药物的体外抗菌试验
抗菌试验
体外抗菌试验必须严格控制试验条件，使 其尽可能标准化 。
抗菌效力的测定 药品卫生质量的检查
药物含量测定
第一节 体外抑菌试验
检查药物的抗菌效能 体内试验 体外试验 广泛应用
一、常用的体外抗菌试验（antimicrobial test in vitro）
主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性，所以 也称药敏试验，常用最低抑菌浓度（MIC）表示，是指药 物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。 试验大多在玻璃器皿中进行，优点是方法简便、需时短、 用药量少，不需要动物。 但是没有体内复杂的因素参与，故体内和体外抗菌试验结 果有时会不一致。
药物稀释成系列浓度
与琼脂培养基混合（1：9）铺平板 平板上接种多种试验菌（多点接种仪） 培养，观察试验菌的生长与否，判断MIC。
杀菌曲线（KCs） 不同抗菌药物的杀菌速度
（三）联合抗菌试验 检查两种或两种以上药物在联合使用时的相互作用以及抗菌药物 与不同pH或不同离子溶液的相互影响。
4．挖沟法
滤纸片法
打孔法
管碟法
挖沟法
液体~
（二）系列稀释法（serial dilution test）
固体~
微量稀释 法用微孔 稀释板代 替试管。
MIC
MBC
液体培养基稀释法
固体培养基稀释法
（1）平板法：同时测定多个试验菌的MIC （2）斜面法：适用于需长时间培养的试验菌或避免 孢子飞扬污染环境的霉菌。 平板法步骤：
实验4 药物体外抗菌试验_PPT幻灯片
1、 K—B纸片法（学生操作）
纸片法常用于测定试验菌对各种抗生素 的敏感性，所以又叫做药物敏感试验，在 临床上可作为选择用药的重要依据。
操作步骤
1 培养试验菌：将菌种斜面培养物移种到肉 汤培养液中，37℃培养过夜，使菌液浓度 约为1.5×108cfu/ml.
最小抑菌浓度（MIC）：能抑制测试菌 生长的最低药物浓度即为MIC。
最小杀菌浓度（MBC）：能杀死测试菌 的最低药物浓度即为MBC。
试验测试(1h)
1、革兰氏染色 做好后请用油镜调好后举手示意
2、平板分区画线 做好后做好标记（学号）将平板扔到玻璃 缸中
2 涂布试验菌：用无菌吸管吸取一滴菌液滴 加在MHA平板上，用无菌涂布棒（L棒）将 菌液在整个平板上涂布均匀。
3 贴含药的滤纸片：用无菌镊子贴加含药滤 纸片。Байду номын сангаас
4 将平板倒置于37 ℃培养24h，观察结果， 测定抑菌圈的大小，并对照NCCLS的解释 标准来判断试验菌的药敏性。
2、连续稀释法
连续稀释法：人为配置连续梯度的药物 浓度来检测其抗菌能力，从而找出药物的 最小抑菌浓度。
药物体外抗菌实验反思
药物体外抗菌实验反思
药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力。
该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药。
如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面。
本次药物的体外抗菌试验在实验室进行，优点是方法简便、需时短、用药量少，不需要活的动物、实验条件容易控制。
因此，药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了。
药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。
本次实验采取的是琼脂扩散法。
它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面。
抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散、其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内。
由于药物的抗菌效应、试验菌不能生长、此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
第十九章药物的体外抗菌试验
抑菌圈的大小反映待测菌对该药物的敏感程度并与 该待测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈 越大，最低抑菌浓度就越小。
最低抑菌浓度（MIC）：指抗菌药物能够抑制细菌生长 所需要的最低浓度，单位是ug/ml或u/ml。
如庆大霉素对铜绿假单胞菌的MIC为1.56ug/ml，青 霉素G的MIC>128ug/ml，由此可判定庆大霉素对铜绿 假单胞菌的抑菌效力大于青霉素。
