FC500流式细胞仪培训教程
流式细胞仪培训(ppt42张)
PMT用于检测较弱的SSC信号和荧光信号 ，光电二
极管用于检测较强的FSC信号
阈值
阈值：信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常
来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将 不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。
荧光补偿
采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差
荧光补偿
补偿调整的实验过程
流式细胞仪的检测对象
藻类细胞
染色体
血细胞
原生动物细胞
任何存在于悬液中的直径为0.2-50微米的粒子或细胞都适用于流式分析
流式细胞仪工作原理示意图
流式的基本组 成： 1.流动室和 液流系统 2.光路系统 3.电系统
流式细胞仪可提供的信息
物理信息：通过散射光信号反映
相对细胞大小 相对细胞颗粒密度和内部复杂度
流式细胞仪原理与应用
陈玉婵
提
要
流式细胞仪简介 流式细胞仪工作原理 流式实验流程 流式细胞术的应用
流式细胞术的发展史
1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细 胞的计数，是通过光电仪记录流过一根毛细管 的细胞,用结合了荧光素的抗体去标记细胞内 的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计 红细胞光学自动计数器。） 1960s晚期发展：荧光检测细胞计 、细胞分选 器检测细胞的荧光信号 、单克隆抗体技术 1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制 开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。
DNA含量分析-PI染色
细胞凋亡
细胞膜分析-PS外翻
PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表 面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白 Annexin-V可与PS结合
流式细胞仪讲义2ppt课件
PMT
1
PMT
2
Bandpass Filters
Laser
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5
流式细胞仪的液流系统
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
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6
2、控制流式细胞仪可变性的具体步骤：
A、校正激发、发射光路 B、监控检测器的灵敏度(cv) C、监控仪器电子线路的稳定性
流式细胞术实验结果的质控
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1
获得流式细胞术实验结果 必须经历以一下步骤：
1、检测样本的获得 2、抗体染色与洗涤 3、流式细胞仪对样本的采集、存取与分析
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2
影响流式细胞术实验结果的
主要因数:
一、仪器的可变性。 二、标本的可变性。 三、操作过程的可变性。 四、数据分析的可变性
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28
在DNA直方图中鉴别细胞增殖(SPF) 与DNA 异倍体G0/1细胞峰
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29
在DNA直方图上，二倍体G0/1细胞出现右肩峰时，先对DNA直方图作二倍体周期 分析，若SPF比率与CD71+细胞检出率接近时，则该细胞峰为增殖细胞，若SPF 比率显著高于CD71+细胞检出率时，完整则版该课右件肩峰可能为DNA异倍体细G0/1峰。 30
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19
荧光标记：FL1:CD3-FITC, FL2:CD(16-56-PE)
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20
荧光标记：FL1:CD71.177
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21
B、设联动门分析某些参数
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4、二联体细胞对DNA含量分析的影响
流式细胞仪培训手册(完成版)_图文
流式细胞仪培训手册序论学习仪器的最好方法是操作仪器,然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。
本书介绍了流式细胞仪的基本知识,并从不同角度详尽阐述了各种台式机(FACScanTM , FACSortTM , FACSCaliburTM ,和 BD LSR与大型机(FACS VantageTM, FACSVantageTM SE, 和 FACStarPLUSTM 之间的不同。
阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。
