汉恒-自噬及其研究方法第三版
自噬研究方法工具汇总---BIO-RAD
自噬研究方法工具汇总---BIO-RAD细胞自噬细胞自噬（autophagy）是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过程。
这个过程可以清除功能异常的细胞器、细胞内病原体以及再循环细胞组分。
尽管自噬最早被发现是应答饥饿，现在发现自噬受到各种胁迫信号的诱导，基础水平的自噬有利于细胞内稳态的维持.很多因素包括激素刺激的天然免疫信号及能量耗尽或高温等引起的物理胁迫会诱导自噬上调。
相反，很多疾病如癌症、传染性疾病和神经退行性疾病及衰老和自噬的下调都有关联。
自噬主要有三种信号通路:●Microautophagy小自噬通过溶酶体的膜内陷“吞入”目标分子，起到降解细胞质中小体积物质的作用.这个过程研究得不是很清楚,膜内陷相关的GTPaseVps1p蛋白和自噬相关蛋白(Atg)参与其中。
● 分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediatedautophagy,CMA）直接将细胞质蛋白带到溶酶体。
带KFERQ—序列的蛋白质和热休克蛋白Hsc70及其它分子伴侣相互作用形成的复合体和溶酶体膜上的Lamp-2A受体结合后，导致Lamp—2A 聚合引发复合体中的底物易位穿越溶酶体膜.● Macroautophagy大自噬被研究得最多,可以降解更大量的胞浆物质，由特殊的细胞器自噬小体介导。
大自噬起始于吞噬泡装配点(PAS）的形成和Unc51—likekinase (Ulk)复合体的组装,这启动了自噬小体的形成(图1）。
接着是成核阶段，Ulk复合物与由beclin—1、Vps15、Vps34、Atg14组成classIII PI3K 复合物相互作用形成吞噬泡。
接着吞噬泡膜扩展形成自噬小体，在这个过程中Atg12/5/16复合物促成了磷脂酰乙醇胺（PE）和LC3(酵母中是Atg8）的偶联，这是自噬小体膜唯一已知的标志物。
PE-LC3偶联物在几个关键步骤中起作用：自噬泡膜的扩展、自噬体的识别及自噬溶酶体的形成。
整个过程涉及30多个自噬相关基因（Atg蛋白），包括Beclin-1、溶酶体相关膜蛋白(Lamp—1 and Lamp—2)和微管相关蛋白1A/1Blight chains 3A/B （MAP1LC3A/B 或简称LC3)，这些都是自噬常见的标志物.最后一步，完全形成的自噬小体与溶酶体融合释放内含的物质被降解。
自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)使用指南1404
自噬双标腺病毒〔mRFP-GFP-LC3〕使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食〔Self-eating〕〞的现象，凋亡是“自杀〔Self-killing〕〞的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜〔目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层〕包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP〔-RFP〕-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以与降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技〔XX〕XX自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记与追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。
mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理〔一〕、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。
〔1〕、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；〔2〕、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存〔尽量一周内用完〕。
2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度〔每次冻融会降低病毒滴度10%〕。
建议不要在-20℃下长期保存。
如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。
3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品〔购买时请提出〕。
自噬研究方法
MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。
临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。
文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 hsigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。
EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。
另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。
24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。
我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。
细胞自噬培训(一)
液泡内不会出现自噬小体。
ATG -/-
在饥饿状态下只能存活两天。
Autophagy-细胞自噬分子机制
自噬调控基因
Autophagy-细胞自噬分子机制
自噬调控基因
Autophagy-细胞自噬分子机制
✓ 1977年回到东京大学任助教，9年之后1986年晋升讲师。
✓ 1981年 大隅良典和安乐泰宏教授在《生物化学杂志》（J. Biol. Chem.）上联合发表文章：占酵母细胞体积30%的液泡并非只是一 个“垃圾池”，它实际上在不断地向外输送氨基酸、离子等物质，从 而使酵母细胞质得以维持稳定态-开启了液泡膜ATP水解酶研究。
Autophagy-细胞自噬
➢细胞自噬发展历史
✓ 1956年,洛克菲勒大学教授德迪夫（Christian de Duve，19172013）借助光学显微镜和电子显微镜观察到了动物细胞中的溶酶 体.
Autophagy-细胞自噬
➢细胞自噬发展历史
✓ 1963年，Christian de Duve在溶酶体国际会议上提出，将描述 细胞内由包裹细胞质和细胞器送入溶酶体的过程命名为“自噬”
Autophagy-细胞自噬
➢细胞自噬发展历史
✓ 1956年，圣路易斯华盛顿大学医学院的Sam Clark用电镜观察新 生小鼠肾脏组织时发现细胞中有大量具有膜性结构的致密体，而 且其中常含有类似于线粒体等的胞质结构。
Autophagy-细胞自噬
➢细胞自噬发展历史
✓ 1956年，Sam Clark用电镜观察新生小鼠肾脏组织时发现细胞中 有大量具有膜性结构的致密体，而且其中常含有类似于线粒体等 的胞质结构。
自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体的纯化与检测
自噬基 因融合蛋 白重组 多克隆抗体 的纯化与检测
朱 雄伟， 张 佑 红， 徐智 鹏， 苏 腾甲 ， 熊 瑶， 翟 莉 莉
（ 武汉 工程 大 学化 工与制 药学院 ， 绿 色化工 过程 省部 共建教 育部 重点 实验 室 ， 湖北 武汉 ４ ３ ０ ０ ７ ４ ）
摘 要： 为 了提 纯 并 鉴 定 自噬 基 因 融 合 蛋 白重 组 多 克 隆 抗 体 ， 探讨 其在部分 组织 中的免疫 定位． 首 先 合 成 带
第 ３ ５卷 第 ２期 ２ ０ １ ３年 Ｏ ２月
武
汉
工
程பைடு நூலகம்
大
学
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Ｖｏ １ ． ３ ５ ＮＯ ． ２ Ｆｅ ｂ ． ２ ０ １ ３
Ｊ ． Ｗｕ ｈ ａ ｎ Ｉ ｎ ｓ ｔ ． Ｔｅ ｃ ｈ ．
文章编号 ： １ ６ ７ ４ —２ ８ ６ ９ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ２— ０ ０ ３ ７ 一Ｏ ５
（ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ）检 测 抗 体 效 价 、 蛋 白印迹 （ Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ
的试剂 盒 、 多克 隆抗 体 、 基 因 工 程抗 体 和 疫 苗等 已
经 或正 在投 入 临床 使 用 ， 特 别 是 抗 体 药 物 以其 对 人 体无 毒无 副作 用 、 完 全 天 然 和 高度 特 异 性 的 疗 效， 越来 越显 示其 优 势 ， 并创 造 出 巨大 的社 会 效 益
抗原 ； 乙醇 ； ２ ０ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ 磷
动现 代 医学 的发 展 ｌ ＿ １ ］ 。 杂 交 瘤 技 术 的建 立 和 细 胞
因子对 免疫 细胞 发 育 、 分化 的发 现 ， 基 因工 程技 术 的发展 ， 使 实 验 室 的 研 究 直 接 转 向 生 物 高 技 术 产
自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)使用指南
自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP（-RFP）-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。
mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。
（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。
2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。
建议不要在-20℃下长期保存。
如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。
3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品（购买时请提出）。
自噬的抑制
自噬的抑制2009-06-07 18:33:44 来源:未知根据自噬形成的过程，自噬的抑制也分为不同的阶段，包括自噬的起始阶段，自噬泡和溶酶体融合阶段，以及溶酶体内的降解阶段。
目前常用的一些抑制药物如下：（1）对自噬体形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制剂（如3-MA, Wortmannin，LY294002等），这些药物均可干扰或阻断自噬体形成。
3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine, 3-MA）是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻断Autophagy中自噬体的形成，被广泛用作Autophagy的抑制剂。