5、影响结果的因素
（1）培养基：除在M－H培养基上无法生长的细菌外，一 般都固定使用M－H培养基。
（2）抗菌药物：原则上采用标准粉剂，不用口服药物，配 好的原液应在有效期内使用。
（3）结果观察：应在12－18小时之间。培养时间过长，轻 度抑制的细菌可重新生长；或抗菌活性降低，甚至消失， 从而使MIC值增高。
（3）接种菌液的准备：从纯培养的平板上挑取形态相同 的4－5个菌落，接种于 3－5mlM－H液体培养基内， 35℃培养4－6小时，营养要求高的则培养过夜，然后校 正菌液浓度至0. 5麦氏比浊标准，再用M－H液体培养基 作1：200稀释，并在15分钟内接种。
3、试验步骤
（1）排列10－15支试管，除第1支外，各管加入M－H液 体培养基1ml。
（三）实验步骤
（1）菌液接种：用灭菌过的棉拭蘸取已制备的菌液涂抹 在M－H平板培养基的表面，均匀涂抹3次，每涂一次，平 板应转动60度，最后将棉拭绕平板内缘涂沫一圈，盖上平 皿盖，放置室温干燥数分钟。
（2）药物纸片的贴放：以无菌镊子取各种抗菌药物纸 片，贴放于已接种过试验菌的平板培养基表面，纸片贴后 不能再移动，因为有些药物可立即扩散。各纸片中心间距 不小于24mm，距平板边缘不小于15mm。直径为90mm的 平板可贴放6张纸片。贴后15分钟内倒置35℃培养箱16－ 18小时后阅读结果。
thweek药学实验四药物的体外抗菌试验
结果观察与记录
观察抑菌圈
通过观察抑菌圈的大小，初步判断药物的抗菌 效果。
数据记录
详细记录实验过程中的数据，如菌种名称、药 物名称、稀释比例、抑菌圈大小等。
结果分析
根据记录的数据，进行结果分析，计算药物的抑菌率或最小抑菌浓度等指标。
04
数据分析与结论
数据整理与处理
数据收集
收集实验过程中获得的药物抗菌数据，包括不同 药物浓度下的抑菌圈直径、细菌生长曲线等。
展望未来研究方向
根据实验结果和数据分析，展知
实验操作注意事项
实验前应仔细阅读相关文 献，了解实验原理、操作 步骤及注意事项。
在实验过程中，应保持实 验室整洁，避免交叉污染。
确保实验操作符合实验室 安全规定，遵循正确的操 作流程。
实验结束后，应按照实验 室规定正确处理废弃物。
纸片扩散法
将含有不同浓度抗菌药物的纸片贴在接种了细菌的琼脂平板上，观察 抑菌圈的大小，判断药物的抗菌效果。
时间-杀菌曲线法
记录抗菌药物在不同时间对细菌数量的影响，了解药物的杀菌速率和 杀菌效果。
了解抗菌药物的作用机制
大环内酯类
主要抑制细菌蛋白质的合成。
氨基糖苷类
与细菌核糖体结合，抑制蛋白 质合成。
thweek药学实验四药物的 体外抗菌试验
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 数据分析与结论 • 实验注意事项与安全须知
01
实验目的
理解药物体外抗菌试验的原理
药物体外抗菌试验是指在体外条件下，通过实验室方法测试抗菌药物对病原微生 物的抑制或杀灭作用。其原理基于药物对微生物细胞膜、细胞壁、核酸或蛋白质 等生物大分子的影响，从而干扰或破坏微生物的正常生长和繁殖。
实验六抗菌药物的体外药效试验
实验六抗菌药物的体外药效试验文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-实验六、抗菌药物的体外药效试验（药敏试验）各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。
此外，通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。
药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验（Kirby-Baueer Dice Diffusion）；最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最低杀菌浓度试验（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）。
［目的要求］1、熟悉体外抗菌试验操作技术。
2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。
［实验原理］常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法。
琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。