目录第 1章综述…………………………………………………………………… 4 第 2章液流系统………………………………………………………………第 3章散射光信号及荧光信号………………………………………………3.1 散射光信号………………………………………………………3.2 荧光信号…………………………………………………………3.3 荧光补偿第 4章光电系统………………………………………………………………4.1 光平台……………………………………………………………4.2 光学滤片………………………………………………………4.3 信号探测器……………………………………………………4.4 阈值………………………………………………………………第 5章数据分析………………………………………………………………5.1 数据采集及显示…………………………………………………5.2 设门………………………………………………………………5.3 细胞亚群的数据分析…………………………………………5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析………………………………5.5 CellQuest软件使用……………………………………………5.6 MutiSet 软件使用………………………………………………5.7 Simultest 软件使用……………………………………………5.8 B27软件使用…………………………………………………5.9 WinMDI软件使用…………………………………………5.10 FACSPress软件使用…………………………………………5.11 System II软件使用…………………………………………5.12 MultiCycle软件使用…………………………………………5.13 Modfit使件使用……………………………………………第 6章流式基本检测项目6.1淋巴细胞亚群检测 (双色、三色、四色,三种软件分析6.2 B27的检测………………………………………………………6.3 血小板抗体检测………………………………………………6.4 网织血小板及红细胞分析……………………………………6.5 干细胞检测……………………………………………………6.6 DNA倍体分析……………………………………………………6.7 凋亡检测…………………………………………………………第 7章分选6.1 分选………………………………………………………………第 8章激光器及光路校正……………………………………………………7.1 激光器的工作原理………………………………………………7.2 光路校正…………………………………………………………第 9章答案………………………………………………………………第一章综述流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术,通常指细胞通过激光束时在液流中的特性,即粒子的大小,密度或是内部结构,以及相对的荧光强度。
贝克曼库尔特FC500 日常操作流程
FC500 日常操作流程开机前之准备补充鞘液（至8~9分满）并倒去废液瓶中之液体。
开机打开电源箱前门，按ON按钮。
依一般程序开启您的计算机进入WINDOWS界面，点选桌面上的图标，即可进入软件。
样本检测1．仪器光路和流路的检测把QC FLOW-CHECK的方案拖到工作区内。
在试管中加5滴FLOW-CHECK微球和500ul的PBS，混合后上样检测，收集5000个颗粒停止。
（蓝光、红光用不同的微球）如果HPX-CV< 3，表明仪器状态好，可以检测样本。
如果HPX-CV>3, 表明流路有气泡或堵塞，请按工具栏中的键排气泡。
2．检测样本：把所需的方案拖至工作区内。
上样已制备好的样本，收集至一定的细胞数，按工具栏上的即停止键，停止收集。
按工具栏上图标，保存数据。
3．分析数据：点选桌面上的图标，即可进入软件。
按工具栏上图标，打开数据，进行分析即可。
清洗，关机1. 准备5%漂白水1 管和双蒸水3管。
2. 点击工作区右侧的工具栏中的图标后，把CLEANING PANEL拖至工作区下方。
依次把一管漂白水和3管双蒸水放到MCL转盘的1，2，3，4号位，点击中的键，开始清洗。
3. 点击工具栏上的和图标，在真空管中加满双蒸水，分别放到MCL转盘的1，2 号位。
4 先用50%漂白液，之后用70%酒精清洗样本台周围，特别要注意样本台和样本针探头。
6 将装有2ml双蒸水的试管MCL转盘的1号位。
7 按下软件右上角的关闭软件。
8．点选桌面上的CXPOFF图示，您会听到机器关闭的声音。
9．打开电源箱前门, 按OFF按钮。
10．正常程序关掉电脑和打印机，显示器。
流式细胞仪操作指南手册BD_FACSCalibur中文培训手册
目 录第一章流式细胞仪简介 (1)1.1 流式细胞术发展史 (1)1.2 流式细胞仪构造和工作原理 (2)1.2.1 概述 (2)1.2.2 流式细胞仪构造 (2)1.3 流式细胞仪的主要技术指标 (10)第二章 FACSCalibur 的日常操作 (12)2.1 FACSCalibur系统 (12)2.2 FACSCalibur开机程序 (15)2.3 FACSCalibur关机程序 (16)2.4 FACSCalibur的维护与保养 (17)2.4.1 FACSCalibur的每月维护 (17)2.4.2 FACSCalibur的定期维护 (18)2.5 常见故障排除 (20)第三章 FACSComp软件 (22)3.1 FACSComp简介 (22)3.1.1 FACSComp运行条件 (22)3.1.2 FACSComp的文件类型 (23)3.2 FACSComp的功能 (24)3.2.1 光电倍增管（PMT）电压的调节 (24)3.2.2 荧光补偿的调节 (24)3.2.3 灵敏度的测试 (24)3.2.4 时间延迟的校准（对于双激光，配有FL4 PMT） (25)3.2.5 HLA-B27的校准 (25)3.2.6 LeucoCOUNT (25)3.2.7 优化 (25)3.3 FACSComp的运行 (25)3.3.1 CaliBRITE Beads的准备 (25)3.3.2 软件环境的设置 (26)3.3.3 Beads的检测 (26)3.3.4 Optimization (28)第四章 FACStation 数据管理系统 (30)4.1 FACStation 数据管理系统组成 (30)4.2 FACStation文件组成 (31)4.2.1 如何建立文件夹 (31)4.2.2 FACStation文件的类型 (31)4.2.3 如何管理文件 (32)4.3 实用的Macintosh OS X功能 (34)4.3.1 菜单栏 (35)4.3.2 Dock (37)4.3.3 查找窗口 (37)4.3.4 键盘快捷键 (38)4.4 如何设置模版 (39)4.5 实验练习：如何将ModFit LT的别名添加到Dock菜单下 (40)4.6 可选性存储装置 (40)4.6.1 可选性存储装置的基本工作原则 (40)4.6.2 光驱的维护 (41)4.6.3 光盘的维护 (41)第五章 CellQuest Pro软件 (42)5.1 概述 (42)5.1.1 获取(Acquisition） (42)5.1.2 分析(Analysis) (42)5.1.3 从获取到分析(Acquisition Analysis) (42)5.2 工具栏 (42)5.3 CellQuest Pro 的文件 (43)5.3.1 FCS数据文件 (43)5.3.2 实验文件 (44)5.3.3 仪器条件文件 (44)5.3.4 统计文件 (44)5.4 