FC500流式细胞仪培训教程
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荧光参数分析。 应用独特的数据简化显示的柱形图, 进行五维自动化表型分析，可以在单一位点上分析 出多达 32 种不同的表型 应用充分可见的发射光谱能拓展多色分析的范围，从而更提高仪器的灵活性水平
RXP 软件可进行自动的数据获取和应用设置 Beckman Coulter 高效 RXP 软件是 FC 500 系列的宝贵组件。它的 Windows 环境的平台
一种荧光染料不只发出一个波长，而是一定范围的波 长。只是其中一部分较其他染料“亮”。
- 16 -
FC500 培训教程
带通滤片接收的是一定带宽波长的荧光，故会有干扰光 同时被接收，然后一同进入 PMT 进行光电转换并放大。
通常干扰光占该染料所发出荧光总量的 X% 如上图所示：FL2(575BP)在接收 RD1 的同时，亦接收了一部分 FITC(干扰)。这部分干扰占 FITC 总量的 X%。故真正的 FL2=实测
流式细胞仪组成
Cytometer Workstation Power Supply MCL
流式细胞仪主机 流式细胞仪工作站 电源箱 自动进样器
-4-
FC500 培训教程
流式细胞仪工作原理
光源： 液流： 细胞： 流动室： 检测器：
检测信号： 统计分析：
激光(488nm 氩离子空冷激光/633nm 氦氖空冷激光) 鞘液(Sheath Fluid) 单细胞悬液 Flow Cell 光电倍增管(PMT) 光电二极管 散射光(FS，SS)，荧光信号(FL1~FL5) 计算机
能高效校正光谱重叠，从而获得更准确的结果。应用 ADC 技术，生物样品的测定可获得自 动的颜色补偿，并不受乳胶微珠的限制。只有 Beckman Coulter 流式细胞仪提供了享有专利 权的数字信号处理系统（DSP），故能达到最佳的线性效应、无漂移的放大作用和颜色补偿。
在单激光下进行 5-色分析变得无比容易 只有 FC 500 系列的流式细胞仪能在单激光或双激光条件下对多种不同的荧光色素进行
采集方案，并解释仪器自带的 DNA 方案 标本制备(利用 DNA_PREP 试剂) 细胞周期分析原理以及 MultiCycle 应用
第九课时 12，应用介绍
流式细胞仪(Flow Cytometer)
-3-
FC500 培训教程
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是利用流式细胞仪对细胞等 生物粒子的理、化及生物学特性进行分析的方法。它结合了单克隆 抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。利 用流式细胞仪可以对细胞等生物粒子的理化及生物学特性(细胞大 小、DNA/RNA 含量、细胞表面抗原表达等)进行定量、快速、客观、 多参数相关的检测。
为研究性实验室设计了精密的、高效的操作程序 采用单激光或双激光激发方式，可进行 5 色分析 配备共线性（collinear）的第二根激光，对抗体和荧光色素的选择具有更大的灵活性 排除延时计算的需要和伴随的空间-分离光束的干扰
应用先进的数字补偿（Advanced Digital Compensation, ADC）可简化多色分析 Beckman Coulter ADC 技术是目前所能达到的最先进和最准确的颜色补偿技术。该技术
- 10 -
FC500 培训教程
A/D 转换：
不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程 直方图
- 11 -
FC500 培训教程
阈值(Discriminatior):
Required Signal
通常在进行免疫标记分析时，阈值设在 FS=100~150 DNA 分析时设在 FL3PEAK=30~50 峰值信号(PEAK)与积分信号(INTEGRAL)
RD1(FL2)-干扰的 FITC(FL1)。即通常所说的：FL2-X%FL1
- 17 -
FC500 培训教程
颜色补偿判断标准： 未作颜色补偿
放大 放大
分析
- 18 -
FC500 培训教程
补偿后
- 19 -
FC500 培训教程