根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。
经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。
浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）。
1、细菌：所用细菌应包括主要致病菌。
革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。
革兰氏阴性球菌如淋球菌等。
革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等。
对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。
其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200-500株。
药物的体外抗菌试验药物制剂的微生物学检查
三、耐药性的控制
1 、避免耐药菌传播（医院） 2 、合理用药 （1）抗生素可不用尽量不用，使用时应足量。 （2）合理联合用药 3、 抗耐药菌新抗生素的寻找，如酶抑制剂抗生 素等。 4 、耐药机制的研究—耐药规律寻找，有助于合 理用药。
四、耐药性和青霉素酶的测定
1 、耐药性—药敏试验 2 、青霉素酶 耐药菌接平板培养 →加含青霉素的淀粉 → 加I2出现透明圈（eg.金葡菌产酶 株）。
医疗用抗生素的特点
差异毒力大 生物活性强、有不同抗菌谱 不易使病原菌产生耐药性 毒副作用小，不易引起超敏反应 半衰期长，生物利用度高
抗生素的分类 抗生素产生菌的分离和筛选 抗生素的制备 抗生素的生物合成 抗生素的主要作用机制 抗药性 抗生素的单位及效价测定
（1）按化学结构分类
ß-内酰胺类—青霉素、头孢菌素等 四环类—四环素、土霉素、金霉素 氨基糖苷类—链霉素、卡那霉素、庆大霉素 大环内酯类—红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素 多肽类—多黏菌素、杆菌肽等 多烯类—制霉菌素、两性霉素B、万古霉素 苯羟基胺类—氯霉素 蒽环类—柔红霉素、阿霉素 环桥类—利福霉素 其他
平板倍比稀释法
目前抗生素的临床前研究一般采用此法。平板倍比稀释法是 根据药物在琼脂培养基中扩散的原理，将细菌接种在含有不 同浓度抗生素的平板上恒温培养16~18小时，可抑制细菌生长 的最低药物浓度为最低抑菌浓度（MIC），可杀灭细菌的最低 药物浓度为最低杀菌浓度（MBC）。MIC或MBC值愈小，则药 物的抑菌或杀菌作用愈强。
磺胺类耐药菌株合成了对磺胺不敏感的二氢叶酸合 成酶，而引起耐药。 （靶位的改变）
喹诺酮类耐药菌的gyrA(gyrase)基因突变，DNA螺 旋酶A亚单位的变化，对该类药物不敏感。其中， gyrase（DNA旋转酶）为一种类型的拓扑异构酶， 引入负超螺旋至闭环双链DNA中。 （靶位的改变）
药物体外抗菌试验
主 要 内 容
教师讲解 1组/2人
4人/组
药物体外抗菌试验
MIC及MBC的测定 药敏试验——纸片法（大肠/金葡） 药物的细菌和霉菌总数测定
体外抗菌试验
：能抑制测试菌生长的最低药物浓度即为 连续稀释法（MIC） MIC。 ：能杀死测试菌的最低药物浓度即为MBC。
琼脂扩散法（K-B纸片法）
药物的细菌和霉菌总数测定
为什么要检定药品中的细菌和 真菌总数 ？ 细菌菌落总数（ Colony Form Unit，简写CFU ），指每克 或每毫升待检药品内含有的活 菌总数。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(1)
无菌操作取供试药品1 g或1mL，取10 mL无菌生理盐水，在无菌研钵中加入药 品和少量pH7.0无菌氯化钠–蛋白胨缓冲 液，将药品研碎，再将剩余的pH7.0无菌 氯化钠–蛋白胨缓冲液全部倒入并研匀， 制成的均匀1：10（ 10-1 ）供试液。
MIC及MBC的测定
MBC
不含药的平板
纸片法的原理
K-B纸片法
无菌吸管少量菌液滴加于平板 培养基（MHA）中央（2滴）； 涂布棒将菌液涂开； 做好标记；镊子夹取相应药物 纸片贴于含菌平板表面； 37℃培养箱内倒置培养24h； 测量抑菌圈直径（3次取平均 值）,并对照NCCLS的解释标准 （105页）来判断试验菌的药 敏性。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(4)计算每个平板上生长的菌落数，选菌 落数小于300之间的平板计算，菌落数乘 以稀释倍数，求得每克或每毫升供试品 中所含的菌落总数。
注意
