973项目申报书——重要养殖鱼类功能基因组和分子设计育种的基础研究

项目名称：重要养殖鱼类功能基因组和分子设计育种的基础研究首席科学家：桂建芳中国科学院水生生物研究所起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：中国科学院湖北省科技厅一、研究内容基于拟解决的鱼类分子设计育种的策略和理论基础以及鱼类分子设计育种的可行性途径这两个关键科学问题，本项目拟集中在鱼类主要经济性状如生殖、生长、抗性的功能基因组和分子设计育种的基础方面，重点解析这些主要经济性状的基因调控网络，开拓关键技术，其主要研究内容包括：1）鱼类生殖基因调控网络及其分子设计育种的基础研究采用基因转移、morpholino介导的基因敲降等技术，配合整体原位杂交、细胞示踪和免疫荧光定位等方法，重点解析鱼类生殖质(germ plasm)的基因调控网络；揭示重要生殖调控基因在鱼类卵母细胞成熟和卵-胚转换中的功能作用及其调控机制；探讨鱼类配子发生过程中双亲特异性甲基化在生殖调控中的作用及其及其调控网络；通过大规模RFLP分析等呈现技术，筛选雌雄个体间性别特异的DNA片段标记，进而通过Genomic Walking克隆分离与性别决定和性别分化相关基因；揭示鱼类性别决定和性别分化的基因调控网络及其作用机理；筛选鉴定出可用于鱼类分子设计育种的性别特异表达基因和分子标记；开拓生殖调控基因和分子标记用于鱼类分子设计育种的可行性途径。

2）鱼类生长的基因调控网络和分子设计育种的基础研究采用morpholino介导的基因敲降、整体原位杂交、细胞示踪、免疫荧光定位以及组织碎片灌流和细胞孵育等在体和离体研究等技术，重点解析鱼类下丘脑/垂体控制生长的基因调控网络；揭示鱼类性成熟和生长的相互协调及其调控机理；探讨脑肠肽/生长激素/类胰岛素生长因子信号通路及其对鱼类生长的调控机制；揭示卵泡抑素等抑肌素相关基因在调控鱼类肌肉细胞增殖和鱼肉蛋白/脂肪平衡的作用机理；研制可控不育性转卵泡抑素等基因的转基因鱼品系；阐明鱼类个体大小调控基因的系统发育和进化规律；开拓生长基因调控网络和分子标记尤其是主控基因用于鱼类分子设计育种的可行性途径。

3）鱼类抗性的基因调控网络和分子设计育种的基础研究利用我们自主建立的分离鱼类抗病毒基因的细胞模型，重点解析鱼类干扰素系统和抗菌肽基因的调控网络和抗病作用机理；揭示重要鱼类病原与宿主免疫系统的相互作用及其作用机制；探讨在鱼类抗病免疫反应中主效基因调控网络、功能和抗病机理；研制具有抗病性状的雌核发育系和近交家系；鉴别出与鱼类抗病性状密切相关的分子标记和等位基因及其抗病QTL定位；建立鱼类抗病分子设计育种的理论和技术方法，开拓其可行性途径。

采用大规模测序和基因芯片分析等手段，通过比较转录组学和基因功能分析等研究手段，解析鱼类抗寒基因调控网络及其作用机理，揭示低温胁迫下不耐寒鱼类基因表达谱与耐寒鱼类基因表达谱的差异及其关键基因的功能；创制鱼类抗寒机理研究模型，开拓鱼类抗寒基因用于分子设计育种的可行性途径。

4）鱼类分子设计育种的关键技术研究通过建立鱼类数量性状基因调控网络信息整合技术和鱼类经济性状主效基因的图谱定位，揭示鱼类经济性状主效基因同线性和性状关联性关系，阐明鱼类经济性状主效基因转录组以及它们在群体和家系中的功能，确定鱼类经济性状主效基因标记和基因不同组合的遗传效应，评估其育种效率，由此创建可用于鱼类分子设计育种的数量性状多基因聚合育种的技术路线。