颜色补偿总结
- 20 -
FC500 培训教程
标本制备
单细胞悬液
外周血 骨髓 培养细胞 组织：机械法、酶法
620nmBP
可以允许 610~630nm 的光通过
-9-
FC500 培训教程
信号放大方式： 经过 PMT 将光学信号转变为电脉冲信号，并增加 PMT 的电
压及增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式有两种： 线性放大(Lin):
AMP
对数放大(Log)
AMP
通常散射光信号用线性放大，荧光信号用对数放大。但是注意 血小板的散射光用对数，而 DNA 的荧光信号用线性。
CytomicsTM FC 500 型流式细胞仪 培训教程
美国贝克曼库尔特公司（BeckmanCoulter Ltd.）流式产品部
CytomicsTM FC 500 系列流式细胞术系统
CytomicsTM FC 500 系列是一个装备了目前能获得的最先进技术的尖端产品家族。FC 500 系列具有灵活的检测功能，强大的软件和用户友好的操作界面，总之，能帮助研究人员 获得最佳化的工作流程和最高的工作效率。同时，每一台 FC 500 系统都能享受 Beckman Coulter 公司的仪器质量和售后服务的卓越信誉。
加 500ul PBS，室温避光 10min 1500rpm 离心 5min，弃上清 1ml PBS 悬浮细胞，上机检测。
因 OptilyseC 中含有固定剂，故经该溶血素溶解的标本，可 在 84 小时之内测定，待测标本置 4ºC 冰箱保存。 Q-Prep 制备的标本亦可存放 48 小时。
其他溶血素： 氯化氨、草酸氨……
4. 检查 SYSTEM VACUUM 表，-17~-30 in.Hg 5. 检查 SYSTEM PRESURE 表，如果不在 28~32 PSI 之间，请完成
以下步骤 将 PRESURE ADJUSTER 钮拉出 调节压力至合适位置
- 23 -
FC500 培训教程
调节钮复位 预热约 10-15 分钟，仪器提示：Insert Sample Tube
- 12 -
FC500 培训教程
- 13 -
FC500 培训教程
原理：
免疫荧光分析
细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合， 形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光 量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。
意义： 流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细胞表面和细胞内抗
原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，成为临床检验的一项 重要指标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗原位点的细 胞群区分开来，而且还能进一步区分各细胞亚群。对于造血系 统疾病、免疫功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评估都 起了重要作用。
FC 500 用户培训大纲
预期目的：通过第一次培训后能够达到以下要求：
1，了解流式细胞仪的基本原理 2，了解 FC500 的基本结构、开机程序及常规保养 3，了解 RXP 的软件结构并能运用其进行数据采集和结果分析
等基本功能 4，掌握单标记及多标记免疫荧光标记的原理及基本要点，熟
悉基本的标本制备过程，能够进行方案设计，能够运用 Q_PREP。 5，了解 DNA 检测的原理及基本要点熟悉基本的标本制备过 程，能够进行方案设计，能够运用 DNA_PREP，并能运用 MultiCycle 进行细胞周期分析 6，了解并掌握流式质控的几个步骤以及相关质控品，初步了 解 QC 数据库的使用。
-7-
FC500 培训教程
分光原理：
利用二向色性长通滤片(DL)及带通滤片(BP)可将不同荧光染料发 出的相应波长光谱区别开。