CellQuest Pro 的仪器控制 (44)5.4.1 探测器 (45)5.4.2 放大器 (45)5.4.3 阈值 (46)5.4.4 补偿 (46)5.6.1 质控－运行FACSComp (48)5.6.2 优化 (50)5.6.3 调出储存的由FACSComp 生成的仪器条件 (52)5.6.4 调节FSC/SSC探测器（电压）及FSC阈值 (53)5.6.5 设置淋巴细胞Region (53)5.6.6 调节FL1、FL2、FL3的探测器（电压） (53)5.6.7 调节荧光补偿 (55)5.7 实验练习：3色/4色预获取 (55)5.7.1 设置Acquisition & Storage 窗口 (56)5.7.2 设置Parameter Description (57)5.7.3 编辑Reagent Panel (58)5.8 实验练习：数据获取 (59)5.9 储存、恢复仪器设置 (60)5.9.1 储存仪器设置 (60)5.9.2 恢复仪器设置 (60)5.10 储存实验模板文件 (60)5.11 练习：数据分析 (60)5.11.1 画Region (61)5.11.2 限定象限marker (61)5.11.3 分析四色 (63)5.11.4 批分析其余数据 (63)5.11.5 分析数据 (64)5.11.6 将分析文件以模板形式保存 (64)5.11.7 创建文具簿（stationery pad） (64)5.11.8 将统计改为电子表格 (65)5.12 Regions 和Gating（画门） (65)5.12.1 设置Region (65)5.12.2 改变Region (65)5.12.3 用Region 统计来分析数据 (66)5.12.4 门 (66)5.12.5 多色门 (66)5.12.6 组合门 (67)5.12.7 在直方图上使用组合门分析 (68)收集系统6.1.2 分选模式 (70)6.2 分选窗口 (71)6.2.1 Sort Setup (71)6.2.2 Sort Counters (72)6.3 准备收集管 (72)6.4 分选 (73)6.4.1 清洗分选管线 (73)6.4.2 准备 (73)6.4.3 收集分选前数据 (74)6.4.4 分选条件设置 (74)6.4.5 分选目的细胞 (74)6.4.6 清洗分选管路 (75)6.4.7 浓缩样本 (76)6.5 检验分选纯度 (76)6.6 分选问题讨论 (77)6.7 FACSCalibur无菌分选 (79)6.8 分选细胞浓缩系统 (80)6.8.1 系统简介 (80)6.8.2 细胞培养基嵌入物和滤膜的制备 (81)6.8.3 确定气压参数 (82)6.8.4 如何用细胞浓缩系统进行分选 (82)6.8.5 分选浓缩细胞 (84)6.8.6 从分选管路中回收细胞 (84)6.8.7 回收细胞做进一步分析 (85)6.8.8 清洗分选管路 (85)6.8.9 清洗浓缩器 (85)第七章 DNA分析 (87)7.1 概述 (87)7.2 细胞周期 (87)7.3 DNA检测的常用术语 (87)7.3.1 Coefficient of Variation（CV）：变异系数 (87)7.4.1 分辨率（CV） (88)7.4.2 线性度 (88)7.4.3 碎片 (88)7.4.4 细胞双粘体 (89)7.5 DNA质量控制（DNA QC Particles） (89)7.5.1 样本制备 (89)7.5.2 上机检测 (89)7.5.3 常见错误排除 (90)7.6 用CellQuest Pro软件获取DNA 数据 (91)7.6.1 样本制备 (91)7.6.2 用CellQuest Pro软件上机获取数据 (92)7.6.3 质量控制 (95)7.7 用ModFit 软件分析DNA数据 (95)7.7.1 运用ModFit 进行自动分析 (96)7.7.2 运用ModFit 进行手动分析 (96)7.7.3 运用ModFIT进行同步化分析 (98)7.7.4 运用ModFIT 进行增殖分析 (98)第八章 HLA-B27分析 (99)8.1 检测HLA-B27的意义 (99)8.2 HLA-B27的检测方法 (99)8.2.1 传统方法 (99)8.2.2 流式细胞术 (100)8.2.3 试剂盒介绍 (100)8.2.4 实验原理 (100)8.2.5 样本的收集和准备 (101)8.2.6 流式检测 (102)8.3 质量控制 (110)附录1：组织相容性抗原和疾病的关系 (111)附录2：强直性脊柱炎——一个常见但易被忽略的疾病 (112)第九章 MultiSET软件 (113)9.1 简介 (113)软件内容9.4.1 MultiSET界面功能分区 (116)9.4.2 MultiSET命令菜单 (116)9.4.3 MultiSET实验报告 (117)9.4.4 MultiSET运行程序 (117)9.5 利用Multiset软件的Tools和Preferences (126)9.6 Control Panels (绝对计数质控) (128)9.7 MultiSET画门及Attractor方案 (128)9.8 注意事项及常见问题处理 (129)第十章练习题 (135)10.1 补偿 (135)10.2 流式简介 (135)10.3 CellQuest 获取与分析 (136)10.4 分选 (139)第一章流式细胞仪简介1.1 流式细胞术发展史纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域的科学家的心血。
流式细胞仪操作步骤（FACSCalibur）
流式细胞仪操作步骤（FACSCalibur）⼀、开机程序：1.检查鞘液桶和废液桶。
确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位置，可以连续⼯作3个⼩时左右）、盖紧⿊盖、管道畅通、废液桶有⾜够空间容纳本批标本排弃的废液。
如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中⽓压。
2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印机。
3.⽓压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以排除管路中⽓泡。
⼆、运⾏FACSComp软件、检查仪器状况1.制备三⾊标准微球样本。
⼀般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加⼊1滴质控⼩微球，也可以根据实际情况调节浓度。
