项目7药物体外抗菌试验技术
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• 厌氧菌阳性对照菌：生孢梭状芽胞杆菌 CMCC(B)64941
• 真菌阳性对照菌：白色念珠菌CMCC(F)98001或 曲霉菌ATCC16404
需要进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的 范围：
(药品、敷料按《中国药典》收载的无菌检查法的规定进行， 生物制品应按照《生物制品制造及检定规程》中有关规定进行)
用放大镜或解剖镜观察。
◇漂浮法：将被检药物放入容器内，加饱和盐水至容器的２／
３处，搅匀，取液镜检，或继续加饱和食盐水至容器口，用载 玻片蘸取液面漂浮物镜检。
◇分离法：将药物放在特制分离器或附有筛网的漏斗内，离药
物６cm上放置６０～１００Ｗ的灯泡，照射１～２h.螨有避光 怕热的习性，便沿漏斗细颈向下爬，在漏斗下口处置一装有甘 油水的烧杯，收集爬出的螨，然后在显微镜下观察，根据其形 态特征、足肢游动情况判断是否为活螨。
可吸收的止血剂：如凝血酶等用于止血并可被组织吸收的各种 药物制剂。
无菌检查法
（一）非抗菌剂、无防腐剂、及非油剂药物的无菌检验
一般药品的无菌检验，通常应用直接接种法。若被检品是液体，可直接接种于培养基内。 若被检品是固体粉末或冻干制剂，则需用无菌生理盐水溶解，或制成均匀悬液再作检验。若被 检品是无菌敷料，则以无菌操作打开包装，于各部位剪取1cmX3cm大小的样品，再接种到培 养基中。
三、抗菌试验的影响因素
在抗菌试验中应有效控制其影响因素，才能确保试验的科学性和准确性， 主要的影响因素有： ①试验菌 ②培养基 ③供试药物 ④对照试验
.
第二节 灭菌制剂的无菌检查
❖ 无菌检查的基本原则
1. 严格进行无菌操作 2. 正确进行样品采集
3. 无菌检查用培养基
4. 需氧菌、厌氧菌培养基：硫乙醇酸盐培养基
二、控制菌的检查
1. 口服制剂中不能检出大肠杆菌 2. 脏器口服制剂不得检出沙门氏菌和大肠杆菌 3. 一般外用药和眼科制剂不得检出金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌 4. 用创伤、溃疡、止血、深部组织的药材药粉制剂不得检出破伤风杆菌。
活螨的检验
用于口服、创伤、粘膜和腔道的药品均不得检出活螨
◇直接观察法：用肉眼直接观察被检药物上有无白点移动，再
（二）油剂的无菌检验
油剂药物与液体培养基不能混溶，故常漂浮于液体培养基表面而影响试验结果。因 此，此类药物做无菌检验时，应在培养基内加入表面活性剂(吐温—80)，使药物均匀分 布于培养基中，以利于细菌的生长和检出。有的药物如青霉素油剂等，由于粘稠度过 大，可先用灭菌植物油或灭菌液体石蜡进行一定倍数的稀释，然后取样接种到含吐 温—80的培养基中，充分摇匀使药物均匀分散在培养基中。
1、灭活法 ２、薄膜过滤法 ３、离子交换树脂法 4、稀释法
第三节 微生物的限度检查
微生物限度检查项目内容：
❖ 微生物限度检查的基本原则 ❖ 染菌量的检查 ✓ 细菌数 ✓ 霉菌数 ❖ 控制菌的检查 ✓ 大肠埃希氏杆菌(大肠杆菌) ✓ 金黄色葡萄球菌 ✓ 沙门氏菌 ✓ 铜绿假单胞菌(绿脓杆菌) ✓ 破伤风杆菌 ❖ 活螨的检验
各种注射剂：用于肌肉、皮下和静脉的各种针剂，包括注射用 的无菌水、输 液、注射剂 原液等。
眼用及外伤用制剂：用于眼科手术、角膜创伤及一般创伤、溃 疡和烧伤等外科用药制剂。
外科用的敷料、器材：如外 科手术用的脱脂棉、纱布、缝合线 及一次性注射器与一次性无菌手术刀片、输血袋等。
植入剂：用于包埋于人体内的药物制剂，如不溶于水的激素、 免疫药物及抗肿瘤药物等无菌的制剂。
2．活菌计数法
在—定浓度的定量药物内，加入—定量的试验菌，作用—定时间后取样稀释，再取— 定量的此稀释液混入未凝固的琼脂培养基中，立即倾注成平板，培养后计算菌落数。 由于每个菌落是由—个菌细胞繁殖而来，则菌落数或菌落形成单位CFU)乘以稀释倍数， 再除以稀释液用量，即得该药物与试验菌的混合液中每毫升内存活的细菌数或CFU， 从而可算出该药物对细菌的致死率。
5. 真菌培养基 6. 选择性培养基
7. 阴性对照及阳性对照
8. 阴性对照
阴性对照应不长细菌，说明培养基本身 是无菌可靠的；阳性对照试验必须长菌， 说明应用的细菌是可以在该试验条件下 正常生长的。
9. 阳性对照
10. 抑菌试验 11. 无菌检查法 12. 无菌检验结果判断
• 需氧菌阳性对照菌：金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003或藤黄八叠球菌CMCC(B)28001
.
