实验4 药物体外抗菌试验
实验4 药物体外抗菌试验
2、连续稀释法
连续稀释法：人为配置连续梯度的药物 浓度来检测其抗菌能力，从而找出药物的 最小抑菌浓度。 最小抑菌浓度（MIC）：能抑制测试菌 生长的最低药物浓度即为MIC。 最小杀菌浓度（MBC）：能杀死测试菌 的最低药物浓度即为MBC。
试验测试(1h)
1、革兰氏染色 做好后请用油镜调好后举手示意 2、平板分区画线 做好后做好标记（学号）将平板扔到玻璃 缸中
K-B纸片法示意图
试验菌平板
庆
2.0cm
青
2.5cm
链
先
注意事项
1 以上各不操作要严格的无菌操作，镊子和L 棒都要用酒精烧过之后冷却再使用。 2 贴纸片的时候一定要一次把纸片定位好，接 触琼脂后就不能再移动含药滤纸片。 3 不同的抗菌药物其抑菌圈直径的敏感/耐药分 界点不一样；有的抗菌药物对不同的菌种的 分界点也不一致；应根据NCCLS最新公布 的分界点数据来读取药敏试验的结果。
微生物与免疫学实验
Байду номын сангаас
实验四 药物体外抗菌试验
琼脂扩散法 纸片法
连续稀释法
• 今天要用显微镜，请单学号同学去 领显微镜，双学号同学不用领
1、 K—B纸片法（学生操作）
纸片法常用于测定试验菌对各种抗生素 的敏感性，所以又叫做药物敏感试验，在 临床上可作为选择用药的重要依据。
操作步骤
1 培养试验菌：将菌种斜面培养物移种到肉 汤培养液中，37℃培养过夜，使菌液浓度 约为1.5×108cfu/ml. 2 涂布试验菌：用无菌吸管吸取一滴菌液滴 加在MHA平板上，用无菌涂布棒（L棒）将 菌液在整个平板上涂布均匀。 3 贴含药的滤纸片：用无菌镊子贴加含药滤 纸片。 4 将平板倒置于37 ℃培养24h，观察结果， 测定抑菌圈的大小，并对照NCCLS的解释 标准来判断试验菌的药敏性。
第4章抗菌药物敏感试验
第4章抗菌药物敏感试验一、需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.扩散法（K-B法）（1）原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在接种有待检菌的琼脂平板上，该点称为抗菌药源。
药物向周围扩散，形成了随着药源距离增加，琼脂中药物浓度递减的浓度梯度。
在药源周围可抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，其大小可以反映待检菌对测定药物的敏感性，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
（2）实验材料①培养基：采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH为7.2，琼脂厚度4mm。
对生长条件要求高的细菌，如链球菌属细菌需加入5%脱纤维羊血，嗜血杆菌属细菌需加入1%血红蛋白（含Ⅴ因子）和1%Ⅹ因子复合物。
②抗菌药物纸片：选用直径为6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。
制备时取灭菌药敏纸片，经加样或浸泡药物溶液后冷冻干燥，置4℃保存备用，在有效期内使用。
③接种菌液挑取平板上形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml M-H肉汤中，于35℃中培养2～8h。
嗜血杆菌属和链球菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。
用生理盐水或肉汤校正菌液至0.5麦氏比浊标准（相当于1.5×109/ml的含菌量）后在15min内接种。
（3）试验方法以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液（其浊度为0.5麦氏比浊标准），在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次，每次平板旋转60°，最后沿平板内缘涂抹１周。
平板置室温干燥3～5min，后用无菌镊子或专用纸片分配器将含药纸片贴于琼脂表面。
纸片应贴得均匀，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。
直径为90mm的平板可贴6张纸片。