2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。
选择所需校正内容，如果使⽤的微球是新⼀批产品要输⼊微球的批号。
3.在软件界⾯左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过程中是否需要清洗样品。
4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。
功能键设置在“RUN”。
5.仪器⾃动检查，并做电压、补偿等设置。
6.FACSComp软件运⾏完毕，显⽰结果通过测试。
7.做Set up。
8.打印校正结果，退出FACSComp程序。
备注：在质控过程中，如果提⽰收集细胞速度慢可以提⾼细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，⼀定要⽤“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。
在使⽤仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。
三、样品分析软件：CellQuest Pro软件，选择“联机”。
1.（2）对实验样本进⾏命名；（3）对实验通道进⾏预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。
备注：如果界⾯被关闭，重新调出步骤：2.调出质控模板。
3.画图选择画图⼯具（⼀般选择散点图），Inspect界⾯会⾃动弹出，对⼏个常⽤选项进⾏设定：将散点图选中（⽤⿏标点击散点图边框才能够选中图形），将更改横纵坐备注：第⼀个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC。
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A/D 转换：
不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程 直方图
阈值(Discriminatior):
Required Signal
通常在进行免疫标记分析时，阈值设在 FS=100~150 DNA 分析时设在 FL3PEAK=30~50 峰值信号(PEAK)与积分信号(INTEGRAL)
为研究性实验室设计了精密的、高效的操作程序 采用单激光或双激光激发方式，可进行 5 色分析 配备共线性（collinear）的第二根激光，对抗体和荧光色素的选择具有更大的灵活性 排除延时计算的需要和伴随的空间-分离光束的干扰
应用先进的数字补偿（Advanced Digital Compensation, ADC）可简化多色分析 Beckman Coulter ADC 技术是目前所能达到的最先进和最准确的颜色补偿技术。该技术
620nmBP
可以允许 610~630nm 的光通过
信号放大方式： 经过 PMT 将光学信号转变为电脉冲信号，并增加 PMT 的电
压及增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式有两种： 线性放大(Lin):
AMP
对数放大(Log)
AMP
通常散射光信号用线性放大，荧光信号用对数放大。但是注意 血小板的散射光用对数，而 DNA 的荧光信号用线性。
单标记免疫荧光分析
对数坐标 阴性对照----Isotype Control (去除非特异性结合)
CD4--FITC—IgG1
特异性结合
非特异性结合
双标记免疫荧光分析
同单标记 颜色补偿
颜色补偿(Color Compensation)
颜色补偿是用电子的方法校正荧光染料光谱之间叠加 所造成的误差，在完成双色以上的免疫荧光分析时都需要 作颜色补偿。
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自动化调控装置 使日常操作程序标准化的装置以及 PMT 电压和补偿值的质量控制装置，为用户提供多 方便利 自动化地报告质量控制结果
简明的补偿设置及其调节 对执行多种应用的研究者来说是理想的选择 应用 FCS 3.0,20-位数据可进行在线和脱机两种列表方式的补偿 当样品正在采集中或已经采集结束后都可进行数据的处理
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620nmBP
可以允许 610~630nm 的光通过
信号放大方式： 经过 PMT 将光学信号转变为电脉冲信号，并增加 PMT 的电
压及增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式有两种： 线性放大(Lin):
AMP
对数放大(Log)
AMP
通常散射光信号用线性放大，荧光信号用对数放大。但是注意 血小板的散射光用对数，而 DNA 的荧光信号用线性。
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流式细胞仪操作步骤
流式细胞仪操作步骤一、样品准备1. 确认样品是否符合实验要求，如细胞浓度、荧光标记等。
2. 根据实验需求，选择合适的试管和细胞样品。
3. 确认样品中是否有杂质或污染物，必要时进行离心和洗涤。
4. 尽可能缩短样品处理时间，避免细胞活性受到影响。
二、样品上机1. 打开流式细胞仪，确认仪器正常工作。
2. 将样品加入到流式细胞仪的样品管中。
3. 根据实验需求，设置合适的流速和压力。
4. 开始采集数据，观察仪器工作状态，确保数据准确可靠。
三、参数设置1. 根据实验需求，选择合适的荧光标记和检测参数。
2. 根据细胞类型和特性，设置合适的门控和阈值。
3. 确认仪器校准和定标工作已完成。
4. 根据需要，设置多色分析，以便于进行细胞分群和定量分析。
四、数据采集1. 在采集数据时，观察仪器工作状态，确保数据准确可靠。
2. 根据实验需求，确定采集的数据量，确保数据具有代表性。
3. 记录采集数据的时间和条件，以便于后续数据分析。
4. 在采集数据时，注意观察细胞活性、浓度和分布情况，及时调整实验条件。
五、数据分析1. 使用专业软件对采集的数据进行处理和分析。
2. 根据实验需求，对数据进行去噪、归一化和定量分析。
3. 进行细胞分群、细胞周期和细胞凋亡等分析。
4. 对数据进行统计学分析和可视化展示。
六、结果输出1. 根据分析结果，输出相应的图表和数据表格。
2. 对结果进行解释和注释，以便于读者理解和应用。
3. 如果需要，可将结果整理成报告形式，提供给相关人员参考和使用。
七、质量控制八、实验室清理。
FC500培训手册-final