二向色性长通滤片(DICHROIC FILTER) 一定波长以上的光通过，该波长以下的光被折射。45 度角放置
光源
550nmDL
通过光
折射光
-8-
FC500 培训教程
>550nm 的光通过 <550nm 的光被折射 带通滤片(BAND PASS) 允许一定波长的光通过。
培训内容及课时安排(每半天为一个教学课时)
第一课时： 1， 流式细胞仪基本原理概述 2hr
-1-
FC500 培训教程
流式的结构及各部件功能：
激光，流动室，鞘液，样本要求，光电倍增管，电压及增益， 放大方式，阈值，检测信号种类，荧光染料种类， 分色方式，道数，直方图以及分析工具
2，硬件及软件介绍，
第二课时 3，练习建立方案 2hr 4，开机步骤，FLOW_CHECK 原理及光路与流路校准操作，练习
电压变化引起的信号强度变化(1hr)
第三课时 5，免疫荧光(单标记)：原理，方案，同型对照设定，Q_PREP
或 OptiLyse_C 使用，CytoTrol 及全血标本制备 (2~3hr)
第四课时 6，免疫荧光(双标记)：方案，同型对照设定，颜色补偿原理
及补偿设定，全血标本练习(2~3hr)
-2-
FC500 培训教程
使操作人员能自动化操作仪器装置和获取数据，因而既使用方便又节省时间。
自动化调控装置 使日常操作程序标准化的装置以及 PMT 电压和补偿值的质量控制装置，为用户提供多 方便利 自动化地报告质量控制结果
简明的补偿设置及其调节 对执行多种应用的研究者来说是理想的选择 应用 FCS 3.0,20-位数据可进行在线和脱机两种列表方式的补偿 当样品正在采集中或已经采集结束后都可进行数据的处理
第五课时
7，免疫荧光(三标记)，示范及练习(1~2hr)
第六课时 9，质控品、自动质控程序及质控数据库介绍：
FlowCheck，FlowSet，CytoTrol，ImmunoTrol， FlowCount，StemTrol
利用 FlowCheck 演示 QC 数据库 10，总结及试剂介绍
第七~第八课时 11，DNA 检测及分析： 检测原理 方案设计：阈值，PEAK 峰的概念，RATIO，设计一个 DNA 数据
6. 选择 PROTOCOL 进行光路与流路的检测。(见质控一) 7.
清洗程序
日常清洗程序
应用范围：清洗真空管路之前 关机之前 长期停机后第一次开机 Flow-Check CV>2% 使用如下荧光染料之前 PI(Propidium Iodide) EB(Ethidium Bromide) AO(Acidine Orange) TO(Thiazole Orange) Coriphosphine-O Fura 3 Fluorescein Diacetate 使用以上染料后，进行免疫标记分析之前 如果有碎片或计数有明显增加
- 14 -
FC500 培训教程
单标记免疫荧光分析
对数坐标 阴性对照----Isotype Control (去除非特异性结合)
CD4--FITC—IgG1
特异性结合
非ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ异性结合
双标记免疫荧光分析
同单标记 颜色补偿
- 15 -
FC500 培训教程
颜色补偿(Color Compensation)
颜色补偿是用电子的方法校正荧光染料光谱之间叠加 所造成的误差，在完成双色以上的免疫荧光分析时都需要 作颜色补偿。
激光：488nm 氩离子空冷激光/633nm 氦氖空冷激光 注意环境温度及距离
-5-
FC500 培训教程
鞘液及流动室：
Injector
鞘液
侧向及荧光信号 前向散射光
光电倍增管：
检测信号：
-6-
FC500 培训教程
散射光信号：FS：细胞大小 SS：细胞颗粒性
荧光信号： FL1~FL5
下图示：仪器如何通过 FS 检测细胞大小及通过 SS 检测颗粒特性
标本浓度
单细胞悬液
106/ml 正常全血
抗凝剂
取 100ul 100ul
EDTA3K （15%）约 10 微升抗凝 1 毫升全血 肝素 若抗凝不佳，有凝块，则不可检测
红细胞裂解
裂解液的选择： 保持细胞形态 红细胞裂解完全
反应温度
抗原抗体结合的最佳温度为 26~27ºC。避光。
- 21 -
FC500 培训教程
不推荐使用蒸馏水!!!