纸片贴牢后应避免再移动。
平板室温放置15min后倒置于35℃培养箱中培养16～18h后读取结果。
（4）结果解释平板置黑色背景上，从背面量取包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。
培养基中如果加有血液须打开皿盖从正面测量抑圈菌。
第十九章药物的体外抗菌试验
抑菌圈的大小反映待测菌对该药物的敏感程度并与 该待测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈 越大，最低抑菌浓度就越小。
最低抑菌浓度（MIC）：指抗菌药物能够抑制细菌生长 所需要的最低浓度，单位是ug/ml或u/ml。
如庆大霉素对铜绿假单胞菌的MIC为1.56ug/ml，青 霉素G的MIC>128ug/ml，由此可判定庆大霉素对铜绿 假单胞菌的抑菌效力大于青霉素。
5、影响结果的因素
（1）培养基：除在M－H培养基上无法生长的细菌外，一 般都固定使用M－H培养基。
（2）抗菌药物：原则上采用标准粉剂，不用口服药物，配 好的原液应在有效期内使用。
（3）结果观察：应在12－18小时之间。培养时间过长，轻 度抑制的细菌可重新生长；或抗菌活性降低，甚至消失， 从而使MIC值增高。
（3）接种菌液的准备：从纯培养的平板上挑取形态相同 的4－5个菌落，接种于 3－5mlM－H液体培养基内， 35℃培养4－6小时，营养要求高的则培养过夜，然后校 正菌液浓度至0. 5麦氏比浊标准，再用M－H液体培养基 作1：200稀释，并在15分钟内接种。
3、试验步骤
（1）排列10－15支试管，除第1支外，各管加入M－H液 体培养基1ml。
（三）实验步骤
（1）菌液接种：用灭菌过的棉拭蘸取已制备的菌液涂抹 在M－H平板培养基的表面，均匀涂抹3次，每涂一次，平 板应转动60度，最后将棉拭绕平板内缘涂沫一圈，盖上平 皿盖，放置室温干燥数分钟。
（2）药物纸片的贴放：以无菌镊子取各种抗菌药物纸 片，贴放于已接种过试验菌的平板培养基表面，纸片贴后 不能再移动，因为有些药物可立即扩散。各纸片中心间距 不小于24mm，距平板边缘不小于15mm。直径为90mm的 平板可贴放6张纸片。贴后15分钟内倒置35℃培养箱16－ 18小时后阅读结果。
thweek药学实验四药物的体外抗菌试验
结果观察与记录
观察抑菌圈
通过观察抑菌圈的大小，初步判断药物的抗菌 效果。
数据记录
详细记录实验过程中的数据，如菌种名称、药 物名称、稀释比例、抑菌圈大小等。
结果分析
根据记录的数据，进行结果分析，计算药物的抑菌率或最小抑菌浓度等指标。
04
数据分析与结论
数据整理与处理
数据收集
收集实验过程中获得的药物抗菌数据，包括不同 药物浓度下的抑菌圈直径、细菌生长曲线等。
展望未来研究方向
根据实验结果和数据分析，展知
实验操作注意事项
实验前应仔细阅读相关文 献，了解实验原理、操作 步骤及注意事项。
在实验过程中，应保持实 验室整洁，避免交叉污染。
确保实验操作符合实验室 安全规定，遵循正确的操 作流程。
实验结束后，应按照实验 室规定正确处理废弃物。
纸片扩散法
将含有不同浓度抗菌药物的纸片贴在接种了细菌的琼脂平板上，观察 抑菌圈的大小，判断药物的抗菌效果。
时间-杀菌曲线法
记录抗菌药物在不同时间对细菌数量的影响，了解药物的杀菌速率和 杀菌效果。
了解抗菌药物的作用机制
大环内酯类
主要抑制细菌蛋白质的合成。
氨基糖苷类
与细菌核糖体结合，抑制蛋白 质合成。
thweek药学实验四药物的 体外抗菌试验
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 数据分析与结论 • 实验注意事项与安全须知
01
实验目的
理解药物体外抗菌试验的原理
药物体外抗菌试验是指在体外条件下，通过实验室方法测试抗菌药物对病原微生 物的抑制或杀灭作用。其原理基于药物对微生物细胞膜、细胞壁、核酸或蛋白质 等生物大分子的影响，从而干扰或破坏微生物的正常生长和繁殖。
《药学微生物》3-5-1 药物抗菌性的测定技术
挖沟法
可以根据沟和细菌间的抑菌距离的长短， 来判断该药物对这些细菌的抗菌能力。
图 挖沟法
打孔法：
在含菌琼脂平板上打洞（一般打6个孔， 4个小孔加不同浓度标准溶液，另外2个小孔 加血清样品，放在37℃，12-18小时，测定 其抑菌圈直径。所以说微量法适于药物血浓 度的监测。