另外，渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002 也可用作Autophagy的抑制剂。
（2）对自噬体与溶酶体融合的抑制：对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断也能起着抑制自噬的作用，这些药物有巴伐洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等。
巴伐洛霉素A1（Bafilomycin A1）是一种来源于灰色链霉菌的大环内酯类抗生素，分子式C35H58O9，是空泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂，具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤等作用。
当突触小泡经历胞外分泌时，巴伐洛霉素A1可以避免小泡重新酸化。
有研究表明，在已发生自噬的肿瘤细胞中加入巴伐洛霉素A1，可使蛋白降解被抑制，自噬体增多而自噬溶酶体数目减少，并且自噬体中的酸性磷酸酶的活性也明显降低，从而证明其阻断了自噬体与溶酶体的融合过程。
这种阻断是可逆的，在去除了药物作用后，自噬体仍可以与溶酶体融合形成自噬溶酶体，继续自噬进程。
（3）对溶酶体降解的抑制: 自噬体与溶酶体融合后最终被溶酶体中的水解酶水解，它首先经过囊泡酸化，达到所需的PH值后经多种蛋白酶作用使囊内容物降解，降解产物在细胞内再循环利用。
对溶酶体的降解进行抑制，使得被降解的囊泡内容物大量蓄积于溶酶体内，而不能释放出来进入细胞内再循环利用，这也同样起着抑制自噬的作用。
因此，蛋白酶抑制剂，如E64d、Pepstatin A等，在抑制溶酶体降解的过程中发挥着自噬抑制剂的作用。
自噬的热点研究方法及步骤
自噬的热点研究方法及步骤自噬作为时下的研究热点，有非常深远的研究意义。
一、自噬病毒工具1）GFP-LC3单荧光自噬指示病毒系统GFP-LC3病毒系统可高效感染目的细胞，表达GFP-LC3，感染感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬的整体水平；由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成。
我们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
汉恒生物已开发出高效的评价用GFP-LC3病毒载体，通过瞬时高效感染细胞，配合活细胞工作站成功评价自噬流。
2）mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示病毒系统表达mRFP-GFP-LC3 融合蛋白的病毒产品。
mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
已多种双荧光病毒系统提供，具体如下：a）mRFP-GFP-LC3腺病毒系统——可高效感染目的细胞，表达mRFP-GFP-LC3，感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬发生过程；b）mRFP-GFP-LC3慢病毒系统——可以稳定表达持续检测细胞的自噬流检测；c）mRFP-GFP-LC3腺相关病毒（AAV）系统——最有效的在体自噬流检测工具；二、自噬检测以及整体服务1）自噬检测服务常规自噬检测服务包括western blot检测细胞自噬的水平，优惠提供自噬常规抗体LC3、p62以及beclin1等，我们的研究团队长期为客户提供自噬技术服务，有丰富的自噬研究经验，我们的优势是周期短，质量高；a）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。
细胞自噬培训(二)
自噬的研究方法
基本方法 ➢自噬诱导/抑制 ➢LC3的检测 ➢自噬底物的检测 ➢电镜
进阶方法 ➢自噬小体发生过程的研究 ➢自噬过程的调控研究 ➢自噬与生物学过程的研究
自噬的研究方法
基本方法 ➢ 自噬诱导
✓ Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激 ✓ Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：
IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶） ✓ Earle's平衡盐溶液：制造饥饿 ✓ N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K
Pathway抑制剂 ✓ Rapamycin：mTOR抑制剂 (最常用) ✓ Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
LC3是已知的唯一自噬体膜标志物
自噬的研究方法
➢非激活型胞质LC3 (LC3-I) 经过水解和脂质化后转变为激 活的自噬小体膜结合LC3-II。
➢通过Western Blot可以观察到更小的 LC3-II 条带, ➢通过免疫荧光或免疫组化，可观察到 LC3从胞浆转移到膜
结构上。提示，自噬活跃时，LC3-II的水平也可能低，因 为自噬小体与自噬溶酶体融合后LC3-II会被降解。
mRFP-GFP-LC3
自噬小体与溶酶体的共定位
➢判断自噬小体所处的状态 ➢与溶酶体的共定位 ➢确定早期或晚期的自噬过程
自噬的研究方法
➢最常用的方法 ➢快捷,简便
➢初步结果,需要分析 ➢更多结果支持
自噬的研究方法-EM
汉恒生物线粒体自噬的研究方法
第49卷第5期兰州大学学报（自然科学版）Vol.49No.5文章编号:0455-2059(2013)05-0693-07线粒体自噬的研究方法张迎梅,邱倩,漆永梅兰州大学生命科学学院,兰州730000摘要:线粒体自噬是一种选择性清除多余或受损线粒体的自噬过程,在调节细胞内线粒体数量和维持线粒体正常功能等方面发挥重要作用,并涉及诸多生理和病理学过程.有关线粒体自噬的研究报道始于21世纪初,近年来发展十分迅速.目前,研究线粒体自噬的方法众多,各有利弊,但没有一种检测手段可以独立说明线粒体自噬的发生或反映线粒体自噬的活性.本文旨在对目前有关线粒体自噬的研究方法与技术及其优缺点等方面做一总结,供线粒体自噬研究者参考.关键词:线粒体自噬;线粒体自噬体;线粒体自噬溶酶体;检测方法中图分类号:Q5;Q2;Q95文献标识码:AMethods in studying mitophagyZHANG Ying-mei,QIU Qian,QI Yong-meiSchool of Life Sciences,Lanzhou University,Lanzhou730000,ChinaAbstract:Mitophagy,the selective removal of dysfunctional mitochondria by autophagy,is an important mitochondrial quality control and function stabilizing mechanism which has been implicated in many different physiological and pathological processes.The research on mitophagy was begun in the beginning of this century with rapid development.However,numerous methods in mitophagy research have some shortcomings and there are still no effective or standard methods for monitoring or assessing mitophagy.This review aims to show those current techniques and methods with their advantages and disadvantages in the study of mitophagy.Key words:mitophagy;mitophagosomes;mitolysosomes;detection method线粒体是真核细胞进行生物氧化和能量转换的重要场所,涉及细胞内稳态、增殖、能动性、衰老和死亡等多种生物学过程[1].线粒体因其DNA 缺乏组蛋白的保护且修复机制不健全而易受外源或自身代谢产生的自由基(Reactive oxygen species, ROS)的攻击或因其他胁迫而发生损伤[2],线粒体受损后发生膜通透性转变(Mitochondrial perme-ability transition,MPT),氧化磷酸化解耦联,ATP 过度消耗引发细胞坏死,或者线粒体肿胀后细胞色素c释放到细胞质触发凋亡[3].适时清除受损线粒体以保持其数量和质量的稳定对于细胞正常生长和代谢具有非常重要的意义[4−5].线粒体自噬是一种选择性清除受损线粒体的特异性自噬现象[6−7],根据线粒体自噬过程的特征,可将其分为4个时期[8]:1)前期线粒体受损后发生通透性转变,导致线粒体去极化,诱导线粒体自噬相关蛋白活化[9];2)早期自噬体包裹受损线粒体,形成线粒体自噬体(Mitophagosomes)[10];3)中期线粒体自噬体与溶酶体融合后形成成熟的线粒体自噬溶酶体(Mitolysosomes)[11];4)末期线粒体被溶酶体降解.以上各期特点如图1所示.线粒体自噬除了介导受损或者多余线粒体的降解,对网织红细胞成熟过程及受精后精子来源的线粒体清除有重要意义[12−13],与局部缺血或药物诱导的组织损伤以及许多神经退行性疾病和癌症的发生发展也密切相关[14],因此有关线粒体自噬的问题越来越受到学者们的关注.目前研究线粒体自噬及其活性的方法主要包括以下3种类型:MP线粒体自噬体(Mitophagosomes);ML线粒体自噬溶酶体(Mitolysosomes);∆Ψm线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential)图1线粒体自噬过程的4个时期Figure1Four stages of mitophagy1)通过电子显微镜或荧光显微镜直接观察线粒体自噬体的结构或线粒体自噬的动态过程;2)通过流式细胞术检测线粒体膜电位、线粒体总量及免疫印迹技术检测线粒体自噬相关蛋白表达量的变化等方法间接反映线粒体自噬活性;3)通过人为对线粒体自噬通路进行实验性调节来全面评价线粒体自噬对细胞或机体形态和功能的影响.本文就目前线粒体自噬不同时期的研究方法和技术及其优缺点等方面综述如下,供线粒体自噬研究者参考.1电子显微镜技术自20世纪50年代比利时科学家Duve[15]在溶酶体的研究中通过电镜第一次观察到自噬现象至今,透射电镜技术(Transmission electron mi-croscopy,TEM)始终被认为是研究自噬发生的最直接、最可靠的手段.线粒体自噬早期形成的线粒体自噬体可以通过线粒体特有的双层膜、嵴等特征辨别,而其与溶酶体融合形成的线粒体自噬溶酶体仅能通过单层膜或消化后的残留物来大体识别[14](表1b).尽管如此,电镜技术也受到诸多因素的影响,获得的结果存在很大的变性,如因切片等人为因素造成的膜结构的改变,其他双层膜细胞器的干扰或者低电子密度空泡的误导等[16].因此,常规的透射电镜观察方法仅能对完整的线粒体自噬体进行观察,由于选取细胞数量有限,无法反映自噬活性,在定量分析中存在很大的不足.近年来,免疫金电镜技术开始用于自噬的定量分析,在线粒体自噬的研究中,利用线粒体蛋白如Tom20, CypD等和自噬体标记蛋白的抗体共定位标记线粒体自噬体,通过测量自噬囊泡面积对其进行定量分析,结合其他检测方法可反映线粒体自噬的活性变化[17−18].2荧光显微镜技术电镜观察线粒体亚结构的变化及线粒体自噬体的形成,仅能初步证明线粒体自噬是否发生,但不充分,还需要进一步结合线粒体与自噬体及溶酶体共定位的方法才能证明线粒体自噬是否发生.