Cytomics FC 500 MCL中文应用培训手册V 1.1 美国贝克曼库尔特有限公司目 录培训所需设备及试剂 (1)每日开机程序 (2)每日关机程序 (3)长期关机程序 (4)日常保养与维护 (5)Flow-Check TM自动质控操作 (7)仪器QC及验证操作 (9)双色淋巴细胞亚群获取和分析 (12)单色&多色样本获取和分析 (20)HLA-B27检测 (21)四色免洗淋巴细胞亚群绝对计数 (28)DNA测定 (32)相关文件：1.《Cytomics FC 500 MCL with CXP software Instructions For Use 》；2.《FC500 tetraCXP System guide》；3.《CYTO-STAT tetraCHROME CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5 Instructions For Use》；4.《CYTO-STAT tetraCHROME CD45-FITC/CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5 Instructions For Use》；5.《HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE Instructions For Use》；6.《Coulter DNA Prep Reagents Kit Instructions For Use》；本手册自2011年3月1日起执行培训所需设备及试剂1.普通低速离心机（实验要求为300g,相当于1000～1500rpm，可调转速调时间，能离心12x75mm的5ml试管)；2.固定或可调节的加样器及相应加样头若干： 20ul,50ul, 100ul, 200ul, 250ul，450ul，1ml；3.涡旋混匀器；4.烧杯，量筒或移液管，清洁的玻璃或塑料带盖试剂瓶(50-100ml)若干，1个棕色瓶，漏斗，滤纸，纱布，棉签若干；5.300目过滤尼龙网；6.可放置12x75mm的5ml试管的试管架2－3个；7.PBS 溶液和蒸馏水：0.22μm滤膜过滤；8.NaClO：分析纯，有效氯浓度5-10%；9.多聚甲醛。
流式细胞仪操作指南手册BD_FACSCalibur中文培训手册
目 录第一章流式细胞仪简介 (1)1.1 流式细胞术发展史 (1)1.2 流式细胞仪构造和工作原理 (2)1.2.1 概述 (2)1.2.2 流式细胞仪构造 (2)1.3 流式细胞仪的主要技术指标 (10)第二章 FACSCalibur 的日常操作 (12)2.1 FACSCalibur系统 (12)2.2 FACSCalibur开机程序 (15)2.3 FACSCalibur关机程序 (16)2.4 FACSCalibur的维护与保养 (17)2.4.1 FACSCalibur的每月维护 (17)2.4.2 FACSCalibur的定期维护 (18)2.5 常见故障排除 (20)第三章 FACSComp软件 (22)3.1 FACSComp简介 (22)3.1.1 FACSComp运行条件 (22)3.1.2 FACSComp的文件类型 (23)3.2 FACSComp的功能 (24)3.2.1 光电倍增管（PMT）电压的调节 (24)3.2.2 荧光补偿的调节 (24)3.2.3 灵敏度的测试 (24)3.2.4 时间延迟的校准（对于双激光，配有FL4 PMT） (25)3.2.5 HLA-B27的校准 (25)3.2.6 LeucoCOUNT (25)3.2.7 优化 (25)3.3 FACSComp的运行 (25)3.3.1 CaliBRITE Beads的准备 (25)3.3.2 软件环境的设置 (26)3.3.3 Beads的检测 (26)3.3.4 Optimization (28)第四章 FACStation 数据管理系统 (30)4.1 FACStation 数据管理系统组成 (30)4.2 FACStation文件组成 (31)4.2.1 如何建立文件夹 (31)4.2.2 FACStation文件的类型 (31)4.2.3 如何管理文件 (32)4.3 实用的Macintosh OS X功能 (34)4.3.1 菜单栏 (35)4.3.2 Dock (37)4.3.3 查找窗口 (37)4.3.4 键盘快捷键 (38)4.4 如何设置模版 (39)4.5 实验练习：如何将ModFit LT的别名添加到Dock菜单下 (40)4.6 可选性存储装置 (40)4.6.1 可选性存储装置的基本工作原则 (40)4.6.2 光驱的维护 (41)4.6.3 光盘的维护 (41)第五章 CellQuest Pro软件 (42)5.1 概述 (42)5.1.1 获取(Acquisition） (42)5.1.2 分析(Analysis) (42)5.1.3 从获取到分析(Acquisition Analysis) (42)5.2 工具栏 (42)5.3 CellQuest Pro 的文件 (43)5.3.1 FCS数据文件 (43)5.3.2 实验文件 (44)5.3.3 仪器条件文件 (44)5.3.4 统计文件 (44)5.4 CellQuest Pro 的仪器控制 (44)5.4.1 探测器 (45)5.4.2 放大器 (45)5.4.3 阈值 (46)5.4.4 补偿 (46)5.6.1 质控－运行FACSComp (48)5.6.2 优化 (50)5.6.3 调出储存的由FACSComp 生成的仪器条件 (52)5.6.4 调节FSC/SSC探测器（电压）及FSC阈值 (53)5.6.5 设置淋巴细胞Region (53)5.6.6 调节FL1、FL2、FL3的探测器（电压） (53)5.6.7 调节荧光补偿 (55)5.7 实验练习：3色/4色预获取 (55)5.7.1 设置Acquisition & Storage 窗口 (56)5.7.2 设置Parameter Description (57)5.7.3 编辑Reagent Panel (58)5.8 实验练习：数据获取 (59)5.9 储存、恢复仪器设置 (60)5.9.1 储存仪器设置 (60)5.9.2 恢复仪器设置 (60)5.10 储存实验模板文件 (60)5.11 练习：数据分析 (60)5.11.1 画Region (61)5.11.2 限定象限marker (61)5.11.3 分析四色 (63)5.11.4 批分析其余数据 (63)5.11.5 分析数据 (64)5.11.6 将分析文件以模板形式保存 (64)5.11.7 创建文具簿（stationery