机体本身对细菌有较强的抵抗力，一 般细菌感染动物后不易使动物致病，所以 体内抗菌实验模型建立比较困难，动物实 验感染模型一般分为全身感染和局部感染 模型。
管碟法：
与打孔法原理相同，只是把药液加入放到琼 脂板上的牛津杯中。加药量相对比较多，适合 中药的体外抗菌试验。
3．抗菌药物的联合应用 （1）棋盘稀释法 （2）琼脂扩散纸片法
纸条试验：
1．只有横条纸 片含抗菌药 2．两条纸片含 不同抗菌药
图 联合抗菌试验纸条法
1．梯度平板制备 2．加强作用 图 纸条梯度平板试验
3、中草药的抗菌作用
4、其他抗菌剂（消毒剂、 防腐剂）的作用机制
试验菌
二、药物抗菌作用试验方法 （一）药物体外抗菌试验 1、影响抗菌试验的因素控制
培养基
供试药物
对照 试验
2．药物的体外抗菌试验技术 常用的有稀释法和琼脂扩散法。
稀释法是药物系列稀释后加入菌液，观察细菌 生长与否来判断结果。常用于测定药物的最低 抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。
图 液体培养基连续稀释法
琼脂扩散法
纸片扩散法 挖沟法 平板打孔法 管碟法等
纸片扩散法:
一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根 据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性， 是敏感，中度敏感还是耐药。选用吸水力强而且 质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆 纸片，120℃干燥灭菌2小时。然后把配制好的 各种适宜浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入 0.5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中， 37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存。
药物体外抗菌试验
主 要 内 容
教师讲解 1组/2人
4人/组
药物体外抗菌试验
MIC及MBC的测定 药敏试验——纸片法（大肠/金葡） 药物的细菌和霉菌总数测定
体外抗菌试验
：能抑制测试菌生长的最低药物浓度即为 连续稀释法（MIC） MIC。 ：能杀死测试菌的最低药物浓度即为MBC。
琼脂扩散法（K-B纸片法）
药物的细菌和霉菌总数测定
为什么要检定药品中的细菌和 真菌总数 ？ 细菌菌落总数（ Colony Form Unit，简写CFU ），指每克 或每毫升待检药品内含有的活 菌总数。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(1)
无菌操作取供试药品1 g或1mL，取10 mL无菌生理盐水，在无菌研钵中加入药 品和少量pH7.0无菌氯化钠–蛋白胨缓冲 液，将药品研碎，再将剩余的pH7.0无菌 氯化钠–蛋白胨缓冲液全部倒入并研匀， 制成的均匀1：10（ 10-1 ）供试液。
MIC及MBC的测定
MBC
不含药的平板
纸片法的原理
K-B纸片法
无菌吸管少量菌液滴加于平板 培养基（MHA）中央（2滴）； 涂布棒将菌液涂开； 做好标记；镊子夹取相应药物 纸片贴于含菌平板表面； 37℃培养箱内倒置培养24h； 测量抑菌圈直径（3次取平均 值）,并对照NCCLS的解释标准 （105页）来判断试验菌的药 敏性。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(4)计算每个平板上生长的菌落数，选菌 落数小于300之间的平板计算，菌落数乘 以稀释倍数，求得每克或每毫升供试品 中所含的菌落总数。
注意
1 无菌操作。 2 不同稀释剂不可使用同一吸管。 3倾倒培养基时温度不宜过高。 4培养时培养基要倒置。 5 做阴性对照。
药物的体外抗菌试验
滤纸片法： 滤纸片法： 制成含菌平板后， 制成含菌平板后，将滤纸片蘸取药液置 于平板上，培养后观察结果， 于平板上，培养后观察结果，量取抑菌圈直 径以此判断试验药物抑菌作用的强弱。 径以此判断试验药物抑菌作用的强弱。 用于新药的初筛及临床的药敏试验。 用于新药的初筛及临床的药敏试验。 新药的初筛及临床的药敏试验