1 无菌操作。 2 不同稀释剂不可使用同一吸管。 3倾倒培养基时温度不宜过高。 4培养时培养基要倒置。 5 做阴性对照。
药物的体外抗菌试验
于平板上，培养后观察结果，量取抑菌圈直 径以此判断试验药物抑菌作用的强弱。
❖ 用于新药的初筛及临床的药敏试验。
❖ 挖沟法： ❖ 1、在琼脂平板上挖沟，沟两边垂直划线接种
各种试验菌，沟内加入药液。 ❖ 2、培养后，根据沟两边所生长的试验菌离沟
❖ 2、再于各管中加入等量的实验菌，经 16～ 24 h培养后，与阴性及阳性对照管进行对照 观察。
❖ 3、将未长细菌的培养液取出，分别转种琼脂 平皿。如培养后重新长出试验菌，说明该药 仅有抑菌作用。如无菌生长则可以认为该药 物有杀菌作用。
❖ 在测定中草药煎剂时，由于有些煎剂颜色 较深，肉眼不易分辨是否有效；需再于每管 中取数环移种于适当的培养基上，经培养后 观察有无细菌生长而决定之。
药物的体外抗菌试验
❖ 用途： ❖ 抗菌药物的筛选、药物的抗菌谱测定及
临床药物敏感性试验等方面。
常用的体外抑菌试验
琼脂扩散法 滤纸片法
❖
挖沟法
连续稀释法
琼脂扩散法
❖ 原理： 药物可以在琼脂培养基中自由扩散，形成一定浓度的含药
区域。 由于各种微生物对不同药物或同一药物不同浓度的敏感性
不同，因而形成一定大小的抑菌圈或抑菌距离，根据其大小， 可以了解药物的抗菌作用大小或是微生物对试验药物的敏感性。
的距离来判断药物对试验菌的抗菌作用强弱。
❖ 适用于在一个平板上试验一种药物对几种不 同试验菌的抗菌作用。
❖ 琼脂扩散法具有方法简便，技术要求不 高，易掌握操作的特点。但精确度不高，一 般能用于定性或初步判断其作用的强弱。
❖ 液体稀释法是一种测定药物的抗菌作用 定量方法，较琼脂扩散法精确，因而运用较 普遍 。
❖ 凡能抑制试验菌生长的最高药物稀释度为该 药的最低抑菌浓度 （Minimal inhibitory concentration，MIC）。
体外抗菌药物抑菌试验(亦称细菌对药物的敏感试验-简称药...
❖ 敏感(S)：表示细菌可被常规剂量的药物在体内达到 的浓度所抑制或杀灭。
❖ 中度敏感(MS)：表示细菌可被该药物大剂量的浓度 所抑制或在药物生理性浓集的部位被抑制。
只有少数药物可报告中度敏感，如氨苄青霉素测肠 球菌。
❖ 中介度(1)：是为防止因技术因素失控导致结果误差 而设置的“缓冲域”因其临床意义难以确定，故不 应向临床医师报告。而应重做稀释法根据MIC结果 做出判断。
优缺点
❖ 稀释法是直接定量地检测抗菌药物在体 外对病原菌的抑制或杀灭浓度，有利于 临床根据MIC、药物代谢等拟定合理的 治疗方案，是目前厌氧菌的最佳测定方 法，琼脂稀释法还易于发现污染或耐药 突变菌。稀释法是新药开发，体外药敏 试验常用的经典参照标准，但操作相对 比较烦琐。
❖ 标准菌株的抑菌圈应落在表中所示的预期范 围内。如果超出该范围，应视为失控，须及 时查找原因，予以纠正。
❖ 培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、 试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具 的精度、质控菌株的药敏特性等均能影响结 果的准确性。
（二）肉汤稀释法 及琼脂稀释法
❖ 原理 是用水解酪蛋白肉汤(MH)或水解酪 蛋白琼脂（MHA）培养基作为稀释剂。 按《美国委员会临床实验室标准》作分 步倍比稀释抗菌药物，定量加入被检菌 株。经培养后观察抗菌药物的最小抑菌 浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。
❖ 根据本国国情，卫生部临床检验中心还制订了关于 临床微生物实验室室内质控要求。临床具体工作须 参照遵守。
❖ 原理 是将定量抗菌药物纸片贴在涂有细菌的 琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散， 其浓度逐渐递减，使纸片周围的敏感细菌受 到抑制生长，形成抑菌圈，测量抑菌圈的直 径来判定细菌对药物的敏感程度。此法简单 易行、价格便宜、药物选择灵活，适用对生 长快的细菌进行药敏试验。
项目7药物体外抗菌试验技术
• 厌氧菌阳性对照菌：生孢梭状芽胞杆菌 CMCC(B)64941
• 真菌阳性对照菌：白色念珠菌 CMCC(F)98001或曲霉菌ATCC16404
需要进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的范围：
(药品、敷料按《中国药典》收载的无菌检查法的规定进行， 生物制品应按照《生物制品制造及检定规程》中有关规定进行)
选择性培养基
❖ 阴性对照及阳性对照
1.