- 22 -
FC500 培训教程
FC500 开机步骤
1. 启动之前，分别将鞘液盒，清洁液盒加满、废液桶倒净。 2. 开启计算机，计算机将自动进入开机程序，启动流式细胞仪。
3. 打开电源箱门，检查： AIR FILTER, VACUUM FILTER 必需干燥无水 WATER TRAP 液体不能超过 1/3； VACUUM TRAP 液体若超过 1/4，请按照 Special Procedures and Troubleshooting 手册所示操作进行清洁
全血标本制备
(免疫标记—直标法)
• 取 100ul 全血加入 12X75mm 试管中 • 加适量单抗(按抗体说明书所示) • 室温避光孵育 15-20min • 裂解红细胞
Q-Prep：直接将试管放入 Q-Prep 样本台上 Optilyse C：加 500ul Optilyse C，室温避光 10min
RXP 软件可进行自动的数据获取和应用设置 Beckman Coulter 高效 RXP 软件是 FC 500 系列的宝贵组件。它的 Windows 环境的平台
一种荧光染料不只发出一个波长，而是一定范围的波 长。只是其中一部分较其他染料“亮”。
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带通滤片接收的是一定带宽波长的荧光，故会有干扰光 同时被接收，然后一同进入 PMT 进行光电转换并放大。
通常干扰光占该染料所发出荧光总量的 X% 如上图所示：FL2(575BP)在接收 RD1 的同时，亦接收了一部分 FITC(干扰)。这部分干扰占 FITC 总量的 X%。故真正的 FL2=实测
流式细胞仪组成
Cytometer Workstation Power Supply MCL
流式细胞仪主机 流式细胞仪工作站 电源箱 自动进样器
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流式细胞仪工作原理
光源： 液流： 细胞： 流动室： 检测器：
检测信号： 统计分析：
激光(488nm 氩离子空冷激光/633nm 氦氖空冷激光) 鞘液(Sheath Fluid) 单细胞悬液 Flow Cell 光电倍增管(PMT) 光电二极管 散射光(FS，SS)，荧光信号(FL1~FL5) 计算机
能高效校正光谱重叠，从而获得更准确的结果。应用 ADC 技术，生物样品的测定可获得自 动的颜色补偿，并不受乳胶微珠的限制。只有 Beckman Coulter 流式细胞仪提供了享有专利 权的数字信号处理系统（DSP），故能达到最佳的线性效应、无漂移的放大作用和颜色补偿。
在单激光下进行 5-色分析变得无比容易 只有 FC 500 系列的流式细胞仪能在单激光或双激光条件下对多种不同的荧光色素进行
采集方案，并解释仪器自带的 DNA 方案 标本制备(利用 DNA_PREP 试剂) 细胞周期分析原理以及 MultiCycle 应用
第九课时 12，应用介绍
流式细胞仪(Flow Cytometer)
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流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是利用流式细胞仪对细胞等 生物粒子的理、化及生物学特性进行分析的方法。它结合了单克隆 抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。利 用流式细胞仪可以对细胞等生物粒子的理化及生物学特性(细胞大 小、DNA/RNA 含量、细胞表面抗原表达等)进行定量、快速、客观、 多参数相关的检测。
为研究性实验室设计了精密的、高效的操作程序 采用单激光或双激光激发方式，可进行 5 色分析 配备共线性（collinear）的第二根激光，对抗体和荧光色素的选择具有更大的灵活性 排除延时计算的需要和伴随的空间-分离光束的干扰
应用先进的数字补偿（Advanced Digital Compensation, ADC）可简化多色分析 Beckman Coulter ADC 技术是目前所能达到的最先进和最准确的颜色补偿技术。该技术
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A/D 转换：
不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程 直方图
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阈值(Discriminatior):
Required Signal
通常在进行免疫标记分析时，阈值设在 FS=100~150 DNA 分析时设在 FL3PEAK=30~50 峰值信号(PEAK)与积分信号(INTEGRAL)
RD1(FL2)-干扰的 FITC(FL1)。即通常所说的：FL2-X%FL1
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颜色补偿判断标准： 未作颜色补偿
放大 放大
分析
- 18 -
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补偿后