在实际工作中， 在实际工作中，往往可见到体外实验有 作用的药物， 作用的药物，进入机体后由于各种原因而失 效，有的药物毒性很大也不能用于临床。 有的药物毒性很大也不能用于临床。
抗菌试验的影响因素
3、抗菌药物 、 药物的浓度、 及含有的其他成分均可 药物的浓度、pH及含有的其他成分均可 影响试验结果， 影响试验结果，特别是中草药制剂往往含有 色素、杂质和鞣质等， 色素、杂质和鞣质等，这些均可造成错误结 果，应加注意。 应加注意。
抗菌试验的影响因素
4、对照试验： 、对照试验： 为精确判断实验结果， 为精确判断实验结果，试验时应设各种对 照，包括试验菌对照、已知药物对照及溶剂 包括试验菌对照、 和稀释液对照等。 和稀释液对照等。
抗菌试验的影响因素
2、培养基 、 抗菌试验的培养基应按试验菌的需求配制， 抗菌试验的培养基应按试验菌的需求配制，如链球 菌常用含血清的肉汤培养基， 菌常用含血清的肉汤培养基，抗真菌药物试验需用 沙氏培养基。 沙氏培养基。 培养基的酸碱度、电解质、 培养基的酸碱度、电解质、还原性物质等均可影响 试验结果， 试验结果，实验时应尽可能排除各种影响实验结果 因素的掺入。 因素的掺入。 经无菌检查合格。 经无菌检查合格。
液体连续稀释法
1、在一系列的试管中用液体培养基将试验药 在一系列的试管中用液体培养基将试验药 物作连续对倍稀释， 物作连续对倍稀释，使药物的浓度沿试管顺 序成倍递减。 序成倍递减。 2、再于各管中加入等量的实验菌，经 16～ 、再于各管中加入等量的实验菌， ～ 24 h培养后，与阴性及阳性对照管进行对照 培养后， 培养后 观察。 观察。 3、将未长细菌的培养液取出，分别转种琼脂 、将未长细菌的培养液取出， 平皿。如培养后重新长出试验菌， 平皿。如培养后重新长出试验菌，说明该药 仅有抑菌作用。 仅有抑菌作用。如无菌生长则可以认为该药 物有杀菌作用。 物有杀菌作用。
体外抗菌药物抑菌试验(亦称细菌对药物的敏感试验-简称药...
❖ 敏感(S)：表示细菌可被常规剂量的药物在体内达到 的浓度所抑制或杀灭。
❖ 中度敏感(MS)：表示细菌可被该药物大剂量的浓度 所抑制或在药物生理性浓集的部位被抑制。
只有少数药物可报告中度敏感，如氨苄青霉素测肠 球菌。
❖ 中介度(1)：是为防止因技术因素失控导致结果误差 而设置的“缓冲域”因其临床意义难以确定，故不 应向临床医师报告。而应重做稀释法根据MIC结果 做出判断。
优缺点
❖ 稀释法是直接定量地检测抗菌药物在体 外对病原菌的抑制或杀灭浓度，有利于 临床根据MIC、药物代谢等拟定合理的 治疗方案，是目前厌氧菌的最佳测定方 法，琼脂稀释法还易于发现污染或耐药 突变菌。稀释法是新药开发，体外药敏 试验常用的经典参照标准，但操作相对 比较烦琐。
❖ 标准菌株的抑菌圈应落在表中所示的预期范 围内。如果超出该范围，应视为失控，须及 时查找原因，予以纠正。
❖ 培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、 试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具 的精度、质控菌株的药敏特性等均能影响结 果的准确性。
（二）肉汤稀释法 及琼脂稀释法
❖ 原理 是用水解酪蛋白肉汤(MH)或水解酪 蛋白琼脂（MHA）培养基作为稀释剂。 按《美国委员会临床实验室标准》作分 步倍比稀释抗菌药物，定量加入被检菌 株。经培养后观察抗菌药物的最小抑菌 浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。
❖ 根据本国国情，卫生部临床检验中心还制订了关于 临床微生物实验室室内质控要求。临床具体工作须 参照遵守。
❖ 原理 是将定量抗菌药物纸片贴在涂有细菌的 琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散， 其浓度逐渐递减，使纸片周围的敏感细菌受 到抑制生长，形成抑菌圈，测量抑菌圈的直 径来判定细菌对药物的敏感程度。此法简单 易行、价格便宜、药物选择灵活，适用对生 长快的细菌进行药敏试验。
项目七 药物体外抗菌实验技术
只适用于同类消毒剂的杀菌效力测定,对非酚 类、季铵盐及不稳定的次氯酸盐等均不能给 予正确评价.