阴性对照
2.
阳性对照
阴性对照应不长细菌，说明培养基本身是无 菌可靠的；阳性对照试验必须长菌，说明应 用的细菌是可以在该试验条件下正常生长的。
❖ 抑菌试验
❖ 无菌检查法
❖
无菌检验结果判断
•
需氧菌阳性对照菌：金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003或藤黄八叠球菌
CMCC(B)28001
绿脓杆菌 4. 用创伤、溃疡、止血、深部组织的药材药粉制剂不
得检出破伤风杆菌。
活螨的检验
用于口服、创伤、粘膜和 腔道的药品均不得检出活 螨
01
直接观察法：用肉眼直接 观察被检药物上有无白点 移动，再用放大镜或解剖 镜观察。
02
04
分离法：将药物放在特制分离器或附 有筛网的漏斗内，离药物６cm上放置 ６０～１００Ｗ的灯泡，照射１～２h. 螨有避光怕热的习性，便沿漏斗细颈 向下爬，在漏斗下口处置一装有甘油 水的烧杯，收集爬出的螨，然后在显 微镜下观察，根据其形态特征、足肢 游动情况判断是否为活螨。
1. 目的
▪ 细菌数测定我们是为了考察每克或每毫升供试品所 污染的活细菌数，来判明供试品被细菌污染的程度。
▪ 霉菌的测定是考察每克或每毫升供试品所污染的活 的霉菌数，以此来判明供试品被真菌污染的程度。
药物的抗菌试验
药物的抗菌试验
•药物及浓度
•
•链霉素 •（µg／ml）
•
64
•
32
•
16
•
8
•
4
•青霉素G单药对照
青霉素G(IU／m1) 4 2 1 0.5 0.25
-- -- -- -- -- -- -
---++ ++ ++
链霉素单药对照
+ + 细菌对照
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•-：无细菌生长 +：有细菌生长 •FIC指数=1／1+16／16=2——无关
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药物的抗菌试验
பைடு நூலகம்
•三、影响抗菌试验的因素
•1. 菌种 • 在抗菌试验中所用到的菌种，必需是国 家卫生部生物制品检定所菌各保藏中心专门提 供的标准菌株。在特殊情况下，也可以采用临 床新分离的并经过鉴定、纯化及合理保藏的菌 株。而且我们要用到的试验菌种应该选择是对 数期生长的菌。因为那时菌种生命力最旺盛， 这对于我试验测定的结果也会准确些。
•在进行棋盘法之前应先测定两种抗菌药物单独对受 试菌的MIC，然后以两药MIC的8倍、4倍、2倍、1倍 以及MIC的1/2、1/4、1/8浓度（或4倍、2倍、1倍、 1/2、1/4浓度）分别进行联合。可见举例，如表—1的 青霉素G与链霉素联合药敏实验和表2的TMP+SMZ的 联合作用。
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药物的抗菌试验
•器材及试剂: •药敏片：含各种抗生素的市售产品 •培养基平板：普通牛肉膏蛋白胨固体培养基，待 检细菌的培养物。 •眼科镊、无菌棉拭子、酒精灯等。
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药物的抗菌试验
项目七 药物体外抗菌实验技术
只适用于同类消毒剂的杀菌效力测定,对非酚 类、季铵盐及不稳定的次氯酸盐等均不能给 予正确评价.