通过特异性荧光标记的手段,利用荧光显微镜技术,可进行线粒体溶酶体的荧光共定位观察.目前,用于线粒体自噬荧光标记的方法主要有3种:荧光标记基因转染技术、荧光探针标记技术及自噬相关蛋白免疫荧光技术.2.1荧光标记基因转染技术将自噬体和线粒体特异性蛋白的基因与天然荧光蛋白基因连接起来构成融合基因,导入细胞内表达,借助荧光显微镜对标记蛋白进行细胞内活体跟踪,可对线粒体和自噬体进行共定位分析. Gottlieb等[19]利用发射红色荧光且定位于线粒体的融合蛋白基因pDsRed2-mito与GFP-LC3联合转染细胞,进行线粒体和自噬体的共定位,通过去卷积运算及3维立体重构技术得到自噬体包裹线粒体的3维结构图,可直观反映线粒体自噬体的形成及其结构.但此方法仅适用于线粒体自噬早期的检测,无法反映其末期的降解情况.而另一种融合蛋白基因mKeima稳定表达一种在酸性和中性条件下分别发射红色和绿色荧光的天然蛋白,可用于线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体的定性和定量分析[20].Katayama等[21]通过将COX VⅢ的前导肽序列与mKeima串联起来构成一种融合基因mt-mKeima,使其所表达的Keima蛋白定位于线粒体基质,当线粒体自噬体与酸性溶酶体融合后Keima蛋白的荧光信号由绿色转为红色,荧光信号的转换可定量反映线粒体自噬的活性[8](图2和表1f).但是,长时间激发光照射对转染细胞样品的荧光强度有较大影响,而且溶酶体酶活力和胞浆的酸化程度也会影响到荧光信号的检测.a正常未处理的神经细胞中,只有少数的线粒体呈酸性状态;b诱导线粒体自噬后,大量线粒体酸化图2转染mito-Keima的神经细胞中Keima蛋白的荧光变化[8]Figure2Neurons transfected mito-Keima showing the change of Keima2.2荧光探针标记技术利用线粒体和溶酶体特异性染色技术也可对线粒体和自噬体进行共定位.在培养细胞中可利用线粒体特异性荧光探针TMRM(Tetramethylrho-damine methylester),MitoTracker 和溶酶体特异性荧光探针LysoTracker 染色并结合自噬体的荧光标记技术来追踪线粒体自噬的动态过程.MitoTracker ,LysoTracker 也可用于固定细胞的线粒体和溶酶体染色[22].线粒体去极化(Mitochon-drial depolarization)是线粒体自噬前期的重要事件[9],可利用线粒体膜电位依赖性荧光探针TMRM ,MFFR(Mitofluor far red)、罗丹明123(Rhodamine 123)或JC-1(5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide)染色后通过流式细胞术或荧光显微镜技术检测.但这些染料的荧光强度随膜电位降低而减弱,因此无法进行细胞固定后检测.另外,非培养条件下线粒体膜电位也会有所变化,因此染色后必须尽快完成后续表1线粒体自噬各期的检测方法[23−24]Table 1Detection methods on different stages of mitophagy时期检测指标原理检测方法分析与评价早期线粒体自噬EM 结果变性较大,不适于做定量体直接观察分析,仅作定性参考线粒体和自噬FM 直接反映自噬体包裹线粒体的体荧光共定位事实,但无法说明线粒体自噬末期的降解情况末期线粒体总量检测−FC 可快速检测线粒体总量的改变,但荧光极易淬灭线粒体蛋白表达量检测−IB定量分析的高效方法,但线粒体自噬特异性蛋白的选择尚有疑问mtDNA 定性和FM 线粒体总量变化受多种因素影响,定量分析FC仅依靠mtDNA 降解程度难以反映线粒体自噬活性情况MP 线粒体自噬体(Mitophagosomes),ML 线粒体自噬溶酶体(Mitolysosomes),Ψm 线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential),EM 电子显微镜技术(Electron microscopy),FM 荧光显微镜技术(Fluorescence microscopy),IF 免疫荧光技术(Immunofluorescence),IB 免疫印迹技术(Immunoblotting),FC 流式细胞技术(Flow cytometry),TMRM 四甲基罗丹明甲酯(Tetramethylrhodamine methylester),MTG 线粒体示踪绿(MitoTracker green),LTR 溶酶体示踪红(LysoTracker red).检测.MitoTracker是一种持久的线粒体特异性荧光探针,可被活细胞摄取和累积,较之传统的线粒体荧光探针TMRM等,其荧光不依赖膜电位而变化,仅需一个温和的共价巯基结合于线粒体蛋白并在线粒体去极化后仍保持不变[25].MitoTracker 具有多个颜色的变体,可结合其他荧光标记手段选择所需荧光色彩进行双染或者三联染色,如LC3-GFP,MTR(MitoTracker red)联合标记(表1c),用于线粒体自噬体的定位[14].LysoTracker是一种偏酸性的胺类荧光探针,可用于对活细胞内的酸性区室(如溶酶体、内吞体、自噬体等)染色示踪,其敏感度极高,并可在乙醛固定后稳定保持[26],也有多个荧光色彩的变体可选.但是这种探针作为溶酶体非特异性的探针不能单独用于线粒体自噬的分析,必须与其他的方法相结合,如LTR(LysoTracker red)与MTG(MitoTracker green)联合染色(表1d),用于线粒体自噬体与溶酶体融合的共定位[27]. TMRM,MTG两种荧光染料均可在极化的线粒体中蓄积,TMRM可以通过荧光共振能量转移使MTG荧光淬灭,单独发红色荧光.但当线粒体去极化后,TMRM被释放,MTG发出绿色荧光,聚集在细胞核周围[28].因此,用TMRM,MTG联合染色可特异性标记新的去极化线粒体(表1a).当对细胞同时进行TMRM,MTG,LTR染色时,可以通过荧光显微镜观察去极化的线粒体是否与溶酶体融合,亦即是否发生了线粒体自噬[25]. Kim等[29]利用发蓝色荧光的MFFR代替TMRM,联合GFP-LC3及LTR在线粒体动态监测中可更方便地观察线粒体自噬的动态变化过程.此外,荧光探针标记技术也可与荧光标记的线粒体自噬标志蛋白基因转染技术结合来示踪线粒体自噬[30]. 2.3免疫荧光技术在固定细胞中,选用线粒体和溶酶体特异性蛋白的抗体对线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体进行免疫荧光标记,如溶酶体膜蛋白LAMP-1或LAMP-2,线粒体基质蛋白Hsp60和CypD(表1e),线粒体膜蛋白VDAC1,Tom20等.然而,线粒体自噬并非受损线粒体蛋白的唯一降解方式,研究者发现许多线粒体外膜及膜间隙蛋白的降解是由Parkin依赖性的泛素蛋白酶系统介导的,还有一部分线粒体外膜蛋白在Parkin的介导下逃逸至内质网以躲避降解[31],而大多数的线粒体内膜蛋白及基质蛋白的降解则是由Parkin依赖性的线粒体自噬介导的,但其具体机制还不清楚[32].因此,同时选用CypD,Hsp60等线粒体基质蛋白或者内膜蛋白的抗体进行免疫荧光标记来检测线粒体自噬可能会更严谨.除了通过线粒体溶酶体的共定位来说明线粒体自噬之外,也可以通过线粒体DNA(mtDNA)的降解来反映线粒体自噬的活性.线粒体中ROS的累积可导致mtDNA的突变,并进一步诱导线粒体自噬.PicoGreen是一种可穿透线粒体膜,对mtDNA进行特异性标记的荧光探针,通过免疫荧光技术检测PicoGreen的荧光信号强度可反映mtDNA的降解程度[33].PicoGreen也可用于活细胞染色,Kim等[10]利用PicoGreen,TM-RM和LTR对来源于野生型小鼠的肝脏细胞线粒体自噬过程中mtDNA的降解进行监测(表1g).3免疫印迹技术免疫印迹技术(Immunoblotting,IB)可用于线粒体自噬的定量分析,通过检测线粒体蛋白的表达量变化可反映末期线粒体总量(Mitochondrial mass)的改变,从而间接反映线粒体自噬的活性.通常选线粒体基质蛋白Hsp60,CypD,线粒体膜蛋白VDAC1,Tom20等,但考虑到不同线粒体蛋白降解过程的线粒体自噬依赖性的不同[32],最好分别选取线粒体内外膜蛋白、基质与膜间隙蛋白,从而全面反映线粒体总量的变化.在酵母线粒体自噬的定量分析中用GFP标记的线粒体外膜蛋白基因GFP-Om45转染细胞,线粒体自噬过程中Om45降解,释放出游离的GFP可稳定存在,通过免疫印迹检测GFP的含量即可定量分析线粒体自噬的活性[34],但由于哺乳动物细胞溶酶体酸性状态可使GFP快速降解,此方法不适用其线粒体自噬的检测.此外,通过标准比色法检测柠檬酸合酶的活力也可以反映线粒体的总量[35].介导线粒体自噬的一些特异性蛋白的稳定性、表达量及活性的变化也可以通过免疫印迹技术来分析,进而定量地反映线粒体自噬的发生及其活性.如在PINK1/Parkin介导的线粒体自噬途径中, PINK1在正常条件下以线粒体膜电位依赖性的方式被蛋白水解酶快速降解,而线粒体去极化能使其稳定,并在线粒体膜上累积聚集[30,36],进而通过磷酸化Parkin使之从细胞质向功能紊乱的线粒体上募集[37],以介导线粒体自噬性的降解.另外,低氧条件下,NIX表达量的显著上升和FUNDC1的去磷酸化[38−39],也可介导线粒体自噬的发生.4流式细胞技术流式细胞技术(Flow cytometry,FC)作为单细胞定量分析和分选的手段,在线粒体自噬的检测中被广泛应用.通过流式细胞技术定量检测TMRM、罗丹明123或JC-1染色后线粒体荧光强度的变化可反映线粒体的损伤程度.线粒体自噬性降解会导致细胞内线粒体总量的减少[8]. Zhang等[40]在网织红细胞成熟过程线粒体自噬清除的研究中,利用线粒体特异荧光探针MTG对线粒体染色后通过流式细胞技术检测荧光总量来反映末期线粒体总量的变化.而Yoshii等[32]通过流式细胞技术检测稳定表达GFP标记的线粒体外膜蛋白GFP-Omp25的Parkin野生型MEFs细胞经CCCP(Carbonyl cyanide3-chlorophenyl hydra-zone)处理诱导线粒体自噬,发现GFP-Omp的含量在线粒体自噬诱导后随时间的延长而降低,也可反映线粒体自噬的活性.但以线粒体的总量变化来反映其自噬活性的方法必须联合其他检测手段才能说明线粒体自噬.5线粒体自噬的诱导与抑制在线粒体自噬对机体或细胞的行为和效应分子影响的研究中,一般通过人为干预的方式来诱导或抑制线粒体自噬,方法主要包括药物处理、物理损伤、饥饿及线粒体自噬基因敲除、沉默或过表达等.有关线粒体自噬的分子途径和功能研究中,常用线粒体的解偶联剂CCCP和FCCP(Carbonyl cyanide4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)作为诱导剂,引发细胞内全部线粒体短时间内剧烈的去极化及线粒体自噬的发生,但这两种诱导剂也可造成细胞骨架的破坏及溶酶体酸化的抑制,因此,实验中也会用到如K+载体缬氨霉素(Valino-mycin)、抗霉素A(Antimycin A)等一些比较温和的诱导药物[41].此外,饥饿和光照辐射也可以诱导部分线粒体发生自噬[10,22,29].在表达KillerRed-d Mito(一种光敏蛋白,定位于线粒体基质)的Parkin 野生型细胞中,通过光照辐射激发KillerRed发射荧光,可导致ROS的急剧增加,诱导线粒体自噬的发生,这是一种可在时间和空间上进行人为控制的线粒体自噬诱导方法[42].