三、联合抗菌试验
在药学中，常需要检查两种抗菌药物在联合应用时 的相互作用以及抗菌药物与不同PH值或不同离子溶液的 相互影响。
加强药物抗菌作用的为协同（synergism）；
减弱药物作用的为拮抗（antagonism）；
操作步骤
A 配置不同浓度的石碳酸稀释液、消毒剂稀释液
B
量取石碳酸和消毒剂稀释液于无菌试管中， 20℃恒温水浴
C 各管内依次加入伤寒杆菌或大肠杆菌培 养液0.5ml，管上标明5min处理、10min 处理字样，加入后准确计时。
D
到标定时间后取出一接种环的混合液接种于一 支5ml（或10ml）的肉汤培养基中，培养一定 时间后，观察并记录结果。+为有菌生长，-为 无菌生长。
原理：
药物可以在琼脂培养基中自由扩散，形成一定浓度的含药 区域。 由于各种微生物对不同药物或同一药物不同浓度的敏感性 不同，因而形成一定大小的抑菌圈或抑菌距离，根据其大小， 可以了解药物的抗菌作用大小或是微生物对试验药物的敏感性。
（1）滤纸片法（103页，3min）： 以倾注法制成含菌平板后，将滤纸片蘸取药液置于平板上，
表1 石炭酸系数测定
浓度 5 作用时间 10 + + 15 -
石炭酸
消毒剂
1:90 1:100 1:110 1:150 1:170 1:200 1:225 1:250 1:275
+ + + +
根据5分钟不能杀菌，10分钟能杀菌的最大稀释度为标准计算： 石炭酸系数=250/100=2.5
注意事项
1 2 3 4 有机物存在时消毒剂容易失去活性; 消毒剂可能影响微生物生长; 随温度变化而影响测定结果;
实验四 清热药的体抑抗菌实验
实验四清热药的体抑抗菌实验【实验目的】通过实验，掌握中药体外抗菌实验的方法，了解清热药对病原菌的抑制和杀死作用。
【实验原理】【实验内容】【实验组织】（一）班级进行分组，每个实验小组３名学生；（二）每４个实验小组组由一名专业教师或实验教师（兼职教师）进行指导。
【实验准备】（一）菌种根据实验条件可选用大肠杆菌、沙门氏杆菌、肺炎球菌、链球菌、绿脓杆菌、金黄葡萄球菌，一种或数种。
先接种在适于生长的培养基内，置于37℃恒温箱中培养24h，待菌种复壮后使用。
再取复壮的菌种一环，放在适宜的培养基内，置于37℃恒温箱中培养。
培养时间及所需培养基因细菌的各类不同而异。
一般细菌培养6h，菌液浓度每ml相当于9亿左右，再用肉汤液1：500稀释后供使用。
链球菌、肺炎双球菌等培养18h，菌液浓度相当于每ml 3亿左右，再用肉汤液1：5稀释后供使用。
（二）培养基一般细菌如葡萄球菌、肠道杆菌等，可采用普通肉汤培养基或普通肉汤琼脂培养基。
链球菌、肺炎双球菌等对营养要求较高的病原菌，可采用羊血肉汤培养基。
（三）实验器材试管（高压灭菌后备用），接种环，酒精灯等。
（四）实验药品清热药如黄连、黄芩、地丁、栀子等。
将欲试药物制成100%水煎剂（１：１煎剂）。
经55157.6Pa（即8lb）气压灭菌20min，冷却后置冰箱中备用。
【方法步骤】（一）试管法用普通肉汤培养基或羊血肉汤培养基与100%中药煎剂进行倍比稀释（第一管双倍培养基），稀释度为1：2、1：4、1：8……1：256，每管量为1ml。
然后将菌液分别接种于不同浓度的药液培养基中，接种量为已稀释好的菌液0.1ml。
同时设药液（药液与培养基1：２）；细菌（细菌与培养基0.1：1）；培养基（不加药液与菌液）各一管，做为对照。
将上述试管摇匀后，置于37℃恒温箱中培养24h，再观察结果。
（二）平板法先将药物按试管法稀释为1：2～1：256等不同浓度。
将各稀释度的药液1ml，置于无菌平皿中，然后将各平皿加已溶化的琼脂培养基9ml，迅速与药液混匀，对照用10ml琼脂培养基。
几种抗菌药物体外抑菌试验
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16th week 药学实验四 药物的体外抗菌试验
药物的体外抗菌试验
一．概述 二．药敏试验——纸片法 三．药物MIC和MBC的测定
四．细菌总数和霉菌总数测定
一 概述 1.1 抗生素对细菌生长抑制的原理：
① 抑制细胞壁形成。菌体因内部物质合成持续不断而 膨大，而细胞壁不能膨大，故菌体胀破，如青霉素。
② 破坏细胞膜。如多粘菌素 。 ③ 与微生物核糖体蛋白结合，抑制其蛋白质合成。如 氯霉素，金霉素，土霉素，四环素，链霉素，卡那 霉素，新霉素，庆大霉素，嘌呤霉素及春日霉素等。 ④ 与DNA结合，干扰其复制。如争光霉素(博来霉素)， 丝裂霉素(自力霉素)，放线菌素D(更生霉素) 等。
