项目7药物体外抗菌试验技术
抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验
《生物工程综合实验平台》——《抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验》专业班级：学号：姓名：小组成员：实验日期：5月27日-5月30日微生物综合实验抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验班级16级生物技术1、2班姓名学号座位号实验日程安排抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验一、实验原理抗菌药物一般是指具有抑菌或杀菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。
由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也可化学全合成。
抗菌药物在一定浓度下对病原体有抑制和杀灭作用。
药物的体外抑菌实验，是指在体外测定药物抑制或杀灭细菌能力的实验。
它是常用抗菌实验的方法，其中最常用的方法有系列稀释法和琼脂扩散法。
稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种，这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用ug/ml或U/ml表示。
其结果判断方法为凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）。
琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低。
在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈。
抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。
一般药敏实验常采用纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。
世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈的大小来判断，如：药物的体内抗菌实验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。
当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。
如血液及组织内的蛋白质或磷脂、浓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。
最新体外抗菌药物抑菌试验(亦称细菌对药物的敏感试验-简称药...-药学医学精品资料
3 用灭菌棉拭子蘸取相当于1.5×108CFU/m1 的金黄色葡萄球菌菌液，在试管内壁旋转挤 去多余菌液后，在MHA 平板表面上，从不同 方向均匀涂布3次，每次旋转平板60度，最后 沿平板内缘涂抹1圈。同样方法涂布大肠埃希 菌。
4
5
平板在室温下干燥3～5min后。根据试验菌 株选择抗菌谱。如阳性球菌:金黄色葡萄球菌 选择青霉素(PEN)、苯唑西林(OXA) 环丙沙 星(CIP)、万古霉素(VAN)、克林霉素(CLI)等。 大肠埃希菌选用氨苄西林(AMP)、头抱唑林 (FZN)、庆大霉素(GEN)、环丙沙星(CIP)、 亚胺配南(IMP)等。 用无菌镊子将含药纸片，紧贴于琼脂表面， 各纸片之间相距应大于24mm，纸片距平板 内缘应大于15mm，置37℃孵育18h～24h观 看结果。
原理 是将定量抗菌药物纸片贴在涂有细菌的 琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散， 其浓度逐渐递减，使纸片周围的敏感细菌受 到抑制生长，形成抑菌圈，测量抑菌圈的直 径来判定细菌对药物的敏感程度。此法简单 易行、价格便宜、药物选择灵活，适用对生 长快的细菌进行药敏试验。
材料
1 水解酪蛋白琼脂（Mueller-Hinton AgarMHA） 倾注成4mm厚的12～15cm平板，将其保存 于4℃冰箱可用1周。 2硫酸钡比浊管 1.175%氯化钡 （BaCl2 .2H2O）0.5ml加0.36N(1%)流酸溶 液99.5ml,充分混匀，每管4ml其浊度相当于 0.5麦氏（McFarland standard）比浊管第一 管1/2（1.5亿/ml相当于1.5×108CFU／m1）, 使用期半年。
操作方法
药物原液配制 原液浓度常为测定浓度的10倍以上。根据药 物性能选择溶剂。例如 取青霉素钾注射粉剂80万u/支 + 蒸馏水 4ml→20万u /ml，取1ml +9mlMH 肉汤→2万 u /ml，取2万u /ml的5.12ml药液+MH肉汤 14.88ml→5120 u /ml，分装4ml/支，-20℃保 存）。
第十九章药物的体外抗菌试验
抑菌圈的大小反映待测菌对该药物的敏感程度并与 该待测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈 越大，最低抑菌浓度就越小。