通过创制基于蛋白分子设计、BAC克隆、转座子系统、Cre/lox基因靶位操作的稳定、高效的鱼类转基因技术，优化和完善基于蛋白质锌指结构的鱼类基因快速敲除系统，创建基于破坏原生殖细胞发生或维持的具有遗传安全的鱼类转基因技术体系等建立可用于鱼类分子设计育种的基因操作技术路线，并揭示性腺特异小RNA在基因表达调控中的作用，阐明piRNA与互作蛋白的调控途径，研制出持续激活的生长激素受体基因的转基因鱼，揭示持续转激活生长激素受体基因与转生长激素基因的转基因鱼的效应及其信号通路的调控差异。

二、预期目标本项目的总体目标：针对水产养殖业发展现状和可持续发展需求，通过开展重要养殖鱼类生殖、生长和抗性等主要经济性状的功能基因组研究，解析鱼类生殖的基因调控网络、鱼类生长的基因调控网络、鱼类抗病和抗寒的基因调控网络，筛选鉴定进行分子设计育种的主控或关键基因和分子标记，建立鱼类分子设计育种的关键技术及其技术体系，在理论上阐明鱼类生殖、生长、抗病和抗寒等主要经济性状和重要生命现象的基因调控网络及其作用机理，提出鱼类良种分子设计的策略；在技术方法上，建立鱼类分子设计育种的多基因聚合和基因操作技术，创制优质育种材料，创建鱼类分子设计育种的可行性途径。

通过这些研究，使我国在鱼类功能基因组研究中居国际领先水平，为培育高产优质养殖新品种奠定理论和技术基础，为我国水产养殖业的可持续发展和渔业生物技术的创新做出贡献。

五年预期目标:1.解析鱼类生殖、生长、抗病和抗寒的基因调控网络；2.筛选鉴定具有自主知识产权、可用于鱼类分子设计育种的功能基因和分子标记30－50个；3.揭示鱼类性别决定与分化、卵母细胞成熟和卵-胚转换的分子机制；4.阐明鱼类生长激素分泌的信号通路；5.阐明鱼类干扰素系统关键基因和重要抗菌基因的抗病功能及其作用机理；阐明鱼类抗寒关键信号通路及其作用机理；6.建立鱼类数量性状多基因聚合育种技术；7.创建基于蛋白分子设计和遗传安全的稳定高效的基因操作技术；8.建立主要经济性状功能基因组研究和分子设计育种中间的有机联系，创制2－3个在生殖、生长或抗性等目标经济性状上表现优质的育种材料；9.凝聚和培养一批有国际影响的中青年学术带头人和学术骨干；发表一批高质量的学术论文，其中在有重要国际影响的期刊（相关领域引用排名前15%的期刊或影响因子大于5的期刊）发表论文50篇以上。

三、研究方案（一）、学术思路：针对水产养殖业发展现状和可持续发展需求，以鲫和鲤等为主要研究对象，启动我国重要养殖鱼类功能基因组和分子设计育种的基础研究，通过研究鱼类生殖、生长和抗性的基因调控网络及其作用机理，筛选鉴定进行分子设计育种的关键基因和分子标记，建立鱼类分子设计育种的关键技术及其技术体系，解决鱼类分子设计育种的策略和理论基础以及鱼类分子设计育种的可行性途径这两个关键科学问题，为鱼类分子设计育种的实践和应用以及为我国水产养殖业的可持续健康发展和渔业生物技术的创新做出贡献。

（二）、技术途径：1. 采用solexa深度测序等大规模测序和基因芯片分析等手段，通过比较转录组学分析，了解鱼类生殖和生长不同阶段、以及抗病和不抗病、耐寒和不耐寒的基因表达谱差异，经生物信息学比较和分子特征分析，由此筛选调控鱼类生殖、生长、抗性的主要基因和关键基因；2. 建立重要鱼类基因组BAC库，研究基因的结构，克隆分离相应基因的启动子；将其启动子与GFP报告基因重组融合，利用基因转移等技术，采用流式细胞仪等筛选分析技术，进一步研究生物学功能；3. 建立鱼类BAC转基因技术，用杂交方法或PCR方法筛选重要功能基因的BAC克隆，在基因编码框的适当位置插入绿色荧光蛋白（EGFP）基因；利用以上构件制备转基因鱼，通过EGFP分析这些基因的时空表达情况及其生理学效应；4. 通过基因连锁分析和原位杂交等技术，研究目的基因在染色体上的定位，揭示基因相互作用的基因组组织基础；5. 用RT-PCR、原位杂交和Western blot方法在mRNA及蛋白水平上检测基因表达的组织特异性和时序性;用免疫荧光定位确定其基因的蛋白产物的组织、细胞和亚细胞定位；6. 采用染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）、凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）等技术研究DNA 与蛋白的相互作用；7. 采用免疫共沉淀（Coimmunoprecipitation，Co-IP）、GST-pull down、荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）、双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）等技术研究蛋白相互作用；对一些重要蛋白进行质谱分析、并对其进行泛素化、乙酰化和磷酸化等修饰分析；8. 鉴定两性生殖鲫鱼卵子中双亲特异性甲基化、发育不等性基因，分析单性生殖鲫鱼三倍体卵子中相关同源基因启动子CpG岛甲基化差异和基因表达调节差异，确定发生差异甲基化的目标基因；比较分析两性生殖与单性生殖鲫鱼卵子基因组中差异甲基化功能基因启动子，鉴定差异甲基化顺式调控序列。