每 4个同学 1组，每个稀释度 2个重复（即2 块黄色培养基， 2块红色培养基）2个稀释度共8块平板，要求菌落计数。
菌落计数：将平皿底部过圆心划成四等份，肉眼观察菌
落并计数，并用5~10倍放大镜查漏，求出同一稀释度
的平均菌落数
菌落总数报告：选取平均菌落数在30~300间的皿
①当只有一个稀释度的平皿菌落数符合此范围时，即以 该平皿菌落数乘其稀释倍数。 ②若有两个稀释度，其平均菌落数均在30~300之间， 则应求出两者菌落总数之比值来决定，若其比值≤2， 应报告其平均数，若＞2则报告其中较少的菌落数
黄连 黄芩
黄柏 银花
2.4 挖沟法
制备琼脂平板，在平板上挖沟，沟旁边垂直划线接种 试验菌，在沟中加药，根据沟两边的试验菌离沟的抑 菌距离来判定药物的抗菌作用。适用于半流动药物或 中药浸煮液的抗菌试验。 大肠杆菌
沟槽
（黄连）
金黄色葡萄球菌 痢疾杆菌
三 连续稀释法
在一系列试管中，用液体培养基按一定倍数稀释药物；
1、 无菌操作，镊子和L棒使 用前需火焰灭菌后冷却； 镊子需火焰灭菌后再取 另一药纸片。 2 、药纸片需一次贴定，不 能移动。
药物的体外抑菌试验
实验五药物的体外抗菌试验药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力。
该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药。
如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面.药物的体外抗菌试验在实验室进行，优点是方法简便、需时短、用药量少,不需要活的动物、实验条件容易控制.因此，药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了.药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法,其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法.(一)稀释法（结果示教）稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种.这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度,通常用μg∕ml或U/ml表示.（二）琼脂扩散法它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面,抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散,其浓度随扩散距离增大而降低,在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比.琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法.滤纸片法（K—B纸片法)－学生操作滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用)及临床的药敏试验(细菌药物第三性试验、以便选择用药）.滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。
一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些.至于干燥纸片的制备方法：选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时.然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入0。
5ml药液,使它均匀浸润,放在无菌平皿中，37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存.如果是β－内酰胺类抗生素还要放在—20℃保存.这就制成了干燥的含药液的纸片。
一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性,是敏感，中度敏感还是耐药。
实验4药物体外抗菌试验PPT课件
在解读结果时，需要考虑药物浓度对抑菌效果的影响。一般来说，药物浓度越高，抑菌效 果越好。因此，在比较不同药物或不同浓度时，需要确保实验条件的一致性。
结合临床实际
在解读结果时，需要结合临床实际考虑药物的抗菌效果。例如，对于某些临床常见细菌， 如果实验结果显示药物具有较好的抗菌作用，那么该药物可能对治疗该细菌感染具有一定 的应用价值。
