涤细胞，可以保护细胞免受外界环境影响。
4、收集细胞：如酶标记或其他标记，获得细胞膜丰度，收集细胞进行数目统计，以确定最终实验细胞数量。
5、荧光染料：根据需要，选择合适的荧光染料，按指定的比例混合，配制成荧光染料溶液备用。
二、实验流程1、制备抗体溶液或小分子染料溶液：将所需抗体或小分子染料放入适当的溶剂中，搅拌均匀，配制成抗体溶液或小分子染料溶液备用。
2、洗涤细胞：在冷藏室中，将培养好的细胞离心至10000g，去除培养液，改用生理盐水或PBS缓冲液洗涤2次，以去除残留在细胞表面的培养液及细胞垢。
3、添加抗体溶液：在离心完的洗涤细胞的PBS缓冲液中添加抗体溶液，搅拌均分，放入37℃5%CO2条件的培养箱中掺匀体外培养2小时。
4、添加荧光染料溶液：将荧光染料溶液添加到毒化细胞中，在培养箱中持续掺匀体外培养1小时。
5、收集细胞：收集培养的细胞，用荧光酶标尿素酸染色法检测细胞内蛋白质的表达，用流式细胞术检测细胞的荧光强度，并分析各个细胞株。
6、数据处理：将实验数据存储，进行数据处理，绘制各细胞株荧光强度分布图，统计出各细胞株的平均荧光强度，便于评价实验效果和分析。
7、分析评价实验效果：对实验效果进行评价，进行分析，根据数据比较，判断实验结果及影响因素的影响，从而探讨获得的可靠结论。
细胞免疫荧光详细步骤
细胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。
爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。
一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。
培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。
最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。
爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。
同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。
将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。
注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。
2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；5.PBS漂洗2次，每次5min；6.1%BSA封闭30min；7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；8.PBS漂洗2次，每次5min；9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；10.PBS漂洗2次，每次5min；11.5ug/ml DAPI染色2min；12.抗淬灭封片剂封片。
抗淬灭封片剂:2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)PBS漂洗5min0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)PBS漂洗2次，每次5min1%BSA封闭30min加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2hPBS漂洗2次，每次5min加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1hPBS漂洗2次，每次5min5ug/ml DAPI染色2min抗淬灭封片剂封片2.5% DABCO (w/v)抗淬灭封片剂50mM Tris(pH8.0)90%甘油0.25g DABCO9ml甘油0.5ml 1M Tris(Ph8.0) 70℃溶解，-20℃保存0.5ml ddH2O。
[精华]细胞免疫荧光的方法（自己实际记录）
![[精华]细胞免疫荧光的方法（自己实际记录）](https://img.taocdn.com/s3/m/8eb2bf3a7275a417866fb84ae45c3b3567ecddca.png)
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
细胞免疫荧光步骤
方法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2.然后在4％里面室温下固定30分钟，洗两次，0.1% 100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。
3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4.剪一片合适大小的，在上面滴上稀释在1％中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在里洗三次。
5.接下来二抗孵育步骤同上。
6.最后，在载玻片加上（大约每个玻璃片加10），把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7.抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做检测一下你的抗体，看看有没有杂带。
8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。
如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于和的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是（绿）和（红）。
2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的，荧光标记物对照是荧光标记物。
4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常血清。
5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在241296中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
4.其实小的的话，可以直接拿来染色，没问题的。
5.固定：用洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。
细胞免疫荧光步骤
方法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1%TX-100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。
3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。
5.接下来二抗孵育步骤同上。
6.37度307.8.方法二：1.2.4度孵3.4.5.方法三：1.2.3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
4.其实小的well的话，可以直接拿来染色，没问题的。
5.固定：用PBS洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。
）固定细胞。
6.内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，二抗连HRP得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做）。
7.通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做），一般选用Triton-X100来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级个别需要到1-2小时。
8.封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度inPBS中封闭半小时，也可以选用5-10%脱脂奶粉。
封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。
9.一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santacruze,Abcam,sigma....。
选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。
时间一般是4度过夜或者37度1小时。
一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。
10.洗去一抗。
11.上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。
细胞免疫荧光染色操作步骤
细胞免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光。
实验步骤如下：1.已转染72h的细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三遍，每次5分钟。
2. 细胞半干时，覆盖以4%冷的多聚甲醛固定15分钟，避光。
3.吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。
4. 0.5%Triton X-100覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。
5. 与二抗相同宿主的血清？进口胎牛血清室温封闭30分钟。
6. 配制一抗（SAB2104246-50UG, Sigma, USA）：SAB+FBS=1:200。
7.加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。
次日：8.取出细胞复温至室温约1h。
9.冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。
冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。
10.配制荧光标记二抗：Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(H&L) TRITC，用PBS或FBS配制。
浓度1:20011.加入二抗，室温孵育1小时(避光)。
12. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。
冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。
13.DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。
14. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。
冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。
15.加入防荧光淬灭封片剂，避光。