线粒体的保护剂,包括影响ATP生成与降解的药物、降低线粒体膜通透性的药物、铁依赖脂质过氧化作用的抑制剂、Ca2+阻滞剂和Ca2+依赖蛋白酶抑制剂等.乙酰左旋肉毒碱(Acetyl-L-carnitine,ALC)作为细胞呼吸的替代底物,可恢复呼吸效率,促进ATP生成,维持线粒体膜电位,抑制脂质过氧化,常用于线粒体紊乱导致的神经退行性疾病及病理性损伤的治疗研究[43].环孢菌素A(CyclosporinA,CsA)是一种线粒体通透性转变的特异性抑制剂,可通过干扰亲环素D(Cyclophilin D)和线粒体通透性转变孔的相互作用抑制线粒体的去极化和线粒体自噬体的形成[44].在Rodriguez等[27]的研究中,作为线粒体自噬诱导后的保护剂,可明显降低线粒体自噬体的总量.此外,非免疫抑制剂NIM811(N-methyl-4-isoleucine cyclosporin)也可发挥同样作用[45].线粒体自噬相关基因的敲除、沉默或过表达,可用于某一特定基因在整个线粒体自噬通路中功能的研究.如在果蝇PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬途径的研究中发现,敲除PINK1和Parkin,可造成线粒体自噬的抑制[46],PINK1过表达不能补偿Parkin缺失所造成的线粒体自噬阻滞,而Parkin的过表达却可以部分缓解PINK1缺失造成的线粒体自噬阻滞[47].6小结线粒体自噬的研究方法众多,各有优势,但没有一种手段可以独立说明线粒体自噬的发生并反映其活性.受损的线粒体不仅可通过自噬的方式得到清除,也可能发生线粒体凋亡(Mitoptosis)[48].因此,研究线粒体自噬形态与功能,需针对其各期特点和发生机制,多指标与多技术联合,体内与体外、定性与定量实验相结合,并通过人为干预的实验性调节来研究线粒体自噬对机体或细胞的行为和效应分子的影响.在目前线粒体自噬尚无标准化的检测或监控技术的情况下,建议研究者理性地分析和对待采用不同技术手段所获得的有关线粒体自噬的实验结果,并在现有基础上寻找和创新线粒体自噬研究的新方法和新技术.这不仅是线粒体自稳态调节的深入研究所必需的,更对线粒体自噬的调控在衰老、神经退行性疾病和癌症治疗中的研究有重要意义.参考文献[1]Detmer S A,Chan D C.Functions and dysfunc-tions of mitochondrial dynamics[J].Mol Cell Biol, 2007,8(11):870−879.[2]Yakes F M,Van Houten B.Mitochondrial DNAdamage is more extensive and persists longer than nuclear DNA damage in human cells following oxida-tive stress[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(2): 514−519.[3]Lemasters J J,Nieminen A-L,Qian T,et al.The mitochondrial permeability transition in cell death:a common mechanism in necrosis,apopto-sis and autophagy[J].Biochim Biophys Acta,1998, 1366(177/196):177−196.[4]Guarente L.Mitochondria:a nexus for aging,calorie restriction,and sirtuins?[J].Cell,2008, 132(2):171−176.[5]Melser S,Chatelain Etienne H,La vieJ,et al.Rheb regulates mitophagy induced by mitochondrial energetic status[J].Cell,2013,17(5): 719−730.[6]Lemasters J J.Selective mitochondrialautophagy,or mitophagy,as a targeted defense against oxidative stress,mitochondrial dysfunction, and aging[J].Rejuv Res,2005,8(1):3−5.[7]Fimia G M,Kroemer G,Piacentini M.Molecu-lar mechanisms of selective autophagy[J].Cell Death Differ,2013,20(1):1−2.[8]Klionsky D J,Abdalla F C,Abeliovich H,et al.Guidelines for the use and interpretation of as-says for monitoring autophagy[J].Autophagy,2012, 8(4):445−544.[9]Rodriguez E S,He L,Lemasters J J.Role ofmitochondrial permeability transition pores in mito-chondrial autophagy[J].Int J Bilchem Cell B,2004, 36(12):2463−2472.[10]Kim I,Lemasters J J.Mitochondrial degradationby autophagy(mitophagy)in GFP-LC3transgenic hepatocytes during nutrient deprivation[J].Am J Physiol Cell Physiol,2011,300(2):C308−317. 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自噬研究-自噬双标腺病毒登Cell主刊
自噬研究—汉恒自噬腺病毒登Cell主刊---附：汉恒专家教你如何发Cell小编非常欣慰的告知大家，汉恒荧光自噬双标病毒产品再次荣登世界级权威杂志---不过这次换成了Cell主刊，2016年的影响因子：30.41！2017年7月27日，来自上海交通大学医学院附属仁济医院消化科的房静远教授、陈萦晅副教授、洪洁和陈豪燕副研究员与美国密西根大学邹伟平教授合作在Cell 正刊发表了题为“Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy”的研究论文，该研究表明核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）通过激活结直肠癌（CRC）细胞自噬诱导CRC对化疗药物耐受。
“该研究为临床上评估结直肠癌治疗后的复发风险和进一步加强联合治疗提供了非常广阔和重要的应用前景。
（Bioart）”在这篇论文中，研究者使用汉恒生物荧光自噬双标病毒产品mRFP-GFP-LC3有力地证明了F. nucleatum激活了CRC细胞自噬（Figure 1和2），而使用的方法恰是汉恒生物一直倡导的“自噬研究的金指标”-①LC3的Western blot、②自噬双标工具检测自噬流变化、③电镜直接观测自噬小体和自噬溶酶体的产生（Figure 3）.换言之，做自噬，必须要用荧光自噬双标病毒mRFP-GFP-LC3做自噬流检测。
【广告】汉恒生物荧光自噬双标病毒产品mRFP-GFP-LC3属于病毒现货产品，囊括了三大主流病毒-慢病毒、腺病毒和在体研究专用的腺相关病毒（AAV）。
同时还包括一系列线粒体自噬研究的现货工具。
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Figure 1. F. nucleatum激活HCT116和HT29细胞的自噬（该图源于原文Fig2）.Figure 2. F. nucleatum激活HCT116细胞自噬是通过miR-18*和miR-4802介导的（该图源于原文Fig 4）.Figure 3. 汉恒生物自噬研究三大金指标（该图来源于汉恒讲坛系列PPT。
细胞自噬检测实验流程
细胞自噬检测实验流程
自噬（Autophagy），或称自体吞噬，是一个涉及到细胞自身结构通过溶酶体机制而被分解的过程，该过程是一个受到紧密调控的步骤，帮助细胞产物在合成、降解以及接下来的循环中保持一个平衡状态。
“自噬”一词是由比利时化学家克里斯汀·德·迪夫在1963年创造的。
90年代酵母的研究人员通过识别自噬相关基因，从而推动了自噬研究的开展。
日本科学家大隅良典因对“细胞自噬机制的发现”，获得了2016年度的诺贝尔生理学或医学奖。
在生物体内发育、分化、环境胁迫和肿瘤发生中具有重要的意义。
目前已有研究证明多种因素能够诱导细胞发生自噬，如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等。
但是关于自噬信号的传递，现有的研究只明确了几种信号通路，包括抑制类和激活类，但具体的机制尚在研究中。
细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个扁平的类似“脂质体”样的膜结构，称为Phagophore。
随着Phagophore不断延伸，将胞浆中的细胞器等成分，包裹住成为密闭的结构，称为“自噬体（autophagosome）”。
自噬体形成后，可与溶酶体融合，自噬体中的内容物随即被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。
自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)使用指南1404
自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP（-RFP）-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。
mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。
（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。
2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。
建议不要在-20℃下长期保存。
如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。
3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品（购买时请提出）。
自噬相关基因Atg4B及LC3_在肌萎缩侧索硬化症转基因鼠海马中的表达及意义
周风华等 自噬相关基因 Atg4B 及 LC3-Ⅱ在肌萎缩侧索硬化症转基因鼠海马中的表达及意义 第 12 期
基金项目：国家自然科学基金青年基金（81401066） ；山东省自然科学基 金（ ZR2012HQ021） ；山东省教育厅课题（ J11LF16，J12LK51， J13LK05） ；山东 省 医 药 卫 生 科 技 发 展 计 划 项 目 （ 2013WS0279） ；潍 坊 市 科 学 技 术 发 展 计 划 项 目 （ 201302089，201301074）