头孢菌素类
具有广谱抗菌作用，对革 兰氏阳性菌和阴性菌均有 较强抗菌活性。
碳青霉烯类
具有非常强的抗菌作用， 对大多数细菌均有较好的 抗菌效果。
大环内酯类
红霉素
主要对革兰氏阳性菌有抗菌作用 ，对部分革兰氏阴性菌和支原体 也有效。
阿奇霉素
具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳 性菌、革兰氏阴性菌和支原体均 有较好抗菌效果。
避免不良反应
联合用药可能会增加不良反应的风险，因此应谨 慎选择药物组合。
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稀释法
总结词
稀释法是通过连续稀释抗菌药物浓度， 观察细菌生长情况，从而判断细菌对 抗菌药物的敏感程度。
详细描述
稀释法是将抗菌药物稀释成不同浓度， 然后将不同浓度的抗菌药物与细菌混 合培养。通过观察细菌的生长情况， 可以判断细菌对抗菌药物的敏感程度。
E-test法
总结词
E-test法是一种基于纸片扩散法的改良方法，通过在平板上涂布抗菌药物的纤维棒，测量抑菌圈的大小判断细菌 对抗菌药物的敏感程度。
测定药物能够抑制细菌生长的最低浓 度，是衡量药物抗菌效果的重要指标。 MIC值越低，说明药物抗菌效果越好。
细菌生长情况
观察细菌在药物作用下的生长情况， 可以评估药物的抗菌效果。如果细菌 生长受到明显抑制，说明药物具有较 好的抗菌作用。
体外抑菌实验报告
为了评估不同抗生素药物的抗菌能力，本实验通过体外抑菌实验，观察并记录抗生素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等常见细菌的抑菌效果，以期为临床合理用药提供参考。
二、实验材料1. 菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等。
2. 药物：头孢克洛、氨苄西林、阿莫西林、庆大霉素、红霉素等。
3. 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、M-H肉汤培养基。
4. 实验器材：培养皿、移液器、无菌试管、锥形瓶、酒精灯、高压蒸汽灭菌器等。
三、实验方法1. 菌株培养：将菌株接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，37℃培养24小时。
2. 药物制备：将抗生素药物溶解于M-H肉汤培养基中，制成不同浓度的药物溶液。
3. 抑菌实验：将培养好的菌株接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，制成平板。
将不同浓度的药物溶液滴加于平板上，37℃培养24小时，观察抑菌圈直径。
4. 数据记录：记录不同浓度药物溶液的抑菌圈直径，计算抑菌率。
四、实验结果1. 头孢克洛对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为18mm、15mm、13mm。
2. 氨苄西林对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，抑菌圈直径分别为12mm、10mm、5mm。
3. 阿莫西林对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，抑菌圈直径分别为10mm、8mm、4mm。
4. 庆大霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为20mm、18mm、16mm。
5. 红霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，抑菌圈直径分别为14mm、12mm、6mm。
1. 头孢克洛、庆大霉素等抗生素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌具有较强的抑菌效果，可作为临床治疗此类细菌感染的首选药物。
2. 氨苄西林、阿莫西林等抗生素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，但对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，临床应用时需注意。
药物的体外抗菌试验-第十九章