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颜色补偿总结
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标本制备
单细胞悬液
外周血 骨髓 培养细胞 组织：机械法、酶法
620nmBP
可以允许 610~630nm 的光通过
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信号放大方式： 经过 PMT 将光学信号转变为电脉冲信号，并增加 PMT 的电
压及增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式有两种： 线性放大(Lin):
AMP
对数放大(Log)
AMP
通常散射光信号用线性放大，荧光信号用对数放大。但是注意 血小板的散射光用对数，而 DNA 的荧光信号用线性。
CytomicsTM FC 500 型流式细胞仪 培训教程
美国贝克曼库尔特公司（BeckmanCoulter Ltd.）流式产品部
CytomicsTM FC 500 系列流式细胞术系统
CytomicsTM FC 500 系列是一个装备了目前能获得的最先进技术的尖端产品家族。FC 500 系列具有灵活的检测功能，强大的软件和用户友好的操作界面，总之，能帮助研究人员 获得最佳化的工作流程和最高的工作效率。同时，每一台 FC 500 系统都能享受 Beckman Coulter 公司的仪器质量和售后服务的卓越信誉。
加 500ul PBS，室温避光 10min 1500rpm 离心 5min，弃上清 1ml PBS 悬浮细胞，上机检测。
因 OptilyseC 中含有固定剂，故经该溶血素溶解的标本，可 在 84 小时之内测定，待测标本置 4ºC 冰箱保存。 Q-Prep 制备的标本亦可存放 48 小时。
其他溶血素： 氯化氨、草酸氨……
4. 检查 SYSTEM VACUUM 表，-17~-30 in.Hg 5. 检查 SYSTEM PRESURE 表，如果不在 28~32 PSI 之间，请完成
以下步骤 将 PRESURE ADJUSTER 钮拉出 调节压力至合适位置
- 23 -
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调节钮复位 预热约 10-15 分钟，仪器提示：Insert Sample Tube
- 12 -
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原理：
免疫荧光分析
细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合， 形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光 量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。
意义： 流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细胞表面和细胞内抗
原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，成为临床检验的一项 重要指标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗原位点的细 胞群区分开来，而且还能进一步区分各细胞亚群。对于造血系 统疾病、免疫功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评估都 起了重要作用。
FC 500 用户培训大纲
预期目的：通过第一次培训后能够达到以下要求：
1，了解流式细胞仪的基本原理 2，了解 FC500 的基本结构、开机程序及常规保养 3，了解 RXP 的软件结构并能运用其进行数据采集和结果分析
等基本功能 4，掌握单标记及多标记免疫荧光标记的原理及基本要点，熟
悉基本的标本制备过程，能够进行方案设计，能够运用 Q_PREP。 5，了解 DNA 检测的原理及基本要点熟悉基本的标本制备过 程，能够进行方案设计，能够运用 DNA_PREP，并能运用 MultiCycle 进行细胞周期分析 6，了解并掌握流式质控的几个步骤以及相关质控品，初步了 解 QC 数据库的使用。
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分光原理：
利用二向色性长通滤片(DL)及带通滤片(BP)可将不同荧光染料发 出的相应波长光谱区别开。
二向色性长通滤片(DICHROIC FILTER) 一定波长以上的光通过，该波长以下的光被折射。45 度角放置
光源
550nmDL
通过光
折射光
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>550nm 的光通过 <550nm 的光被折射 带通滤片(BAND PASS) 允许一定波长的光通过。
培训内容及课时安排(每半天为一个教学课时)
第一课时： 1， 流式细胞仪基本原理概述 2hr
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流式的结构及各部件功能：