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生型小鼠比较，在发病的早期，突变型小鼠 Atg4B 阳性细胞累 积光密度变化不明显，而在发病中、晚期，突变型小鼠 Atg4B 阳 性细胞累积光密度在 DG 区 明 显 降 低 （ 68. 5 ± 5. 2 vs 32. 3 ± 2. 6，P ＜ 0. 05） ，CA 区阳性细胞累积光密度变化不明显 （ P ＞ 0. 05） 。RT-PCR 结果 显 示，与 野 生 型 小 鼠 比 较，在 发 病 的 早 （61. 2 ± 5. 7 vs 58. 2 ± 7. 2） 、中（60. 1 ± 5. 2 vs 38. 5 ± 4. 7） 、晚期 （59. 5 ± 4. 2 vs 39. 7 ± 3. 5） ，突变型小鼠 Atg4B mRNA 水平明显 下调（ P ＜ 0. 05） ，见图 1，图 2。 2. 2 LC3-Ⅱ在海马组织中的表达呈上调趋势 免疫荧光检测 显示，在野生型及突变型小鼠海马组织中，均检测到 LC3-Ⅱ阳性 细胞，阳性细胞主要分布在海马的 DG 区。与野生型小鼠比较， 在发病的早期，突变型鼠 LC3-Ⅱ阳性细胞累积光密度变化不明 显，在发病的中、晚期，突变型鼠 LC3-Ⅱ阳性细胞累积光密度明显 增加（62. 5 ± 6. 1 vs 35. 3 ± 4. 5，P ＜ 0. 05）。RT-PCR 结果显示，与 野生型小鼠比较，在发病的早（36. 5 ± 4. 2 vvs 34. 1 ± 5. 3）、中 （38. 3 ± 5. 1 vs 39. 1 ± 4. 3）、晚期（40. 5 ± 5. 6 vs 39. 8 ± 4. 2），突 变型小鼠 LC3-Ⅱ mRNA 水平变化不明显（ P ＞ 0. 05），见图 3，图 4。
汉恒生物 线粒体自噬操作指南说明书
线粒体自噬操作指南汉恒生物科技（上海）有限公司目录背景 (2)一、汉恒线粒体自噬表型研究工具 (2)二、汉恒线粒体自噬通路研究工具 (3)◼病毒安全使用注意事项 (3)◼收到病毒后的处理 (4)腺病毒的操作 (5)◼腺病毒感染细胞预实验（MOI的摸索） (5)◼感染目的细胞 (7)（一）细胞准备 (7)（二）病毒感染 (7)（三）观察感染情况 (8)（四）结果分析 (8)背景自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新线粒体自噬是细胞在应对氧化应激等压力条件下一种基本的生物学现象，细胞通过自噬的机制选择性地清除线粒体的过程。
选择性清除受损伤或功能不完整的线粒体对于整个线粒体网络的功能完整性和细胞生存来说十分关键。
一、汉恒线粒体自噬表型研究工具我们用自噬小体单标工具LC3-GFP标记自噬小体，用mito-RFP标记线粒体。
GFP-LC3和RFP-LC3等单标记的荧光探针可以监测LC3蛋白参与自噬起始过程。
mito-RFP 线粒体特异性定位荧光探针（pHBmTur-Mito）可准确标记定位线粒体，两者共转染细胞即可准确实时地追踪线粒体自噬的动态过程。
除此外，我们研发了专用于线粒体自噬的mt-keima，可独立应用于线粒体自噬的研究，mt-keima所表达的 Keima 蛋白定位于线粒体基质, 当线粒体自噬体与酸性溶酶体融合后Keima 蛋白的荧光信号由绿色转为红色，荧光信号的转换可定量反映线粒体自噬的发生发展，是我们研究线粒体自噬不可或缺的利器相关产品列表：备注：汉恒生物同时提供相关基因慢病毒和腺相关病毒包装服务，满足广大科研工作者不同实验需求，如使用慢病毒和腺相关病毒产品，具体操作参考相应技术文档。
汉恒生物线粒体自噬的研究方法
第49卷第5期兰州大学学报（自然科学版）Vol.49No.5文章编号:0455-2059(2013)05-0693-07线粒体自噬的研究方法张迎梅,邱倩,漆永梅兰州大学生命科学学院,兰州730000摘要:线粒体自噬是一种选择性清除多余或受损线粒体的自噬过程,在调节细胞内线粒体数量和维持线粒体正常功能等方面发挥重要作用,并涉及诸多生理和病理学过程.有关线粒体自噬的研究报道始于21世纪初,近年来发展十分迅速.目前,研究线粒体自噬的方法众多,各有利弊,但没有一种检测手段可以独立说明线粒体自噬的发生或反映线粒体自噬的活性.本文旨在对目前有关线粒体自噬的研究方法与技术及其优缺点等方面做一总结,供线粒体自噬研究者参考.关键词:线粒体自噬;线粒体自噬体;线粒体自噬溶酶体;检测方法中图分类号:Q5;Q2;Q95文献标识码:AMethods in studying mitophagyZHANG Ying-mei,QIU Qian,QI Yong-meiSchool of Life Sciences,Lanzhou University,Lanzhou730000,ChinaAbstract:Mitophagy,the selective removal of dysfunctional mitochondria by autophagy,is an important mitochondrial quality control and function stabilizing mechanism which has been implicated in many different physiological and pathological processes.The research on mitophagy was begun in the beginning of this century with rapid development.However,numerous methods in mitophagy research have some shortcomings and there are still no effective or standard methods for monitoring or assessing mitophagy.This review aims to show those current techniques and methods with their advantages and disadvantages in the study of mitophagy.Key words:mitophagy;mitophagosomes;mitolysosomes;detection method线粒体是真核细胞进行生物氧化和能量转换的重要场所,涉及细胞内稳态、增殖、能动性、衰老和死亡等多种生物学过程[1].线粒体因其DNA 缺乏组蛋白的保护且修复机制不健全而易受外源或自身代谢产生的自由基(Reactive oxygen species, ROS)的攻击或因其他胁迫而发生损伤[2],线粒体受损后发生膜通透性转变(Mitochondrial perme-ability transition,MPT),氧化磷酸化解耦联,ATP 过度消耗引发细胞坏死,或者线粒体肿胀后细胞色素c释放到细胞质触发凋亡[3].适时清除受损线粒体以保持其数量和质量的稳定对于细胞正常生长和代谢具有非常重要的意义[4−5].线粒体自噬是一种选择性清除受损线粒体的特异性自噬现象[6−7],根据线粒体自噬过程的特征,可将其分为4个时期[8]:1)前期线粒体受损后发生通透性转变,导致线粒体去极化,诱导线粒体自噬相关蛋白活化[9];2)早期自噬体包裹受损线粒体,形成线粒体自噬体(Mitophagosomes)[10];3)中期线粒体自噬体与溶酶体融合后形成成熟的线粒体自噬溶酶体(Mitolysosomes)[11];4)末期线粒体被溶酶体降解.以上各期特点如图1所示.线粒体自噬除了介导受损或者多余线粒体的降解,对网织红细胞成熟过程及受精后精子来源的线粒体清除有重要意义[12−13],与局部缺血或药物诱导的组织损伤以及许多神经退行性疾病和癌症的发生发展也密切相关[14],因此有关线粒体自噬的问题越来越受到学者们的关注.目前研究线粒体自噬及其活性的方法主要包括以下3种类型:MP线粒体自噬体(Mitophagosomes);ML线粒体自噬溶酶体(Mitolysosomes);∆Ψm线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential)图1线粒体自噬过程的4个时期Figure1Four stages of mitophagy1)通过电子显微镜或荧光显微镜直接观察线粒体自噬体的结构或线粒体自噬的动态过程;2)通过流式细胞术检测线粒体膜电位、线粒体总量及免疫印迹技术检测线粒体自噬相关蛋白表达量的变化等方法间接反映线粒体自噬活性;3)通过人为对线粒体自噬通路进行实验性调节来全面评价线粒体自噬对细胞或机体形态和功能的影响.本文就目前线粒体自噬不同时期的研究方法和技术及其优缺点等方面综述如下,供线粒体自噬研究者参考.1电子显微镜技术自20世纪50年代比利时科学家Duve[15]在溶酶体的研究中通过电镜第一次观察到自噬现象至今,透射电镜技术(Transmission electron mi-croscopy,TEM)始终被认为是研究自噬发生的最直接、最可靠的手段.线粒体自噬早期形成的线粒体自噬体可以通过线粒体特有的双层膜、嵴等特征辨别,而其与溶酶体融合形成的线粒体自噬溶酶体仅能通过单层膜或消化后的残留物来大体识别[14](表1b).尽管如此,电镜技术也受到诸多因素的影响,获得的结果存在很大的变性,如因切片等人为因素造成的膜结构的改变,其他双层膜细胞器的干扰或者低电子密度空泡的误导等[16].因此,常规的透射电镜观察方法仅能对完整的线粒体自噬体进行观察,由于选取细胞数量有限,无法反映自噬活性,在定量分析中存在很大的不足.近年来,免疫金电镜技术开始用于自噬的定量分析,在线粒体自噬的研究中,利用线粒体蛋白如Tom20, CypD等和自噬体标记蛋白的抗体共定位标记线粒体自噬体,通过测量自噬囊泡面积对其进行定量分析,结合其他检测方法可反映线粒体自噬的活性变化[17−18].2荧光显微镜技术电镜观察线粒体亚结构的变化及线粒体自噬体的形成,仅能初步证明线粒体自噬是否发生,但不充分,还需要进一步结合线粒体与自噬体及溶酶体共定位的方法才能证明线粒体自噬是否发生.通过特异性荧光标记的手段,利用荧光显微镜技术,可进行线粒体溶酶体的荧光共定位观察.目前,用于线粒体自噬荧光标记的方法主要有3种:荧光标记基因转染技术、荧光探针标记技术及自噬相关蛋白免疫荧光技术.2.1荧光标记基因转染技术将自噬体和线粒体特异性蛋白的基因与天然荧光蛋白基因连接起来构成融合基因,导入细胞内表达,借助荧光显微镜对标记蛋白进行细胞内活体跟踪,可对线粒体和自噬体进行共定位分析. Gottlieb等[19]利用发射红色荧光且定位于线粒体的融合蛋白基因pDsRed2-mito与GFP-LC3联合转染细胞,进行线粒体和自噬体的共定位,通过去卷积运算及3维立体重构技术得到自噬体包裹线粒体的3维结构图,可直观反映线粒体自噬体的形成及其结构.但此方法仅适用于线粒体自噬早期的检测,无法反映其末期的降解情况.而另一种融合蛋白基因mKeima稳定表达一种在酸性和中性条件下分别发射红色和绿色荧光的天然蛋白,可用于线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体的定性和定量分析[20].Katayama等[21]通过将COX VⅢ的前导肽序列与mKeima串联起来构成一种融合基因mt-mKeima,使其所表达的Keima蛋白定位于线粒体基质,当线粒体自噬体与酸性溶酶体融合后Keima蛋白的荧光信号由绿色转为红色,荧光信号的转换可定量反映线粒体自噬的活性[8](图2和表1f).但是,长时间激发光照射对转染细胞样品的荧光强度有较大影响,而且溶酶体酶活力和胞浆的酸化程度也会影响到荧光信号的检测.a正常未处理的神经细胞中,只有少数的线粒体呈酸性状态;b诱导线粒体自噬后,大量线粒体酸化图2转染mito-Keima的神经细胞中Keima蛋白的荧光变化[8]Figure2Neurons transfected mito-Keima showing the change of Keima2.2荧光探针标记技术利用线粒体和溶酶体特异性染色技术也可对线粒体和自噬体进行共定位.在培养细胞中可利用线粒体特异性荧光探针TMRM(Tetramethylrho-damine methylester),MitoTracker 和溶酶体特异性荧光探针LysoTracker 染色并结合自噬体的荧光标记技术来追踪线粒体自噬的动态过程.MitoTracker ,LysoTracker 也可用于固定细胞的线粒体和溶酶体染色[22].