药物的体外抗菌试验-第十九章第十九章药物的体外抗菌试验教学要求.（一）掌握常用的体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。
.（二）熟悉杀菌试验（最低杀菌浓度、最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。
.（三）了解体外抗菌试验的影响因素。
第一节常用的体外抑菌试验一、药物的体外抗菌试验.又称药敏试验，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。
.最低抑菌浓度（MIC）：指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。
.优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。
.缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。
试验菌.细菌、霉菌和酵母菌常用.标准菌株：来自专门机构，我国是卫生部生物制品检定所菌种保藏中心提供。
.临床分离株：经形态、生化及血清学等方面鉴定。
不得有杂菌污染，不宜用传代多次的菌种，最好是重新活化的。
控制培养时间。
.接种菌量的多少的计算培养基.根据试验菌的营养要求进行选择.培养基质量控制供试药物.药物的浓度和总量要精确配制.供试药物用适宜溶剂溶解并稀释至所需浓度，难溶药物加助溶剂。
.中草药或某些生药原粉的样品，应先提取，再浓缩至所需浓度对照试验.试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长.已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。
.溶剂及稀释剂对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释剂应无抗菌作用（一）连续稀释法.方法：液体法和固体法。
.用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。
.抑菌：药物可抑制微生物生长繁殖，但不杀死它，在药物除去后，微生物又可恢复生长.杀菌：药物能杀死微生物，当药物去除后，微生物不再继续生长。
1、液体培养基稀释法.方法：两倍稀释法.步骤：液体培养基稀释药物成系列递减的浓度每管加入一定量试验菌24-48小时后肉眼观察试管浑浊情况，记录能抑制细菌生长的最低浓度（MIC）将未见细菌生长的各试管内的培养液（各吸取0.1ml）移种到新鲜的琼脂培养基上重新长出细菌的只具有抑菌作用，无菌生长（菌落数﹤5个）具有杀菌作用，记录最低杀菌浓度（MBC）。
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微生物与免疫学实验
实验四 药物体外抗菌试验
琼脂扩散法 纸片法
连续稀释法
• 今天要用显微镜，请单学号同学去 领显微镜，双学号同学不用领
1、 K—B纸片法（学生操作）
纸片法常用于测定试验菌对各种抗生素 的敏感性，所以又叫做药物敏感试验，在 临床上可作为选择用药的重要依据。
操作步骤
1 培养试验菌：将菌种斜面培养物移种到肉 汤培养液中，37℃培养过夜，使菌液浓度 约为1.5×108cfu/ml. 2 涂布试验菌：用无菌吸管吸取一滴菌液滴 加在MHA平板上，用无菌涂布棒（L棒）将 菌液在整个平板上涂布均匀。 3 贴含药的滤纸片：用无菌镊子贴加含药滤 纸片。 4 将平板倒置于37 ℃培养24h，观察结果， 测定抑菌圈的大小，并对照NCCLS的解释 标准来判断试验菌的药敏性。
2、连续பைடு நூலகம்释法
连续稀释法：人为配置连续梯度的药物 浓度来检测其抗菌能力，从而找出药物的 最小抑菌浓度。 最小抑菌浓度（MIC）：能抑制测试菌 生长的最低药物浓度即为MIC。 最小杀菌浓度（MBC）：能杀死测试菌 的最低药物浓度即为MBC。
试验测试(1h)
1、革兰氏染色 做好后请用油镜调好后举手示意 2、平板分区画线 做好后做好标记（学号）将平板扔到玻璃 缸中
K-B纸片法示意图
试验菌平板
庆
2.0cm
青
2.5cm
链
先
注意事项
1 以上各不操作要严格的无菌操作，镊子和L 棒都要用酒精烧过之后冷却再使用。 2 贴纸片的时候一定要一次把纸片定位好，接 触琼脂后就不能再移动含药滤纸片。 3 不同的抗菌药物其抑菌圈直径的敏感/耐药分 界点不一样；有的抗菌药物对不同的菌种的 分界点也不一致；应根据NCCLS最新公布 的分界点数据来读取药敏试验的结果。