三、联合抗菌试验
在药学中，常需要检查两种抗菌药物在联合应用时 的相互作用以及抗菌药物与不同PH值或不同离子溶液的 相互影响。
加强药物抗菌作用的为协同（synergism）；
减弱药物作用的为拮抗（antagonism）；
操作步骤
A 配置不同浓度的石碳酸稀释液、消毒剂稀释液
B
量取石碳酸和消毒剂稀释液于无菌试管中， 20℃恒温水浴
C 各管内依次加入伤寒杆菌或大肠杆菌培 养液0.5ml，管上标明5min处理、10min 处理字样，加入后准确计时。
D
到标定时间后取出一接种环的混合液接种于一 支5ml（或10ml）的肉汤培养基中，培养一定 时间后，观察并记录结果。+为有菌生长，-为 无菌生长。
原理：
药物可以在琼脂培养基中自由扩散，形成一定浓度的含药 区域。 由于各种微生物对不同药物或同一药物不同浓度的敏感性 不同，因而形成一定大小的抑菌圈或抑菌距离，根据其大小， 可以了解药物的抗菌作用大小或是微生物对试验药物的敏感性。
（1）滤纸片法（103页，3min）： 以倾注法制成含菌平板后，将滤纸片蘸取药液置于平板上，
表1 石炭酸系数测定
浓度 5 作用时间 10 + + 15 -
石炭酸
消毒剂
1:90 1:100 1:110 1:150 1:170 1:200 1:225 1:250 1:275
+ + + +
根据5分钟不能杀菌，10分钟能杀菌的最大稀释度为标准计算： 石炭酸系数=250/100=2.5
注意事项
1 2 3 4 有机物存在时消毒剂容易失去活性; 消毒剂可能影响微生物生长; 随温度变化而影响测定结果;
药物的体外抗菌试验-第十九章
药物的体外抗菌试验-第十九章第十九章药物的体外抗菌试验教学要求.（一）掌握常用的体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。
.（二）熟悉杀菌试验（最低杀菌浓度、最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。
.（三）了解体外抗菌试验的影响因素。
第一节常用的体外抑菌试验一、药物的体外抗菌试验.又称药敏试验，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。
.最低抑菌浓度（MIC）：指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。
.优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。
.缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。
试验菌.细菌、霉菌和酵母菌常用.标准菌株：来自专门机构，我国是卫生部生物制品检定所菌种保藏中心提供。
.临床分离株：经形态、生化及血清学等方面鉴定。
不得有杂菌污染，不宜用传代多次的菌种，最好是重新活化的。
控制培养时间。
.接种菌量的多少的计算培养基.根据试验菌的营养要求进行选择.培养基质量控制供试药物.药物的浓度和总量要精确配制.供试药物用适宜溶剂溶解并稀释至所需浓度，难溶药物加助溶剂。
.中草药或某些生药原粉的样品，应先提取，再浓缩至所需浓度对照试验.试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长.已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。
.溶剂及稀释剂对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释剂应无抗菌作用（一）连续稀释法.方法：液体法和固体法。
.用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。
.抑菌：药物可抑制微生物生长繁殖，但不杀死它，在药物除去后，微生物又可恢复生长.杀菌：药物能杀死微生物，当药物去除后，微生物不再继续生长。
1、液体培养基稀释法.方法：两倍稀释法.步骤：液体培养基稀释药物成系列递减的浓度每管加入一定量试验菌24-48小时后肉眼观察试管浑浊情况，记录能抑制细菌生长的最低浓度（MIC）将未见细菌生长的各试管内的培养液（各吸取0.1ml）移种到新鲜的琼脂培养基上重新长出细菌的只具有抑菌作用，无菌生长（菌落数﹤5个）具有杀菌作用，记录最低杀菌浓度（MBC）。
实验六、抗菌药物的体外药效试验
实验六、抗菌药物的体外药效试验（药敏试验）各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。
此外，通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。
药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验（Kirby-Baueer Dice Diffusion）；最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最低杀菌浓度试验（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）。
［目的要求］1、熟悉体外抗菌试验操作技术。
2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。
［实验原理］常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法。
琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。
根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。
经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。
浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）。
1、细菌：所用细菌应包括主要致病菌。
革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。
革兰氏阴性球菌如淋球菌等。
革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等。
对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。
其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200-500株。
试验时应包括有国际公认质控菌株(如金葡菌ATCC25925，大肠杆菌ATCC25922和绿脓杆菌ATCC27853等)。
16th week 药学实验四 药物的体外抗菌试验
药物的体外抗菌试验
一．概述 二．药敏试验——纸片法 三．药物MIC和MBC的测定
四．细菌总数和霉菌总数测定
一 概述 1.1 抗生素对细菌生长抑制的原理：
① 抑制细胞壁形成。菌体因内部物质合成持续不断而 膨大，而细胞壁不能膨大，故菌体胀破，如青霉素。
② 破坏细胞膜。如多粘菌素 。 ③ 与微生物核糖体蛋白结合，抑制其蛋白质合成。如 氯霉素，金霉素，土霉素，四环素，链霉素，卡那 霉素，新霉素，庆大霉素，嘌呤霉素及春日霉素等。 ④ 与DNA结合，干扰其复制。如争光霉素(博来霉素)， 丝裂霉素(自力霉素)，放线菌素D(更生霉素) 等。
每 4个同学 1组，每个稀释度 2个重复（即2 块黄色培养基， 2块红色培养基）2个稀释度共8块平板，要求菌落计数。
菌落计数：将平皿底部过圆心划成四等份，肉眼观察菌
落并计数，并用5~10倍放大镜查漏，求出同一稀释度
的平均菌落数
菌落总数报告：选取平均菌落数在30~300间的皿
①当只有一个稀释度的平皿菌落数符合此范围时，即以 该平皿菌落数乘其稀释倍数。 ②若有两个稀释度，其平均菌落数均在30~300之间， 则应求出两者菌落总数之比值来决定，若其比值≤2， 应报告其平均数，若＞2则报告其中较少的菌落数
黄连 黄芩
黄柏 银花
2.4 挖沟法
制备琼脂平板，在平板上挖沟，沟旁边垂直划线接种 试验菌，在沟中加药，根据沟两边的试验菌离沟的抑 菌距离来判定药物的抗菌作用。适用于半流动药物或 中药浸煮液的抗菌试验。 大肠杆菌
沟槽
（黄连）
金黄色葡萄球菌 痢疾杆菌
三 连续稀释法
在一系列试管中，用液体培养基按一定倍数稀释药物；
1、 无菌操作，镊子和L棒使 用前需火焰灭菌后冷却； 镊子需火焰灭菌后再取 另一药纸片。 2 、药纸片需一次贴定，不 能移动。
药物的体外抑菌试验
实验五药物的体外抗菌试验药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力.该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药.如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面。
药物的体外抗菌试验在实验室进行,优点是方法简便、需时短、用药量少，不需要活的动物、实验条件容易控制。
因此,药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了。
药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。
（一）稀释法（结果示教）稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法(斜面法）两种.这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）:是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用μg∕ml或U/ml表示。
(二）琼脂扩散法它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。
滤纸片法（K-B纸片法）－学生操作滤纸片法是最常用的方法,适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药).滤纸片分湿、干两种,可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。
一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。
至于干燥纸片的制备方法：选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片,120℃干燥灭菌2小时。
然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液,每100张纸片加入0。
5ml药液,使它均匀浸润，放在无菌平皿中，37℃，使它干燥，分装小瓶中,封口,4℃保存。
如果是β－内酰胺类抗生素还要放在-20℃保存。