线粒体去极化(Mitochon-drial depolarization)是线粒体自噬前期的重要事件[9],可利用线粒体膜电位依赖性荧光探针TMRM ,MFFR(Mitofluor far red)、罗丹明123(Rhodamine 123)或JC-1(5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide)染色后通过流式细胞术或荧光显微镜技术检测.但这些染料的荧光强度随膜电位降低而减弱,因此无法进行细胞固定后检测.另外,非培养条件下线粒体膜电位也会有所变化,因此染色后必须尽快完成后续表1线粒体自噬各期的检测方法[23−24]Table 1Detection methods on different stages of mitophagy时期检测指标原理检测方法分析与评价早期线粒体自噬EM 结果变性较大,不适于做定量体直接观察分析,仅作定性参考线粒体和自噬FM 直接反映自噬体包裹线粒体的体荧光共定位事实,但无法说明线粒体自噬末期的降解情况末期线粒体总量检测−FC 可快速检测线粒体总量的改变,但荧光极易淬灭线粒体蛋白表达量检测−IB定量分析的高效方法,但线粒体自噬特异性蛋白的选择尚有疑问mtDNA 定性和FM 线粒体总量变化受多种因素影响,定量分析FC仅依靠mtDNA 降解程度难以反映线粒体自噬活性情况MP 线粒体自噬体(Mitophagosomes),ML 线粒体自噬溶酶体(Mitolysosomes),Ψm 线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential),EM 电子显微镜技术(Electron microscopy),FM 荧光显微镜技术(Fluorescence microscopy),IF 免疫荧光技术(Immunofluorescence),IB 免疫印迹技术(Immunoblotting),FC 流式细胞技术(Flow cytometry),TMRM 四甲基罗丹明甲酯(Tetramethylrhodamine methylester),MTG 线粒体示踪绿(MitoTracker green),LTR 溶酶体示踪红(LysoTracker red).检测.MitoTracker是一种持久的线粒体特异性荧光探针,可被活细胞摄取和累积,较之传统的线粒体荧光探针TMRM等,其荧光不依赖膜电位而变化,仅需一个温和的共价巯基结合于线粒体蛋白并在线粒体去极化后仍保持不变[25].MitoTracker 具有多个颜色的变体,可结合其他荧光标记手段选择所需荧光色彩进行双染或者三联染色,如LC3-GFP,MTR(MitoTracker red)联合标记(表1c),用于线粒体自噬体的定位[14].LysoTracker是一种偏酸性的胺类荧光探针,可用于对活细胞内的酸性区室(如溶酶体、内吞体、自噬体等)染色示踪,其敏感度极高,并可在乙醛固定后稳定保持[26],也有多个荧光色彩的变体可选.但是这种探针作为溶酶体非特异性的探针不能单独用于线粒体自噬的分析,必须与其他的方法相结合,如LTR(LysoTracker red)与MTG(MitoTracker green)联合染色(表1d),用于线粒体自噬体与溶酶体融合的共定位[27]. TMRM,MTG两种荧光染料均可在极化的线粒体中蓄积,TMRM可以通过荧光共振能量转移使MTG荧光淬灭,单独发红色荧光.但当线粒体去极化后,TMRM被释放,MTG发出绿色荧光,聚集在细胞核周围[28].因此,用TMRM,MTG联合染色可特异性标记新的去极化线粒体(表1a).当对细胞同时进行TMRM,MTG,LTR染色时,可以通过荧光显微镜观察去极化的线粒体是否与溶酶体融合,亦即是否发生了线粒体自噬[25]. Kim等[29]利用发蓝色荧光的MFFR代替TMRM,联合GFP-LC3及LTR在线粒体动态监测中可更方便地观察线粒体自噬的动态变化过程.此外,荧光探针标记技术也可与荧光标记的线粒体自噬标志蛋白基因转染技术结合来示踪线粒体自噬[30]. 2.3免疫荧光技术在固定细胞中,选用线粒体和溶酶体特异性蛋白的抗体对线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体进行免疫荧光标记,如溶酶体膜蛋白LAMP-1或LAMP-2,线粒体基质蛋白Hsp60和CypD(表1e),线粒体膜蛋白VDAC1,Tom20等.然而,线粒体自噬并非受损线粒体蛋白的唯一降解方式,研究者发现许多线粒体外膜及膜间隙蛋白的降解是由Parkin依赖性的泛素蛋白酶系统介导的,还有一部分线粒体外膜蛋白在Parkin的介导下逃逸至内质网以躲避降解[31],而大多数的线粒体内膜蛋白及基质蛋白的降解则是由Parkin依赖性的线粒体自噬介导的,但其具体机制还不清楚[32].因此,同时选用CypD,Hsp60等线粒体基质蛋白或者内膜蛋白的抗体进行免疫荧光标记来检测线粒体自噬可能会更严谨.除了通过线粒体溶酶体的共定位来说明线粒体自噬之外,也可以通过线粒体DNA(mtDNA)的降解来反映线粒体自噬的活性.线粒体中ROS的累积可导致mtDNA的突变,并进一步诱导线粒体自噬.PicoGreen是一种可穿透线粒体膜,对mtDNA进行特异性标记的荧光探针,通过免疫荧光技术检测PicoGreen的荧光信号强度可反映mtDNA的降解程度[33].PicoGreen也可用于活细胞染色,Kim等[10]利用PicoGreen,TM-RM和LTR对来源于野生型小鼠的肝脏细胞线粒体自噬过程中mtDNA的降解进行监测(表1g).3免疫印迹技术免疫印迹技术(Immunoblotting,IB)可用于线粒体自噬的定量分析,通过检测线粒体蛋白的表达量变化可反映末期线粒体总量(Mitochondrial mass)的改变,从而间接反映线粒体自噬的活性.通常选线粒体基质蛋白Hsp60,CypD,线粒体膜蛋白VDAC1,Tom20等,但考虑到不同线粒体蛋白降解过程的线粒体自噬依赖性的不同[32],最好分别选取线粒体内外膜蛋白、基质与膜间隙蛋白,从而全面反映线粒体总量的变化.在酵母线粒体自噬的定量分析中用GFP标记的线粒体外膜蛋白基因GFP-Om45转染细胞,线粒体自噬过程中Om45降解,释放出游离的GFP可稳定存在,通过免疫印迹检测GFP的含量即可定量分析线粒体自噬的活性[34],但由于哺乳动物细胞溶酶体酸性状态可使GFP快速降解,此方法不适用其线粒体自噬的检测.此外,通过标准比色法检测柠檬酸合酶的活力也可以反映线粒体的总量[35].介导线粒体自噬的一些特异性蛋白的稳定性、表达量及活性的变化也可以通过免疫印迹技术来分析,进而定量地反映线粒体自噬的发生及其活性.如在PINK1/Parkin介导的线粒体自噬途径中, PINK1在正常条件下以线粒体膜电位依赖性的方式被蛋白水解酶快速降解,而线粒体去极化能使其稳定,并在线粒体膜上累积聚集[30,36],进而通过磷酸化Parkin使之从细胞质向功能紊乱的线粒体上募集[37],以介导线粒体自噬性的降解.另外,低氧条件下,NIX表达量的显著上升和FUNDC1的去磷酸化[38−39],也可介导线粒体自噬的发生.4流式细胞技术流式细胞技术(Flow cytometry,FC)作为单细胞定量分析和分选的手段,在线粒体自噬的检测中被广泛应用.通过流式细胞技术定量检测TMRM、罗丹明123或JC-1染色后线粒体荧光强度的变化可反映线粒体的损伤程度.线粒体自噬性降解会导致细胞内线粒体总量的减少[8]. Zhang等[40]在网织红细胞成熟过程线粒体自噬清除的研究中,利用线粒体特异荧光探针MTG对线粒体染色后通过流式细胞技术检测荧光总量来反映末期线粒体总量的变化.而Yoshii等[32]通过流式细胞技术检测稳定表达GFP标记的线粒体外膜蛋白GFP-Omp25的Parkin野生型MEFs细胞经CCCP(Carbonyl cyanide3-chlorophenyl hydra-zone)处理诱导线粒体自噬,发现GFP-Omp的含量在线粒体自噬诱导后随时间的延长而降低,也可反映线粒体自噬的活性.但以线粒体的总量变化来反映其自噬活性的方法必须联合其他检测手段才能说明线粒体自噬.5线粒体自噬的诱导与抑制在线粒体自噬对机体或细胞的行为和效应分子影响的研究中,一般通过人为干预的方式来诱导或抑制线粒体自噬,方法主要包括药物处理、物理损伤、饥饿及线粒体自噬基因敲除、沉默或过表达等.有关线粒体自噬的分子途径和功能研究中,常用线粒体的解偶联剂CCCP和FCCP(Carbonyl cyanide4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)作为诱导剂,引发细胞内全部线粒体短时间内剧烈的去极化及线粒体自噬的发生,但这两种诱导剂也可造成细胞骨架的破坏及溶酶体酸化的抑制,因此,实验中也会用到如K+载体缬氨霉素(Valino-mycin)、抗霉素A(Antimycin A)等一些比较温和的诱导药物[41].此外,饥饿和光照辐射也可以诱导部分线粒体发生自噬[10,22,29].在表达KillerRed-d Mito(一种光敏蛋白,定位于线粒体基质)的Parkin 野生型细胞中,通过光照辐射激发KillerRed发射荧光,可导致ROS的急剧增加,诱导线粒体自噬的发生,这是一种可在时间和空间上进行人为控制的线粒体自噬诱导方法[42].线粒体的保护剂,包括影响ATP生成与降解的药物、降低线粒体膜通透性的药物、铁依赖脂质过氧化作用的抑制剂、Ca2+阻滞剂和Ca2+依赖蛋白酶抑制剂等.乙酰左旋肉毒碱(Acetyl-L-carnitine,ALC)作为细胞呼吸的替代底物,可恢复呼吸效率,促进ATP生成,维持线粒体膜电位,抑制脂质过氧化,常用于线粒体紊乱导致的神经退行性疾病及病理性损伤的治疗研究[43].环孢菌素A(CyclosporinA,CsA)是一种线粒体通透性转变的特异性抑制剂,可通过干扰亲环素D(Cyclophilin D)和线粒体通透性转变孔的相互作用抑制线粒体的去极化和线粒体自噬体的形成[44].在Rodriguez等[27]的研究中,作为线粒体自噬诱导后的保护剂,可明显降低线粒体自噬体的总量.此外,非免疫抑制剂NIM811(N-methyl-4-isoleucine cyclosporin)也可发挥同样作用[45].线粒体自噬相关基因的敲除、沉默或过表达,可用于某一特定基因在整个线粒体自噬通路中功能的研究.如在果蝇PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬途径的研究中发现,敲除PINK1和Parkin,可造成线粒体自噬的抑制[46],PINK1过表达不能补偿Parkin缺失所造成的线粒体自噬阻滞,而Parkin的过表达却可以部分缓解PINK1缺失造成的线粒体自噬阻滞[47].6小结线粒体自噬的研究方法众多,各有优势,但没有一种手段可以独立说明线粒体自噬的发生并反映其活性.受损的线粒体不仅可通过自噬的方式得到清除,也可能发生线粒体凋亡(Mitoptosis)[48].因此,研究线粒体自噬形态与功能,需针对其各期特点和发生机制,多指标与多技术联合,体内与体外、定性与定量实验相结合,并通过人为干预的实验性调节来研究线粒体自噬对机体或细胞的行为和效应分子的影响.在目前线粒体自噬尚无标准化的检测或监控技术的情况下,建议研究者理性地分析和对待采用不同技术手段所获得的有关线粒体自噬的实验结果,并在现有基础上寻找和创新线粒体自噬研究的新方法和新技术.这不仅是线粒体自稳态调节的深入研究所必需的,更对线粒体自噬的调控在衰老、神经退行性疾病和癌症治疗中的研究有重要意义.参考文献[1]Detmer S A,Chan D C.Functions and dysfunc-tions of mitochondrial dynamics[J].Mol Cell Biol, 2007,8(11):870−879.