激光，流动室，鞘液，样本要求，光电倍增管，电压及增益， 放大方式，阈值，检测信号种类，荧光染料种类， 分色方式，道数，直方图以及分析工具
2，硬件及软件介绍，
第二课时 3，练习建立方案 2hr 4，开机步骤，FLOW_CHECK 原理及光路与流路校准操作，练习
电压变化引起的信号强度变化(1hr)
第三课时 5，免疫荧光(单标记)：原理，方案，同型对照设定，Q_PREP
或 OptiLyse_C 使用，CytoTrol 及全血标本制备 (2~3hr)
第四课时 6，免疫荧光(双标记)：方案，同型对照设定，颜色补偿原理
及补偿设定，全血标本练习(2~3hr)
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FC500 培训教程
使操作人员能自动化操作仪器装置和获取数据，因而既使用方便又节省时间。
自动化调控装置 使日常操作程序标准化的装置以及 PMT 电压和补偿值的质量控制装置，为用户提供多 方便利 自动化地报告质量控制结果
简明的补偿设置及其调节 对执行多种应用的研究者来说是理想的选择 应用 FCS 3.0,20-位数据可进行在线和脱机两种列表方式的补偿 当样品正在采集中或已经采集结束后都可进行数据的处理
第五课时
7，免疫荧光(三标记)，示范及练习(1~2hr)
第六课时 9，质控品、自动质控程序及质控数据库介绍：
FlowCheck，FlowSet，CytoTrol，ImmunoTrol， FlowCount，StemTrol
利用 FlowCheck 演示 QC 数据库 10，总结及试剂介绍
第七~第八课时 11，DNA 检测及分析： 检测原理 方案设计：阈值，PEAK 峰的概念，RATIO，设计一个 DNA 数据
6. 选择 PROTOCOL 进行光路与流路的检测。(见质控一) 7.
清洗程序
日常清洗程序
应用范围：清洗真空管路之前 关机之前 长期停机后第一次开机 Flow-Check CV>2% 使用如下荧光染料之前 PI(Propidium Iodide) EB(Ethidium Bromide) AO(Acidine Orange) TO(Thiazole Orange) Coriphosphine-O Fura 3 Fluorescein Diacetate 使用以上染料后，进行免疫标记分析之前 如果有碎片或计数有明显增加
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FC500 培训教程
单标记免疫荧光分析
对数坐标 阴性对照----Isotype Control (去除非特异性结合)
CD4--FITC—IgG1
特异性结合
非ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ异性结合
双标记免疫荧光分析
同单标记 颜色补偿
- 15 -
FC500 培训教程
颜色补偿(Color Compensation)
颜色补偿是用电子的方法校正荧光染料光谱之间叠加 所造成的误差，在完成双色以上的免疫荧光分析时都需要 作颜色补偿。
激光：488nm 氩离子空冷激光/633nm 氦氖空冷激光 注意环境温度及距离
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鞘液及流动室：
Injector
鞘液
侧向及荧光信号 前向散射光
光电倍增管：
检测信号：
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散射光信号：FS：细胞大小 SS：细胞颗粒性
荧光信号： FL1~FL5
下图示：仪器如何通过 FS 检测细胞大小及通过 SS 检测颗粒特性
标本浓度
单细胞悬液
106/ml 正常全血
抗凝剂
取 100ul 100ul
EDTA3K （15%）约 10 微升抗凝 1 毫升全血 肝素 若抗凝不佳，有凝块，则不可检测
红细胞裂解
裂解液的选择： 保持细胞形态 红细胞裂解完全
反应温度
抗原抗体结合的最佳温度为 26~27ºC。避光。
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不推荐使用蒸馏水!!!
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FC500 开机步骤
1. 启动之前，分别将鞘液盒，清洁液盒加满、废液桶倒净。 2. 开启计算机，计算机将自动进入开机程序，启动流式细胞仪。
3. 打开电源箱门，检查： AIR FILTER, VACUUM FILTER 必需干燥无水 WATER TRAP 液体不能超过 1/3； VACUUM TRAP 液体若超过 1/4，请按照 Special Procedures and Troubleshooting 手册所示操作进行清洁
全血标本制备
(免疫标记—直标法)
• 取 100ul 全血加入 12X75mm 试管中 • 加适量单抗(按抗体说明书所示) • 室温避光孵育 15-20min • 裂解红细胞
Q-Prep：直接将试管放入 Q-Prep 样本台上 Optilyse C：加 500ul Optilyse C，室温避光 10min