pad） (64)5.11.8 将统计改为电子表格 (65)5.12 Regions 和Gating（画门） (65)5.12.1 设置Region (65)5.12.2 改变Region (65)5.12.3 用Region 统计来分析数据 (66)5.12.4 门 (66)5.12.5 多色门 (66)5.12.6 组合门 (67)5.12.7 在直方图上使用组合门分析 (68)收集系统6.1.2 分选模式 (70)6.2 分选窗口 (71)6.2.1 Sort Setup (71)6.2.2 Sort Counters (72)6.3 准备收集管 (72)6.4 分选 (73)6.4.1 清洗分选管线 (73)6.4.2 准备 (73)6.4.3 收集分选前数据 (74)6.4.4 分选条件设置 (74)6.4.5 分选目的细胞 (74)6.4.6 清洗分选管路 (75)6.4.7 浓缩样本 (76)6.5 检验分选纯度 (76)6.6 分选问题讨论 (77)6.7 FACSCalibur无菌分选 (79)6.8 分选细胞浓缩系统 (80)6.8.1 系统简介 (80)6.8.2 细胞培养基嵌入物和滤膜的制备 (81)6.8.3 确定气压参数 (82)6.8.4 如何用细胞浓缩系统进行分选 (82)6.8.5 分选浓缩细胞 (84)6.8.6 从分选管路中回收细胞 (84)6.8.7 回收细胞做进一步分析 (85)6.8.8 清洗分选管路 (85)6.8.9 清洗浓缩器 (85)第七章 DNA分析 (87)7.1 概述 (87)7.2 细胞周期 (87)7.3 DNA检测的常用术语 (87)7.3.1 Coefficient of Variation（CV）：变异系数 (87)7.4.1 分辨率（CV） (88)7.4.2 线性度 (88)7.4.3 碎片 (88)7.4.4 细胞双粘体 (89)7.5 DNA质量控制（DNA QC Particles） (89)7.5.1 样本制备 (89)7.5.2 上机检测 (89)7.5.3 常见错误排除 (90)7.6 用CellQuest Pro软件获取DNA 数据 (91)7.6.1 样本制备 (91)7.6.2 用CellQuest Pro软件上机获取数据 (92)7.6.3 质量控制 (95)7.7 用ModFit 软件分析DNA数据 (95)7.7.1 运用ModFit 进行自动分析 (96)7.7.2 运用ModFit 进行手动分析 (96)7.7.3 运用ModFIT进行同步化分析 (98)7.7.4 运用ModFIT 进行增殖分析 (98)第八章 HLA-B27分析 (99)8.1 检测HLA-B27的意义 (99)8.2 HLA-B27的检测方法 (99)8.2.1 传统方法 (99)8.2.2 流式细胞术 (100)8.2.3 试剂盒介绍 (100)8.2.4 实验原理 (100)8.2.5 样本的收集和准备 (101)8.2.6 流式检测 (102)8.3 质量控制 (110)附录1：组织相容性抗原和疾病的关系 (111)附录2：强直性脊柱炎——一个常见但易被忽略的疾病 (112)第九章 MultiSET软件 (113)9.1 简介 (113)软件内容9.4.1 MultiSET界面功能分区 (116)9.4.2 MultiSET命令菜单 (116)9.4.3 MultiSET实验报告 (117)9.4.4 MultiSET运行程序 (117)9.5 利用Multiset软件的Tools和Preferences (126)9.6 Control Panels (绝对计数质控) (128)9.7 MultiSET画门及Attractor方案 (128)9.8 注意事项及常见问题处理 (129)第十章练习题 (135)10.1 补偿 (135)10.2 流式简介 (135)10.3 CellQuest 获取与分析 (136)10.4 分选 (139)第一章流式细胞仪简介1.1 流式细胞术发展史纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域的科学家的心血。
FC500流式细胞仪
FC500流式细胞仪
安装条件：
1.电源：200V+10% 、16A、50Hz单相三线专用电源，供给3KV A在线不间断电源；
2.地线：由专业电工安装的专用地线，零地电压小于2V ac；
3.接插件：二只10A插头和二只市售的多功能接线盒；
4.不间断电源：3KV A在线式UPS，配备3只单独的220V/10A单相三线输出插座；
5.环境温度：15~25摄氏度，必要时配备1.5匹空调。
空调不得与仪器共用同一电源线路。
6.仪器必需放置在稳固，无振动的台面上，台面尺寸为2.5*0.8米。
仪器后方的台面与墙
壁之间必需有0.6~0.8米的空间，便于仪器保养及维修。
主机、计算机及打印机放在台面上，电源箱放在地面上。
流式细胞仪上机培训手册
流式细胞仪上机操作培训手册一、样本处理以PBMC表面抗原的流式检测步骤为例1)取样。
取新鲜提取或冻存后复苏的PBMC；2)编号。
根据实验设计，标记好流式管，如每份PBMC设两管：a)1号管：相应同型对照；b)2号管：CD3,CD4,CD8,CD56四标管；3)加样。
用移液器取100ul细胞/管（约1×106个细胞/管），分别加到已经标记好的流式管底部；4)洗涤。
加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；5)染色。
弃上清，加入100 μl PBS/管涡旋混匀细胞，并根据实验设计，向各流式管中加入相应的荧光素标记抗体，混匀，室温避光孵育30min（操作尽量保持在避光条件下进行。
）6)洗涤。
加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；7)重悬。
弃上清，加入0.5ml PBS/管，混匀，上机检测(可选择BD FACSCantoII或BD Accuri C6)。
（注：若不能及时上机，应加入4%多聚甲醛固定，并于4℃避光保存。
）8）试验结果分析。
（注：实验过程中如果进行多色标记，需要调节荧光补偿）。
参考值：二、上机检测BD FACSCanto II简要操作流程启动流式细胞仪1 打开流式细胞仪电源2 启动计算机，打开软件登录3 确保软件连接到流式细胞仪必要时，点击Cytometer > connect检查液体水平1 启动流式细胞仪后，检查液体水平低液面水平或者废液桶满都用红色指示。
2 如果液流车未自动开启，选择Cytometer > Fluidics Startup。
3 当液流启动完成后，点击OK关闭对话框。