[2]Yakes F M,Van Houten B.Mitochondrial DNAdamage is more extensive and persists longer than nuclear DNA damage in human cells following oxida-tive stress[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(2): 514−519.[3]Lemasters J J,Nieminen A-L,Qian T,et al.The mitochondrial permeability transition in cell death:a common mechanism in necrosis,apopto-sis and autophagy[J].Biochim Biophys Acta,1998, 1366(177/196):177−196.[4]Guarente L.Mitochondria:a nexus for aging,calorie restriction,and sirtuins?[J].Cell,2008, 132(2):171−176.[5]Melser S,Chatelain Etienne H,La vieJ,et al.Rheb regulates mitophagy induced by mitochondrial energetic status[J].Cell,2013,17(5): 719−730.[6]Lemasters J J.Selective mitochondrialautophagy,or mitophagy,as a targeted defense against oxidative stress,mitochondrial dysfunction, and aging[J].Rejuv Res,2005,8(1):3−5.[7]Fimia G M,Kroemer G,Piacentini M.Molecu-lar mechanisms of selective autophagy[J].Cell Death Differ,2013,20(1):1−2.[8]Klionsky D J,Abdalla F C,Abeliovich H,et al.Guidelines for the use and interpretation of as-says for monitoring autophagy[J].Autophagy,2012, 8(4):445−544.[9]Rodriguez E S,He L,Lemasters J J.Role ofmitochondrial permeability transition pores in mito-chondrial autophagy[J].Int J Bilchem Cell B,2004, 36(12):2463−2472.[10]Kim I,Lemasters J J.Mitochondrial degradationby autophagy(mitophagy)in GFP-LC3transgenic hepatocytes during nutrient deprivation[J].Am J Physiol Cell Physiol,2011,300(2):C308−317. 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细胞自噬与代谢ppt课件
蛋白酶体途径：降解细胞内短寿(short-lived)、多聚泛素化(ubiquitination)的蛋白质。 原核生物：通过19S的蛋白酶体能识别靶蛋白的特定氨基酸序列并将其降解。 真核生物：则是通过26S的蛋白酶体降解蛋白质。 内吞途径：将跨膜蛋白运送到溶酶体降解。 细胞自噬途径：而长寿蛋白(long-lived protein)、蛋白聚集物及膜包被的细胞器是通过细胞自噬的方式在溶酶体降解。
Part 1
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自噬的概念
1.2 自噬的分类——大自噬的非特异性与特异性
应激功能 细胞自噬是细胞在饥饿条件下的一种存活机制。 当营养缺乏时，细胞自噬增强，使非关键成分降解，释放出营养成分，以保证过程的继续。 防御功能 在细胞受到致病微生物感染时，细胞自噬起一定的防御作用。 维持细胞稳态 在骨骼机和心肌，细胞自噬有特殊的“看家”(house keeping)功能，帮助细胞浆成分，包括线粒体，进行更新。 延长寿命 细胞自噬可降解损伤的细胞器、细胞膜和变性蛋白等胞内成分。 如果细胞自噬受损衰竭，细胞损伤就会堆积、累加，产生老化。 控制细胞死亡及癌症 当前，决定细胞自噬导致细胞死亡，还是维持细胞存活的因子尚不完全清楚。所以，细胞自噬与细胞死亡之间的因果关系还没有最后定论。
胞质内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中，然后被溶酶体酶消化。CMA 的底物是可溶的蛋白质分子，在清除蛋白质时有选择性，而前两者无明显的选择性。
3
分子伴侣介导的自噬（CMA）：
Part 1
Part 1
自噬的概念
1.2 自噬的分类——根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同
通常认为大自噬是一种非特异过程。但是，在一些情况下细胞器，如：线粒体，过氧化物酶体等，似乎是优先包裹的对象，提示有一定选择性或特异性。
线粒体自噬研究概论
线粒体自噬线粒体自噬研究概论关于线粒体自噬线粒体自噬(mitophagy)是指细胞通过自噬的机制选择性地清除线粒体的过程。
选择性清除受损伤或功能不完整的线粒体对于整个线粒体网络的功能完整性和细胞生存来说十分关键。
线粒体自噬主要的作用有几个方面：1.选择性清除功能受损的线粒体2.选择性调节细胞内线粒体数量3.通过线粒体影响诸多生理和病理学过程Fig:The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria Cell Death and Differentiation(2013)20,31–42线粒体自噬的信号通路1)Pink/Parkin pathway2)Bnip3/Nix pathway3)FUNDC1pathwayFig.Mitophagy pathway:Pink1/Parkin OR Bnip3/NixPink1/Parkin pathway：E3泛素连接酶Parkin和蛋白激酶Pink1一起介导了线粒体膜电位下降,引起的线粒体自噬的发生,当线粒体损伤后,线粒体膜电位下降,引起Pink1蛋白在损伤线粒体上的积累,能够吸引Parkin到损伤的线粒体上。
Parkin使得线粒体外膜上的很多蛋白发生泛素化,从而能够募集其他一些相关蛋白,介导线粒体自噬的发生。
线粒体自噬汉恒线粒体自噬研究工具与研究方法汉恒生物有多种线粒体自噬病毒研究工具可以提供，便于直接感染目的细胞后直观地观察线粒体自噬的变化一、汉恒线粒体自噬表型研究工具1）Ad-GFP-LC3腺病毒病毒系统，可高效感染目的细胞，表达GFP-LC3，感染感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬的整体水平（由于GFP荧光偏弱，暂停Ad-GFP-LC3销售，慢病毒单标LV-GFP-LC3荧光正常，正常销售）；2）Ad-HBmTur-Mito腺病毒系统（红光标记），为汉恒生物自主研发的线粒体特异性定位荧光探针（pHBmTur-Mito）可准确定位标记线粒体，结合汉恒独家推出的双荧光LC3细胞自噬腺病毒的使用，即可准确实时地追踪线粒体自噬的动态过程；使用方法：Ad-GFP-LC3+Ad-HBmTur-Mito共感染目的细胞，confocal检测双荧光共定位的情况，如果共定位，则存在线粒体自噬！（下图说明：红色标记为线粒体，绿色标记自噬小体，二者有共定位时代表自噬发生）二、汉恒线粒体自噬通路研究工具1）Ad-Parkin-EGFP2）Ad-Bnip3-EGFP+Ad-Nix-EGFP3）Ad-FUNDC1-EGFP使用方法：与汉恒Ad-HBmTur-Mito定位线粒体共感染目的细胞，confocal检测共定位情况，鉴别相关信号分子的线粒体转位！汉恒生物-自噬工具与解决方案专家线粒体自噬的异常和很多疾病密切相关,因此对于线粒体自噬的具体分子机制以及生理意义研究有很重要的生物学意义。
一张图带你了解细胞自噬研究
一张图带你了解细胞自噬研究自噬是细胞在自噬相关基因(autophagy related gene，Atg)的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。
对实现细胞代谢需要、更新某些细胞器并维持细胞内稳态有较重要的作用。
近几年，自噬研究的热度不减，国自然相关研究的中标数量也呈增长趋势，在2016年，自噬相关研究被授予了诺贝尔生理医学奖。
自噬国自然中标趋势自噬是一种非常基础的生命活动现象，它可能参与生命活动的方方面面，比如肿瘤、炎症、免疫应答、氧化应激等。
通常情况下，除了研究自噬现象本身，大家更多的是将自噬与各种生命活动或者疾病结合起来，把自噬作为这些方向的一个机制来研究。
比如研究自噬如何参与肿瘤的发生发展、如何参与肿瘤的耐药性与复发转移、如何参与肿瘤免疫治疗的效果、自噬如何参与炎症反应、自噬如何参与氧化应激，甚至自噬如何参与自闭症、阿兹海默症的发生与治疗等。
汉恒生物也为大家整理了基础的自噬研究模式：在2017年7月汉恒客户发表的Cell论文中（文章名：Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy），也是运用了这一思路。
I-自噬参与表型-汉恒自噬黄金标准（后文详解）自噬关键基因变化的分子机制以及跟对应表型的关系自噬表型研究中，汉恒生物一直倡导“自噬研究的金指标”----包括LC3剪切的变化、电镜直接观察到自噬囊泡、荧光蛋白标记的LC3监测自噬流。
图A 图B 图C衡量自噬的三个“黄金标准”，分别是LC3的翻译后加工及脂化修饰（图A）、利用电镜直接观察自噬小体和自噬溶酶体的多少（图B）、荧光蛋白标记的LC3监测自噬流（图C）。
荧光蛋白标记的LC3监测自噬流，即用汉恒的mRFP-GFP-LC3融合蛋白的腺病毒，感染细胞。
mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
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自噬（Autophagy）及其研究方法概述汉恒Th物技术服务手册目录1概念2自噬的过程3自噬的特性4自噬过程的调控5自噬与肿瘤的关系6自噬的研究方法概述7汉恒自噬研究特色服务自噬研究相关产品及服务1.病毒工具（独家推出）mRFP-GFP-LC3腺病毒系统，可高效感染目的细胞，表达mRFP-GFP-LC3，感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬发Th过程（具体内容后面有介绍）；2.自噬相关服务汉恒Th物可提供自噬研究整体科研服务，若您的时间紧张或是对实验有所顾忌，我们可以为您代劳部分实验内容；3.自噬研究相关试剂汉恒Th物可以根据您的实验需求为您提供最实用的试剂产品，让你用的放心，省心！产品厂商规格A14292,Premo自噬TB/GFP TR-FRETinvitrogen6000Tests LC3B抗体试剂盒pllabs0.1mgAnti-MAP1A/LC3A/B自噬微管相关蛋白轻链3抗体pllabs0.1mgAnti-MAP1LC3A(microtubule-associated protein1light chain3)自噬微管相关蛋白轻链3抗体Invitrogen1mg/1ml兔抗人、大、小APG4B细胞自噬相关抗体\Anti-APG4B/AUTL1BD1mg/1ml自噬微管相关蛋白轻链3抗体\Anti-MAP1LC3AAnti-SQSTM1/p62antibody abcamSigma1g溶酶体抑制剂Hydroxychloroquine（羟氯喹）mTOR抑制剂rapamycin Sigma20mM自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）Sigma100mg1概念目前根据发Th过程分为三类：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy（CM A）大自噬（Macroautophagy）即我们说的自噬（autophagy）;微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式;分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侣，如hsp70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。