二、药物的体内抗菌试验
体外抗菌试验有效的药物，还需要经过体内抗菌试验证明有 效后，才能推荐应用于临床。
体内抗菌试验即动物的实验治疗或保护力试验。动物实验治疗的方法，大 致是先用致病菌使动物体表或体内感染，造成感染动物模型，然后按不同剂 量、不同给药方法(如腹腔注射、皮下注射、肌肉注射或口服等)以及间隔不同 时间进行实验治疗。实验时还要设立一组动物用生理盐水代替药物进行对照 治疗。然后根据实验组与对照组的动物死亡数或内脏的含菌数，评价药物的 作用和效力。
体外抑菌试验是最常用的抗菌试验，常用的方法主要有琼脂扩散法和系列稀释法。 １.连续稀释法 1)液体培养基连续稀释法 2)固体培养基连续稀释法: 平板法、斜面法 ２.琼脂扩散法 1）滤纸片法 2）挖沟法 3）管碟法 4）打孔法
(二)体外杀菌试验
用途：评价药物对微生物的致死活性
1．最小杀菌浓度的测定
是取MIC终点以上未长菌的各管培养液，分别取出并移种于无菌平板上，培养后凡平 板上无菌生长的药物最低浓度，即为该药物的MBC。对微生物广义而言，也可称之为 最小致死浓度 (MLC)。某药物能杀死微生物的最低浓度。
一、染菌量的检查
1. 目的
▪ 细菌数测定我们是为了考察每克或每毫升供试品所污染的活细菌数，来判明供试品 被细菌污染的程度。
▪ 霉菌的测定是考察每克或每毫升供试品所污染的活的霉菌数，以此来判明供试品被 真菌污染的程度。
2. 测定的方法
➢ 细菌总数的测定 营养琼脂平板培养基 +0.001%三苯四唑氯化物（TTC） ➢ 霉菌总数的测定 玫瑰红钠（马丁）培养基
（三）抗菌药物及含防腐剂药物的无菌检验
抗菌药物指药物本身为抗菌剂(如抗生素、磺胺药等)以及在药物制剂中含有部分抗菌 剂(如防腐剂)的药物。抗菌药物及含防腐剂的药物进行无菌检验时，与一般药物不同之 处在于进行无菌检验前，必须用某些方法使抗菌药物或防腐剂消除、失效，才能不影 响对被检药物是否无菌作出确认。
项目7 药物体外抗菌试验技术
▪ 模块1 必备知识——药物的体外抗菌试验
主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性，又称药敏试验。 体外抗菌试验包括抑菌和杀菌两个方面。
（一）体外抑菌试验
最小抑菌浓度(MIC) ：MIC是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度。通常用MIC评价药物 抑菌作用的效力，以μg/ml或U/ml表示。其值越小，说明抑菌作用愈强。
3．酚系数测定
是用来测定消毒剂效力的一种指标，是以石炭酸为标准，在相同的实验条件下，将 消毒剂和石炭酸的杀菌力作比较，所得的杀菌效力的比值，石炭酸系数≥2为合格。
（Hale Waihona Puke Baidu）联合抗菌试验法
同时应用两种抗菌药物时，两种药物之间既可能 产生相互影响，也可能彼此不影响；产生影响时，既 可能是相互加强(协同作用)，或两药作用出现累加现 象(即两药作用之和)也可能是相互减弱(拮抗作用)， 要确定两种药物之间的作用关系时，通常需用联合抗 菌试验法。 最简便、最常用的方法：纸条或纸片试验法。
• 真菌阳性对照菌：白色念珠菌CMCC(F)98001或 曲霉菌ATCC16404
需要进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的 范围：
(药品、敷料按《中国药典》收载的无菌检查法的规定进行， 生物制品应按照《生物制品制造及检定规程》中有关规定进行)
用放大镜或解剖镜观察。
◇漂浮法：将被检药物放入容器内，加饱和盐水至容器的２／
３处，搅匀，取液镜检，或继续加饱和食盐水至容器口，用载 玻片蘸取液面漂浮物镜检。
◇分离法：将药物放在特制分离器或附有筛网的漏斗内，离药