检查气泡1 在检查完液体水平后，开启流动室门，检查流动室中是否有气泡。
2 如果没有看到气泡，进行第5步。
如果看到气泡，点击Cytometer > CleaningModes >De-gas Flow Cell.3 当完成信息出现后，点击OK。
流式细胞术培训
生物物理所 蛋白质功能研究平台 流式组
科技文献数量增长的一个简单统计
美国国立生物技术信息中心 / PUBMED 查询：检索关键词： flow cytometry 结果：
1980.1以前： 142 1980.1—1990.1: 9450 1990.1—2000.1: 33459. 2000.1—2005.1: 28850 2005.1—2009.4.15: 29495
（1）荧光补偿
发射光谱重叠带来干扰， 需要将其进行补偿
Jerry Barnhart
CD45 FITC信号“渗 漏” 到PE探测通道，CD4 PE信号微弱的细胞不 能被区分出来
CD45PercP信号不 “渗漏”到PE探测通 道，CD4 PE信号微弱 的细胞被识别出来。
Jerry Barnhart
monochromator
pinhole mirror
CCD camera
mirror
M plan APO 20x
laser
Moflo Astrios-7激光49色通道
Quick Release Nozzle Pressure Console
Laser Engines
Sort Chamber
Precision Optical Device (POD)
Electronics
Modular Laser Palette
Up to 6 fiber coupled lasers + 1 free-space UV
640 nm (60 mW)
592 nm (200 mW) 355 nm True UV (100 mW)
355 nm True UV (100 mW)
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单细胞悬液
106/ml 正常全血
抗凝剂
取 100ul 100ul
EDTA3K （15%）约 10 微升抗凝 1 毫升全血 肝素 若抗凝不佳，有凝块，则不可检测
红细胞裂解
裂解液的选择： 保持细胞形态 红细胞裂解完全
反应温度
抗原抗体结合的最佳温度为 26~27ºC。避光。
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FC500 培训教程
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原理：
Hale Waihona Puke 免疫荧光分析细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合， 形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光 量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。
意义： 流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细胞表面和细胞内抗
原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，成为临床检验的一项 重要指标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗原位点的细 胞群区分开来，而且还能进一步区分各细胞亚群。对于造血系 统疾病、免疫功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评估都 起了重要作用。
第五课时
7，免疫荧光(三标记)，示范及练习(1~2hr)
第六课时 9，质控品、自动质控程序及质控数据库介绍：
FlowCheck，FlowSet，CytoTrol，ImmunoTrol， FlowCount，StemTrol
利用 FlowCheck 演示 QC 数据库 10，总结及试剂介绍
第七~第八课时 11，DNA 检测及分析： 检测原理 方案设计：阈值，PEAK 峰的概念，RATIO，设计一个 DNA 数据
能高效校正光谱重叠，从而获得更准确的结果。应用 ADC 技术，生物样品的测定可获得自 动的颜色补偿，并不受乳胶微珠的限制。只有 Beckman Coulter 流式细胞仪提供了享有专利 权的数字信号处理系统（DSP），故能达到最佳的线性效应、无漂移的放大作用和颜色补偿。
在单激光下进行 5-色分析变得无比容易 只有 FC 500 系列的流式细胞仪能在单激光或双激光条件下对多种不同的荧光色素进行
为研究性实验室设计了精密的、高效的操作程序 采用单激光或双激光激发方式，可进行 5 色分析 配备共线性（collinear）的第二根激光，对抗体和荧光色素的选择具有更大的灵活性 排除延时计算的需要和伴随的空间-分离光束的干扰
应用先进的数字补偿（Advanced Digital Compensation, ADC）可简化多色分析 Beckman Coulter ADC 技术是目前所能达到的最先进和最准确的颜色补偿技术。该技术
使操作人员能自动化操作仪器装置和获取数据，因而既使用方便又节省时间。
自动化调控装置 使日常操作程序标准化的装置以及 PMT 电压和补偿值的质量控制装置，为用户提供多 方便利 自动化地报告质量控制结果
简明的补偿设置及其调节 对执行多种应用的研究者来说是理想的选择 应用 FCS 3.0,20-位数据可进行在线和脱机两种列表方式的补偿 当样品正在采集中或已经采集结束后都可进行数据的处理
CytomicsTM FC 500 型流式细胞仪 培训教程
美国贝克曼库尔特公司（BeckmanCoulter Ltd.）流式产品部
CytomicsTM FC 500 系列流式细胞术系统
CytomicsTM FC 500 系列是一个装备了目前能获得的最先进技术的尖端产品家族。FC 500 系列具有灵活的检测功能，强大的软件和用户友好的操作界面，总之，能帮助研究人员 获得最佳化的工作流程和最高的工作效率。同时，每一台 FC 500 系统都能享受 Beckman Coulter 公司的仪器质量和售后服务的卓越信誉。
620nmBP
可以允许 610~630nm 的光通过
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信号放大方式： 经过 PMT 将光学信号转变为电脉冲信号，并增加 PMT 的电
压及增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式有两种： 线性放大(Lin):
