甲基化原理

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甲基化的类型：编辑 甲基化包括DNA甲基化或蛋白质甲基化
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1）DNA甲基化。[4] 脊椎动物的DNA甲基化 一般发生在CpG位点（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤 位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的 位点）。[1] 经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶 转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80%90%的CpG位点已被甲基化，但是在某些特 定区域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则 未被甲基化。这与包含所有广泛表达基因在 内的56%的哺乳动物基因中的启动子有关。 1%-2%的人类基因组是CpG群，并且CpG 甲基化与转录活性成反比。
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尽管这些甲基化图谱的绘制方 法略有不同，但他们都采用了 亚硫酸氢盐转化，将未甲基化 的胞嘧啶转化成尿嘧啶，并在 随后的扩增步骤中转化成胸腺 嘧啶。虽然很有效，但这种方 法需要一些手工操作来确保完 全的转化，并通过计算分析来 绘制图谱。
另外，两个独立的研究小组，分别为哈佛大 学的George Church等，以及加州大学的 Kun Zhang连同弗吉尼亚联邦大学的Yuan Gao等，也将传统的甲基化工具如DNA的重 亚硫酸盐转化与目标基因组捕获技术和高通 量测序相结合，定量测定人基因组中的甲基 化。
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原理：
•亚硫酸氢盐处理目标DNA，把没有甲基化的C统统转化成U •用带P7启动子的PCR引物扩增目标片段 •扩增的片段再通过P7启动子转录出RNA •NA用针对U碱基的特异裂解酶进行打断 •打断后的片段用质谱进行检测的 •G碱基比A碱基重16个质量数 •如果原来是甲基化的C，质谱中会检出G •如果原来是没有甲基化的C，质谱中会检出A •根据含G峰和含A峰的面积比较，可以推断出原来的样本中有多少 是甲基化的，又有多少是没有甲基化的
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DNA甲基化主要是通过DNA甲基转移酶家 族来催化完成的。研究人员在真核生物中发 现了3类DNA甲基转移酶(Dnmt1、Dnmt2、 Dnmt3a、Dnmt3b).Dnmt1一种是维持性甲 基化酶;Dnmt2可与DNA上特异位点结合， 但具体作用尚不清楚;Dnmt3a和Dnmt3b是 重新甲基化酶，它们使去甲基化的CpG位点 重新甲基化，即参与DNA的从头甲基化。在 哺乳动物的生殖细胞发育时期和植入前胚胎 期，其基因组范围内的甲基化模式通过大规 模的去甲基化和接下来的再甲基化过程发生 重编程，从而产生具有发育潜能的细胞；在 细胞分化的过程中，基因的甲基化状态将遗 传给后代细胞。由于DNA甲基化与人类发育 和肿瘤疾病的密切关系，特别是CpG岛甲基 化所致抑癌基因转录失活问题，DNA甲基化 已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要 研究内容。
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甲基化的功能编辑 甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰， 调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老、老 年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学 的重要研究内容之一。 最常见的甲基化修 饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化。
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DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基 化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲 基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA 稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变， 从而控制基因表达。研究证实，CpG二核苷 酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3以上由 于碱基转换而引起的遗传病。DNA甲基化主 要形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7mG）。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要 出现在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和 GATC中。
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1、甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP） 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的 不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物 点存在甲基化；反之， 检测的位点不存在甲基化。
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2）蛋白质甲基化。[3] 蛋白质甲基化一般指 精氨酸或赖氨酸在蛋白质序列中的甲基化。 精氨酸可以被甲基化一次（称为一甲基精氨 酸）或两次（精氨酸甲基转移酶（PRMTs） 将两个甲基同时转移到精氨酸多肽末端的同 一个氮原子上成为非对称性甲基精氨酸，或 者在每个氮端各加一个甲基成为对称性二甲 基精氨酸）赖氨酸经赖氨酸转移酶的催化可 以甲基化一次、两次或三次。[1] 在组蛋白中， 蛋白质甲基化是被研究最多的一类。在组蛋 白转移酶的催化下，S-腺苷甲硫氨酸的甲基 转移到组蛋白。某些组蛋白残基通过甲基化 可以抑制或激活基因表达，从而形成为表观 遗传。蛋白质甲基化是翻译后修饰的一种形 式。