物６cm上放置６０～１００Ｗ的灯泡，照射１～２h.螨有避光 怕热的习性，便沿漏斗细颈向下爬，在漏斗下口处置一装有甘 油水的烧杯，收集爬出的螨，然后在显微镜下观察，根据其形 态特征、足肢游动情况判断是否为活螨。
可吸收的止血剂：如凝血酶等用于止血并可被组织吸收的各种 药物制剂。
无菌检查法
（一）非抗菌剂、无防腐剂、及非油剂药物的无菌检验
一般药品的无菌检验，通常应用直接接种法。若被检品是液体，可直接接种于培养基内。 若被检品是固体粉末或冻干制剂，则需用无菌生理盐水溶解，或制成均匀悬液再作检验。若被 检品是无菌敷料，则以无菌操作打开包装，于各部位剪取1cmX3cm大小的样品，再接种到培 养基中。
三、抗菌试验的影响因素
在抗菌试验中应有效控制其影响因素，才能确保试验的科学性和准确性， 主要的影响因素有： ①试验菌 ②培养基 ③供试药物 ④对照试验
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第二节 灭菌制剂的无菌检查
❖ 无菌检查的基本原则
1. 严格进行无菌操作 2. 正确进行样品采集
3. 无菌检查用培养基
4. 需氧菌、厌氧菌培养基：硫乙醇酸盐培养基
二、控制菌的检查
1. 口服制剂中不能检出大肠杆菌 2. 脏器口服制剂不得检出沙门氏菌和大肠杆菌 3. 一般外用药和眼科制剂不得检出金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌 4. 用创伤、溃疡、止血、深部组织的药材药粉制剂不得检出破伤风杆菌。
活螨的检验
用于口服、创伤、粘膜和腔道的药品均不得检出活螨
◇直接观察法：用肉眼直接观察被检药物上有无白点移动，再
（二）油剂的无菌检验
油剂药物与液体培养基不能混溶，故常漂浮于液体培养基表面而影响试验结果。因 此，此类药物做无菌检验时，应在培养基内加入表面活性剂(吐温—80)，使药物均匀分 布于培养基中，以利于细菌的生长和检出。有的药物如青霉素油剂等，由于粘稠度过 大，可先用灭菌植物油或灭菌液体石蜡进行一定倍数的稀释，然后取样接种到含吐 温—80的培养基中，充分摇匀使药物均匀分散在培养基中。
1、灭活法 ２、薄膜过滤法 ３、离子交换树脂法 4、稀释法
第三节 微生物的限度检查
微生物限度检查项目内容：
❖ 微生物限度检查的基本原则 ❖ 染菌量的检查 ✓ 细菌数 ✓ 霉菌数 ❖ 控制菌的检查 ✓ 大肠埃希氏杆菌(大肠杆菌) ✓ 金黄色葡萄球菌 ✓ 沙门氏菌 ✓ 铜绿假单胞菌(绿脓杆菌) ✓ 破伤风杆菌 ❖ 活螨的检验
各种注射剂：用于肌肉、皮下和静脉的各种针剂，包括注射用 的无菌水、输 液、注射剂 原液等。
眼用及外伤用制剂：用于眼科手术、角膜创伤及一般创伤、溃 疡和烧伤等外科用药制剂。
外科用的敷料、器材：如外 科手术用的脱脂棉、纱布、缝合线 及一次性注射器与一次性无菌手术刀片、输血袋等。
植入剂：用于包埋于人体内的药物制剂，如不溶于水的激素、 免疫药物及抗肿瘤药物等无菌的制剂。
2．活菌计数法
在—定浓度的定量药物内，加入—定量的试验菌，作用—定时间后取样稀释，再取— 定量的此稀释液混入未凝固的琼脂培养基中，立即倾注成平板，培养后计算菌落数。 由于每个菌落是由—个菌细胞繁殖而来，则菌落数或菌落形成单位CFU)乘以稀释倍数， 再除以稀释液用量，即得该药物与试验菌的混合液中每毫升内存活的细菌数或CFU， 从而可算出该药物对细菌的致死率。
5. 真菌培养基 6. 选择性培养基
7. 阴性对照及阳性对照
8. 阴性对照
阴性对照应不长细菌，说明培养基本身 是无菌可靠的；阳性对照试验必须长菌， 说明应用的细菌是可以在该试验条件下 正常生长的。
9. 阳性对照
10. 抑菌试验 11. 无菌检查法 12. 无菌检验结果判断
• 需氧菌阳性对照菌：金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003或藤黄八叠球菌CMCC(B)28001
.