AMP
对数放大(Log)
AMP
通常散射光信号用线性放大，荧光信号用对数放大。但是注意 血小板的散射光用对数，而 DNA 的荧光信号用线性。
4. 检查 SYSTEM VACUUM 表，-17~-30 in.Hg 5. 检查 SYSTEM PRESURE 表，如果不在 28~32 PSI 之间，请完成
以下步骤 将 PRESURE ADJUSTER 钮拉出 调节压力至合适位置
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调节钮复位 预热约 10-15 分钟，仪器提示：Insert Sample Tube
全血标本制备
(免疫标记—直标法)
• 取 100ul 全血加入 12X75mm 试管中 • 加适量单抗(按抗体说明书所示) • 室温避光孵育 15-20min • 裂解红细胞
Q-Prep：直接将试管放入 Q-Prep 样本台上 Optilyse C：加 500ul Optilyse C，室温避光 10min
流式细胞仪组成
Cytometer Workstation Power Supply MCL
流式细胞仪主机 流式细胞仪工作站 电源箱 自动进样器
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流式细胞仪工作原理
光源： 液流： 细胞： 流动室： 检测器：
检测信号： 统计分析：
激光(488nm 氩离子空冷激光/633nm 氦氖空冷激光) 鞘液(Sheath Fluid) 单细胞悬液 Flow Cell 光电倍增管(PMT) 光电二极管 散射光(FS，SS)，荧光信号(FL1~FL5) 计算机
FC 500 用户培训大纲
预期目的：通过第一次培训后能够达到以下要求：
1，了解流式细胞仪的基本原理 2，了解 FC500 的基本结构、开机程序及常规保养 3，了解 RXP 的软件结构并能运用其进行数据采集和结果分析
等基本功能 4，掌握单标记及多标记免疫荧光标记的原理及基本要点，熟
悉基本的标本制备过程，能够进行方案设计，能够运用 Q_PREP。 5，了解 DNA 检测的原理及基本要点熟悉基本的标本制备过 程，能够进行方案设计，能够运用 DNA_PREP，并能运用 MultiCycle 进行细胞周期分析 6，了解并掌握流式质控的几个步骤以及相关质控品，初步了 解 QC 数据库的使用。
电压变化引起的信号强度变化(1hr)
第三课时 5，免疫荧光(单标记)：原理，方案，同型对照设定，Q_PREP
或 OptiLyse_C 使用，CytoTrol 及全血标本制备 (2~3hr)
第四课时 6，免疫荧光(双标记)：方案，同型对照设定，颜色补偿原理
及补偿设定，全血标本练习(2~3hr)
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加 500ul PBS，室温避光 10min 1500rpm 离心 5min，弃上清 1ml PBS 悬浮细胞，上机检测。
因 OptilyseC 中含有固定剂，故经该溶血素溶解的标本，可 在 84 小时之内测定，待测标本置 4ºC 冰箱保存。 Q-Prep 制备的标本亦可存放 48 小时。
其他溶血素： 氯化氨、草酸氨……
RD1(FL2)-干扰的 FITC(FL1)。即通常所说的：FL2-X%FL1
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颜色补偿判断标准： 未作颜色补偿
放大 放大
分析
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补偿后
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颜色补偿总结
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标本制备
单细胞悬液
外周血 骨髓 培养细胞 组织：机械法、酶法
荧光参数分析。 应用独特的数据简化显示的柱形图, 进行五维自动化表型分析，可以在单一位点上分析 出多达 32 种不同的表型 应用充分可见的发射光谱能拓展多色分析的范围，从而更提高仪器的灵活性水平
RXP 软件可进行自动的数据获取和应用设置 Beckman Coulter 高效 RXP 软件是 FC 500 系列的宝贵组件。它的 Windows 环境的平台
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A/D 转换：
不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程 直方图
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阈值(Discriminatior):
Required Signal
通常在进行免疫标记分析时，阈值设在 FS=100~150 DNA 分析时设在 FL3PEAK=30~50 峰值信号(PEAK)与积分信号(INTEGRAL)
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分光原理：
利用二向色性长通滤片(DL)及带通滤片(BP)可将不同荧光染料发 出的相应波长光谱区别开。
二向色性长通滤片(DICHROIC FILTER) 一定波长以上的光通过，该波长以下的光被折射。45 度角放置
光源
550nmDL
通过光
折射光
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>550nm 的光通过 <550nm 的光被折射 带通滤片(BAND PASS) 允许一定波长的光通过。
激光：488nm 氩离子空冷激光/633nm 氦氖空冷激光 注意环境温度及距离
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鞘液及流动室：
Injector
鞘液
侧向及荧光信号 前向散射光
光电倍增管：
检测信号：
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散射光信号：FS：细胞大小 SS：细胞颗粒性
荧光信号： FL1~FL5
下图示：仪器如何通过 FS 检测细胞大小及通过 SS 检测颗粒特性
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单标记免疫荧光分析
对数坐标 阴性对照----Isotype Control (去除非特异性结合)