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甲基化检测技术 遗传上除了ATGC这四种碱基，人们对第五 种碱基-甲基化的胞嘧啶的兴趣也日益增加。 甲基化修饰的存在对DNA转录的调控起了重 要作用，异常的甲基化往往是许多疾病的起 因。既然如此重要，系统绘制甲基化组的方 法自然也多了起来。甲基化组（methylome） 这个词还不太常见，它指的是全基因组范围 内的甲基胞嘧啶。 美国Salk生物研究院的Joseph Ecker及其同 事刚刚通过高通量测序的方法，展现了一张 人胚胎干细胞中所有甲基胞嘧啶的完整图谱。 这是第一张单碱基分辨率的哺乳动物甲基化 图谱，并伴随着mRNA和小RNA以及一些组 蛋白修饰的比较分析。他们发现胚胎干细胞 中近四分之一的甲基化是在非CG背景下， 暗示胚胎干细胞采用不同的甲基化机制来影 响基因调控。随着ES细胞的诱导分化，非 CG甲基化消失，而在iPSC中还原。这张图 谱为未来人类疾病和发育中的表观遗传学修 饰研究打下了基础。
2、亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP） 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的 随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产 序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体 序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
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在2012年2月份，英国Oxford Nanopore Technologies的科学家提出，单分子纳米孔 测序可替代这种劳动密集型的技术，测序仪 能直接分辨出未修饰的胞嘧啶和甲基化胞嘧 啶。当核酸外切酶消化单链DNA后，单个碱 基落入孔中，它们瞬间与环式糊精相互作用， 并阻碍了穿过孔中的电流。每个碱基ATGC 以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅， 因此很容易转化成DNA序列。这样，纳米孔 技术就能直接读出这第五种碱基。 由于纳米孔测序仅限于短的寡核苷酸，因此 全基因组测序还有一段很长的路要走。此外， 还有一些技术障碍需要克服，比如确保碱基 以正确的次序进入纳米孔，然后从另一侧离 开。不过，一旦成功，第五种碱基的直接测 序将会产生重大影响。
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美国Whitehead研究院的Meissner等也曾绘 制了类似的图谱。他们利用高通量的亚硫酸 氢盐测序和单分子测序，产生了覆盖大部分 CpG岛的DNA甲基化图谱。他们发现， DNA甲基化模式与组蛋白甲基化模式的相关 性比基因组序列更好；CpG的甲基化是动态 的表观遗传标志，在细胞分化期间经历大量 的改变。他们还发现，胚胎干细胞和原代细 胞中与发育调控相关的“弱”CpG岛在体外 增殖期间经历了异常的超甲基化，让人想起 某些原发肿瘤。
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在哺乳动物中CpG以两种形式存在：一种是 分散于DNA序列中；另一种呈现高度聚集状 态，人们称之为CpG岛（CpG island）。在 正常组织里，70%～90%散在的CpG是被甲 基修饰的，而CpG岛则是非甲基化的。正常 情况下，人类基因组“垃圾”序列的CpG二 核苷酸相对稀少，并且总是处于甲基化状态， 与之相反，人类基因组中大小为1001000bp左右，富含CpG二核苷酸的CpG岛 则总是处于未甲基化状态，并且CpG岛常位 于转录调控区附近，与56%的人类基因组编 码基因相关，因此基因转录区CpG岛的甲基 化状态的研究就显得十分重要。人类基因组 序列草图分析结果表明，人类基因组CpG岛 约为28890个，大部分染色体每1Mb就有515个CpG岛，平均值为每Mb含10.5个CpG 岛，CpG岛的数目与基因密度有良好的对应 关系。
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Am p lic o n BM L 0 0 8 5 -SM ARCD3 -1 2 : Sa m p le I0 5 : Su m
1851. 17 2220. 40 2236. 40 2300. 45
400
200
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1 甲基化的类型： 2 甲基化的功能 3 甲基化检测技术 4 甲基化检测方法
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DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移 到特定的碱基上的过程。DNA甲基化可以发生在 腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上生成5甲基胞嘧啶(5mC)
3、高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM） 在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片 段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化 的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发 生改变，从而导致熔解温度的变化（图1）。
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甲基化检测方法编辑 DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶， 即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基 胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种 DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化 状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲 基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。