二、药物的体内抗菌试验
体外抗菌试验有效的药物，还需要经过体内抗菌试验证明有 效后，才能推荐应用于临床。
体内抗菌试验即动物的实验治疗或保护力试验。动物实验治疗的方法，大 致是先用致病菌使动物体表或体内感染，造成感染动物模型，然后按不同剂 量、不同给药方法(如腹腔注射、皮下注射、肌肉注射或口服等)以及间隔不同 时间进行实验治疗。实验时还要设立一组动物用生理盐水代替药物进行对照 治疗。然后根据实验组与对照组的动物死亡数或内脏的含菌数，评价药物的 作用和效力。
体外抑菌试验是最常用的抗菌试验，常用的方法主要有琼脂扩散法和系列稀释法。 １.连续稀释法 1)液体培养基连续稀释法 2)固体培养基连续稀释法: 平板法、斜面法 ２.琼脂扩散法 1）滤纸片法 2）挖沟法 3）管碟法 4）打孔法
(二)体外杀菌试验
用途：评价药物对微生物的致死活性
1．最小杀菌浓度的测定
是取MIC终点以上未长菌的各管培养液，分别取出并移种于无菌平板上，培养后凡平 板上无菌生长的药物最低浓度，即为该药物的MBC。对微生物广义而言，也可称之为 最小致死浓度 (MLC)。某药物能杀死微生物的最低浓度。
一、染菌量的检查
1. 目的
▪ 细菌数测定我们是为了考察每克或每毫升供试品所污染的活细菌数，来判明供试品 被细菌污染的程度。
▪ 霉菌的测定是考察每克或每毫升供试品所污染的活的霉菌数，以此来判明供试品被 真菌污染的程度。
2. 测定的方法
➢ 细菌总数的测定 营养琼脂平板培养基 +0.001%三苯四唑氯化物（TTC） ➢ 霉菌总数的测定 玫瑰红钠（马丁）培养基
（三）抗菌药物及含防腐剂药物的无菌检验
抗菌药物指药物本身为抗菌剂(如抗生素、磺胺药等)以及在药物制剂中含有部分抗菌 剂(如防腐剂)的药物。抗菌药物及含防腐剂的药物进行无菌检验时，与一般药物不同之 处在于进行无菌检验前，必须用某些方法使抗菌药物或防腐剂消除、失效，才能不影 响对被检药物是否无菌作出确认。
项目7 药物体外抗菌试验技术
▪ 模块1 必备知识——药物的体外抗菌试验
主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性，又称药敏试验。 体外抗菌试验包括抑菌和杀菌两个方面。
（一）体外抑菌试验
最小抑菌浓度(MIC) ：MIC是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度。通常用MIC评价药物 抑菌作用的效力，以μg/ml或U/ml表示。其值越小，说明抑菌作用愈强。
3．酚系数测定
是用来测定消毒剂效力的一种指标，是以石炭酸为标准，在相同的实验条件下，将 消毒剂和石炭酸的杀菌力作比较，所得的杀菌效力的比值，石炭酸系数≥2为合格。
（Hale Waihona Puke Baidu）联合抗菌试验法
同时应用两种抗菌药物时，两种药物之间既可能 产生相互影响，也可能彼此不影响；产生影响时，既 可能是相互加强(协同作用)，或两药作用出现累加现 象(即两药作用之和)也可能是相互减弱(拮抗作用)， 要确定两种药物之间的作用关系时，通常需用联合抗 菌试验法。 最简便、最常用的方法：纸条或纸片试验法。