通常说的自噬泛指Macroautophagy。
自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚.自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体（autophagosome），最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autophagolysosome），降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
自噬的过程步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发Th的铁证之一。
步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，即“自噬体”。
电镜下观察到自噬体是自噬发Th的铁证之二。
有两个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。
步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（这种情况不是必然要发Th的）。
步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，两者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。
3自噬的特性1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。
事实上，细胞正常情况下很少发Th自噬，除非有诱发因素的存在。
这些诱发因素很多，也是研究的热门。
既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、Th长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。
由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。
2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。
这有利于细胞快速适应恶劣环境。
3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。
第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。
4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别autophagosomeautolysosome5）“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。
6）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来。
4自噬过程的调控从上面总结的自噬特点中可以看出，自噬这一过程一旦启动，必须在度过危机后适时停止，否则，其非特异性捕获胞浆成分的特性将导致细胞发Th不可逆的损伤。
这也提醒我们在研究自噬时一定要动态观察，任何横断面的研究结果都不足以评价自噬的活性。
目前，已经报告了很多因素能诱导细胞发Th自噬，如饥饿、Th长因子缺乏、微Th物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等，这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白接受信号、又有哪些自噬蛋白去执行等很多问题都还在等待进一步解答中。
关于传递自噬信号的通路目前比较肯定的有：抑制类1）Class I PI3K pathway（PI-phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇）与IRS(Insulin receptor substrate)结合，接受胰岛素受体传来的信号（血糖水平高抑制自噬）。
2）mTOR pathway（mammalian target of rapamycin）mTOR在人类中的同源基因是FRAP1（FK506binding protein12-rapamycin associated protein1），是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。
能接受多种上游信号，如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受营养和能量的变化,rapamycin是最典型最常用的自噬激动剂。
激活类1）Class III PI3K结构上类似于Class I PI3K，但作用相反。
3-MA是Class III PI3K的抑制剂,因此3-MA可以作为自噬的抑制剂。
5自噬与肿瘤的关系与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。
无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的。
因为细胞中随时产Th的“垃圾”（破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等）都需要及时清除，而这主要靠自噬来完成，因此，自噬具有维持细胞自稳的功能；如果将自噬相关基因突变失活，如神经元会发Th大量聚集蛋白，并出现神经元退化。
同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供一定的能量和合成底物，可以说，自噬就是一个“备用仓库”。
如Atg-5缺陷的小鼠在出Th后喝上第一口奶之前就会饿死。
更重要的是，自噬活性可在代谢应激（饥饿、Th长因子缺乏、射线、化疗等）时大大增强，表现为胞浆中迅速涌现大量自噬体，有利于细胞的存活。
鉴于自噬的上述作用，自噬可为肿瘤细胞带来几大好处：1）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发Th初始期到血管发Th之前、肿瘤长大发Th血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。
2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产Th大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件.由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发Th坏死的机会，而对于肿瘤细胞群体而言，需要一部分细胞发Th坏死，以引发适度的炎症（有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌Th长因子等）。
研究发现，很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K信号以抑制自噬（由于凋亡通路已受阻，抑制自噬会促进坏死），但具体机制尚不清楚。
Inhibiting autophagy for cancertherapy.A,surgery,chemotherapy,targetedtherapies,and radiation can allactivate autophagy.Treatmentof cancer cells with chloroquine(CQ)derivatives leads todeacidification of lysosomesfollowed by an accumulation ofineffective autophagic vesicles.In cells dependent onautophagy for survival,autophagy inhibition withchloroquine leads to cell death.B and C,electron micrographsof PC3prostate cancer cellseither untreated(B)or treatedwith chloroquine(C).Bar,2μm.自噬与肿瘤的关系可能是双重的。
①对不同的细胞，自噬的作用可能不同。
②相同的细胞在不同的外部因素作用时，自噬的作用可能不同。
③在肿瘤发Th发展的不同阶段，自噬的作用可能不同。
肿瘤Th长的早期阶段自噬增强，是由于此时肿瘤的血管化作用不足，癌细胞的营养供给有限，需要通过自噬为自身提供营养。
肿瘤进入发展阶段后基因变异积累，使包括B e c li n1在内的众多抑癌基因失活，自噬活力降低。
④对单个细胞和对整个肿瘤阻滞的作用可能不同。
自噬功能不全的细胞易于坏死，但是坏死组织产Th的细胞因子（包括部分Th长因子）反而会促进肿瘤的Th长。
上述各种假设均有待证实。
肿瘤为细胞分化障碍性的疾病已得到肯定，但自噬在肿瘤细胞的分化抑制过程中起着什么样的作用，自噬水平提高是抑制分化甚至导致去分化还是促进分化等问题尚未解决。
6自噬的研究方法概述正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：（一）自噬诱导剂1）B r e d e l d i n A/T h a p s i g a r g i n/T un i c a m y c i n：模拟内质网应激2）C a r b a m a z e p i n e/L-690，330/L i t h i u m C h l o r i d e（氯化锂）：I M P a s e抑制剂（即I no s i t o l m ono p ho s p h a t a s e，肌醇单磷酸酶）3）Earle's平衡盐溶液：制造饥饿4）N-A c e t y l-D-s p h i ngo s i n e（C2-c e r a m i d e）：C l a ss I P I3K P a t h w ay抑制剂5）R a p a m y c i n：m T O R抑制剂(这是最常用的)6）X e s t o s p ong i n B/C：I P3R阻滞剂（二）自噬抑制剂1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34抑制剂2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。