16.上机confocol建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭的。
2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
4.不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
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方法一：
1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）
2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分
钟使细胞膜通透。
3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，
放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体
抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。
5.接下来二抗孵育步骤同上。
6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细
胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7.抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。
8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。
如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：
1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不
同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。
2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，
我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对
照是PBS+荧光标记物。
4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。
5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
方法三：
1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色
2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌
的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片
3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
4.其实小的well的话，可以直接拿来染色，没问题的。
5.固定：用PBS洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。
）固定细胞。
6.内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，二抗连HRP得必做，其他的如做
免疫荧光染色不用做）。
7.通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做），一般选用Triton-X100来做
细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级个别需要到1-2小时。
8.封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时，也可以选用
5-10%脱脂奶粉。
封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。
9.一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。
选取具体
的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。
时间一般是4度过夜或者37度1小时。
一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。
10.洗去一抗。
11.上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也
行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。
二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。
二抗的时间一般是37度半小时。
12.底物显色（选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能
需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做）
13.洗去二抗，染核
14.DAPI或者Hoechst染核
15.洗去染核液，加PBS，上镜观察。
方法四：
(1)细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的
培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm，5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
(2)固定。
根据需要选择适当的固定剂固定细胞。
固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS
中4℃保存3个月。
PBS洗涤3×5 min。
(3)通透。
使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行
通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。
选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。
通透的时间一般在5-15min。
通透后用PBS洗涤3×5 min。
(4)封闭。
使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。
(5)一抗结合。
室温孵育1h或者4℃过夜。
PBST漂洗3次，每次冲洗5min。
(6)二抗结合。
间接免疫荧光需要使用二抗。
室温避光孵育1h。
PBST漂洗3次，每次冲洗5min
后，再用蒸馏水漂洗一次。
(7)封片及检测。
滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
方法五：
1．漂洗血清蛋白PH7.2-7.4，37度PBS 2小时.
2．-20度甲醇固定20分钟后，自然、干燥10分钟
3．PBS洗净：3min＊3
4．1%Triton：25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS
5．PBS洗净：2＊5min
6．羊血清封闭：37度，20分钟
7．一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度1-2小时
8．4度PBS洗净，３min＊5次
9．二抗37度小于一小时
10．37度PBS洗净，3＊3min
11．凉干封片（封闭液PH8.5）
细胞免疫荧光步骤：
1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗
衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。
爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。
一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。
培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子
具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）
取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。
最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。
爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。
同时操作过程中注
意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。
将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。
注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。
2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；
3.PBS漂洗5min；
4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；
5.PBS漂洗2次，每次5min；
6.1%BSA封闭30min；
7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；
8.PBS漂洗2次，每次5min；
9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；
10.PBS漂洗2次，每次5min；
11.5ug/ml DAPI染色2min；
12.抗淬灭封片剂封片。
抗淬灭封片剂:
2.5% DABCO (w/v)
50mM Tris(pH8.0)
90%甘油
细胞免疫荧光
细胞爬片
4%多聚甲醛固定10min
(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)
PBS漂洗5min
0.5% Triton 穿孔15min
(丙酮固定法不用透化处理)
PBS漂洗2次，每次5min
1%BSA封闭30min
加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h
PBS漂洗2次，每次5min
加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h
PBS漂洗2次，每次5min
5ug/ml DAPI染色2min
抗淬灭封片剂封片
2.5% DABCO (w/v)
抗淬灭封片剂50mM Tris(pH8.0)
90%甘油
0.25g DABCO
9ml甘油
0.5ml 1M Tris(Ph8.0) 70℃溶解，-20℃保存
0.5ml ddH2O。