9. 采用正常的和人工突变后的基因转移试验，辅以其它分子生物学方法如目的基因表达产物体内、外诱导处理等来分析目的基因的生理功能；10. 用显微注射方法研究基因功能。

将含有这些基因的真核表达载体，或在大肠杆菌中表达出的蛋白，注射到胚胎中或转染到细胞中，观察生物学效应；11. 将目的基因的反义RNA或其蛋白的抗体注射到胚胎中，观察生物学效应；12. 对生殖调控基因而言，设立人工性反转实验，分别提取不同性反转阶段实验组和对照组性腺的mRNA和蛋白，采用上述方法研究基因表达的时序性；13. 对生长和生殖功能基因而言，合成重要调控生长生殖基因的结构类似物或表达具有生物活性重组蛋白，取鱼类的下丘脑、垂体、肝脏和性腺，通过碎片灌流和细胞孵育等离体研究方法，或直接注射结构类似物或重组蛋白，采用放射免疫测定等方法研究其活性，测定各种靶组织、血清中调控生殖生长激素的含量，分析这些生长调控因子和生殖调控因子的相互作用及其信号传递机制，分析它们对鱼类生殖和生长的影响；14. 通过体外合成小分子RNA，建立鱼类系统中适用于实验室日常工作的、简洁、高效的siRNA技术平台；通过克隆获得的鱼类来源的启动子构建针对草鱼出血病病毒的siRNA载体，建立抗病转siRNA基因鱼模型；通过Cre-loxp介导的系统进行鱼类胚胎中的条件基因打靶研究；建立鱼类胚胎干细胞和生殖干细胞系，建立鱼类培养细胞体外基因操作和个体重建技术途径；15. 通过morpholino介导的基因敲降技术，配合整体原位杂交、细胞示踪等方法，研究目的基因的生理学功能及其基因调控网络、信号通路和作用机理等；16. 采用已经建立的细胞模型，研究病毒与宿主细胞的相互作用，在此基础上，通过转染目的基因和siRNA干扰等技术手段，研究目的基因的生理学功能以及基因的调控网络；17. 通过AFLP和微卫星等遗传标记的大规模筛选，鉴定出与鱼类性别等等主要经济性状相关的分子遗传标记，进而通过Genomic walking克隆鉴定相关功能基因；通过人工选育和家系分析，利用遗传标记进行基因型分析的优势，研究特定标记与某些经济性状（例如生长、性别、抗病或抗寒）的连锁关系，进行分子标记辅助育种；开展鱼类生长、饲料转化率等经济性状的QTL定位分析和eQTL定位分析；18. 改造基于蛋白质锌指结构的基因敲除载体系统，优化基因敲除载体，引入更多的克隆位点，以简化特异基因敲除载体的构建；利用Zinc Finger Tools 网上软件包（）,选取代表性基因进行锌指结构域的索寻，选择连续20或30个氨基酸的合适结构域，依据针对DNA三联体的经验锌指氨基酸序列，设计靶标多肽和碱基序列；将靶标多肽的DNA片段克隆到经改进后的基因敲除载体上；体外合成mRNA,显微注射；观察表型，并利用PCR检测显微注射个体的基因型，获得杂合体；将杂合体个体扩大培养，并进行相互交配，以获得基因的两个拷贝均缺失的纯合体；系统分析基因缺失纯合体的表型。