这就制成了干燥的含药液的纸片。
一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感,中度敏感还是耐药.世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈大小来判断.步骤：活化试验菌→涂布试验菌于平板→贴加含药纸片→37度培养24h→观察结果打洞法（结果示教）在含菌琼脂平板上打洞（一般打6个孔，4个小孔加不同浓度标准溶液，另外2个小孔加血清样品，放在37℃，12-18小时,测定其抑菌圈直径。
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挖沟法： 挖沟法： 1、在琼脂平板上挖沟，沟两边垂直划线接种 、在琼脂平板上挖沟， 各种试验菌，沟内加入药液。 各种试验菌，沟内加入药液。 2、培养后，根据沟两边所生长的试验菌离沟 、培养后， 的距离来判断药物对试验菌的抗菌作用强弱。 的距离来判断药物对试验菌的抗菌作用强弱。 适用于在一个平板上试验一种药物对几种不 适用于在一个平板上试验一种药物对几种不 同试验菌的抗菌作用 的抗菌作用。 同试验菌的抗菌作用。
药物的体外抗菌 试验
药物的体外抗菌试验
用途： 用途： 抗菌药物的筛选、 抗菌药物的筛选、药物的抗菌谱测定及 临床药物敏感性试验等方面。 临床药物敏感性试验等方面。
常用的体外抑菌试验
琼脂扩散法 连续稀释法 滤纸片法 挖沟法
琼脂扩散法
原理： 原理： 药物可以在琼脂培养基中自由扩散， 药物可以在琼脂培养基中自由扩散，形成一定浓度的含药 区域。 区域。 由于各种微生物对不同药物或同一药物不同浓度的敏感性 不同，因而形成一定大小的抑菌圈或抑菌距离，根据其大小， 不同，因而形成一定大小的抑菌圈或抑菌距离，根据其大小， 可以了解药物的抗菌作用大小或是微生物对试验药物的敏感性。 可以了解药物的抗菌作用大小或是微生物对试验药物的敏感性。
琼脂扩散法具有方法简便， 琼脂扩散法具有方法简便，技术要求不 易掌握操作的特点。但精确度不高， 高，易掌握操作的特点。但精确度不高，一 般能用于定性或初步判断其作用的强弱 定性或初步判断其作用的强弱。 般能用于定性或初步判断其作用的强弱。 液体稀释法是一种测定药物的抗菌作用 定量方法，较琼脂扩散法精确， 定量方法，较琼脂扩散法精确，因而运用较 普遍 。
液体连续稀释法
1、在一系列的试管中用液体培养基将试验药 在一系列的试管中用液体培养基将试验药 物作连续对倍稀释， 物作连续对倍稀释，使药物的浓度沿试管顺 序成倍递减。 序成倍递减。 2、再于各管中加入等量的实验菌，经 16～ 、再于各管中加入等量的实验菌， ～ 24 h培养后，与阴性及阳性对照管进行对照 培养后， 培养后 观察。 观察。 3、将未长细菌的培养液取出，分别转种琼脂 、将未长细菌的培养液取出， 平皿。如培养后重新长出试验菌， 平皿。如培养后重新长出试验菌，说明该药 仅有抑菌作用。 仅有抑菌作用。如无菌生长则可以认为该药 物有杀菌作用。 物有杀菌作用。
所用的试验菌株应处于对数生长期， 所用的试验菌株应处于对数生长期，因此期 对数生长期 的微生物对外界因素变化最敏感。 的微生物对外界因素变化最敏感。 试验结果的灵敏度在一定程度上与试验菌的 试验结果的灵敏度在一定程度上与试验菌的 接种量成反比关系 故应选用适宜的接种量。 成反比关系， 接种量成反比关系，故应选用适宜的接种量。
凡能抑制试验菌生长的最高药物稀释度为该 药的最低抑菌浓度 药的最低抑菌浓度 （Minimal inhibitory concentration，MIC）。 ， ）。 以培养后无细菌生长的最高药物稀释度为最 以培养后无细菌生长的最高药物稀释度为最 小杀菌浓度（Minimal bactericidal 小杀菌浓度（ concentration，MBC）。 ， ）。
抗菌试验的影响因素
3、抗菌药物 、 药物的浓度、 及含有的其他成分均可 药物的浓度、pH及含有的其他成分均可 影响试验结果， 影响试验结果，特别是中草药制剂往往含有 色素、杂质和鞣质等， 色素、杂质和鞣质等，这些均可造成错误结 果，应加注意。 应加注意。
抗菌试验的影响因素
4、对照试验： 、对照试验： 为精确判断实验结果， 为精确判断实验结果，试验时应设各种对 照，包括试验菌对照、已知药物对照及溶剂 包括试验菌对照、 和稀释液对照等。 和稀释液对照等。
在测定中草药煎剂时， 在测定中草药煎剂时，由于有些煎剂颜色 较深，肉眼不易分辨是否有效； 较深，肉眼不易分辨是否有效；需再于每管 中取数环移种于适当的培养基上， 中取数环移种于适当的培养基上，经培养后 观察有无细菌生长而决定之。 观察有无细菌生长而决定之。
抗菌试验的影响因素
1、试验菌： 、试验菌： 用专门的供应机构提供的标准菌株 标准菌株。 用专门的供应机构提供的标准菌株。 北京卫生部药品生物制品检定所菌种保藏中 心。 试验菌应合理保藏， 试验菌应合理保藏，用前加以纯化及生物学 特征鉴定。 特征鉴定。
滤纸片法： 滤纸片法： 制成含菌平板后， 制成含菌平板后，将滤纸片蘸取药液置 于平板上，培养后观察结果， 于平板上，培养后观察结果，量取抑菌圈直 径以此判断试验药物抑菌作用的强弱。 径以此判断试验药物抑菌作用的强弱。 用于新药的初筛及临床的药敏试验。 用于新药的初筛及临床的药敏试验。 新药的初筛及临床的药敏试验
在实际工作中， 在实际工作中，往往可见到体外实验有 作用的药物， 作用的药物，进入机体后由于各种原因而失 效，有的药物毒性很大也不能用于临床。 有的药物毒性很大也不能用于临床。