最低抑菌浓度（MIC）：指抗菌药物能够抑制细菌生长 所需要的最低浓度，单位是ug/ml或u/ml。
如庆大霉素对铜绿假单胞菌的MIC为1.56ug/ml，青 霉素G的MIC>128ug/ml，由此可判定庆大霉素对铜绿 假单胞菌的抑菌效力大于青霉素。
5、影响结果的因素
（1）培养基：除在M－H培养基上无法生长的细菌外，一 般都固定使用M－H培养基。
（2）抗菌药物：原则上采用标准粉剂，不用口服药物，配 好的原液应在有效期内使用。
（3）结果观察：应在12－18小时之间。培养时间过长，轻 度抑制的细菌可重新生长；或抗菌活性降低，甚至消失， 从而使MIC值增高。
（3）接种菌液的准备：从纯培养的平板上挑取形态相同 的4－5个菌落，接种于 3－5mlM－H液体培养基内， 35℃培养4－6小时，营养要求高的则培养过夜，然后校 正菌液浓度至0. 5麦氏比浊标准，再用M－H液体培养基 作1：200稀释，并在15分钟内接种。
3、试验步骤
（1）排列10－15支试管，除第1支外，各管加入M－H液 体培养基1ml。
（三）实验步骤
（1）菌液接种：用灭菌过的棉拭蘸取已制备的菌液涂抹 在M－H平板培养基的表面，均匀涂抹3次，每涂一次，平 板应转动60度，最后将棉拭绕平板内缘涂沫一圈，盖上平 皿盖，放置室温干燥数分钟。
（2）药物纸片的贴放：以无菌镊子取各种抗菌药物纸 片，贴放于已接种过试验菌的平板培养基表面，纸片贴后 不能再移动，因为有些药物可立即扩散。各纸片中心间距 不小于24mm，距平板边缘不小于15mm。直径为90mm的 平板可贴放6张纸片。贴后15分钟内倒置35℃培养箱16－ 18小时后阅读结果。
药物的体外抗菌试验-第十九章
药物的体外抗菌试验-第十九章第十九章药物的体外抗菌试验教学要求.（一）掌握常用的体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。
.（二）熟悉杀菌试验（最低杀菌浓度、最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。
.（三）了解体外抗菌试验的影响因素。
第一节常用的体外抑菌试验一、药物的体外抗菌试验.又称药敏试验，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。
.最低抑菌浓度（MIC）：指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。
.优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。
.缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。
试验菌.细菌、霉菌和酵母菌常用.标准菌株：来自专门机构，我国是卫生部生物制品检定所菌种保藏中心提供。
.临床分离株：经形态、生化及血清学等方面鉴定。
不得有杂菌污染，不宜用传代多次的菌种，最好是重新活化的。
控制培养时间。
.接种菌量的多少的计算培养基.根据试验菌的营养要求进行选择.培养基质量控制供试药物.药物的浓度和总量要精确配制.供试药物用适宜溶剂溶解并稀释至所需浓度，难溶药物加助溶剂。
.中草药或某些生药原粉的样品，应先提取，再浓缩至所需浓度对照试验.试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长.已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。
.溶剂及稀释剂对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释剂应无抗菌作用（一）连续稀释法.方法：液体法和固体法。
.用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。
.抑菌：药物可抑制微生物生长繁殖，但不杀死它，在药物除去后，微生物又可恢复生长.杀菌：药物能杀死微生物，当药物去除后，微生物不再继续生长。
1、液体培养基稀释法.方法：两倍稀释法.步骤：液体培养基稀释药物成系列递减的浓度每管加入一定量试验菌24-48小时后肉眼观察试管浑浊情况，记录能抑制细菌生长的最低浓度（MIC）将未见细菌生长的各试管内的培养液（各吸取0.1ml）移种到新鲜的琼脂培养基上重新长出细菌的只具有抑菌作用，无菌生长（菌落数﹤5个）具有杀菌作用，记录最低杀菌浓度（MBC）。
药物的体外抗菌试验药物制剂的微生物学检查
三、耐药性的控制
1 、避免耐药菌传播（医院） 2 、合理用药 （1）抗生素可不用尽量不用，使用时应足量。 （2）合理联合用药 3、 抗耐药菌新抗生素的寻找，如酶抑制剂抗生 素等。 4 、耐药机制的研究—耐药规律寻找，有助于合 理用药。
四、耐药性和青霉素酶的测定
1 、耐药性—药敏试验 2 、青霉素酶 耐药菌接平板培养 →加含青霉素的淀粉 → 加I2出现透明圈（eg.金葡菌产酶 株）。
医疗用抗生素的特点
差异毒力大 生物活性强、有不同抗菌谱 不易使病原菌产生耐药性 毒副作用小，不易引起超敏反应 半衰期长，生物利用度高
抗生素的分类 抗生素产生菌的分离和筛选 抗生素的制备 抗生素的生物合成 抗生素的主要作用机制 抗药性 抗生素的单位及效价测定
（1）按化学结构分类
ß-内酰胺类—青霉素、头孢菌素等 四环类—四环素、土霉素、金霉素 氨基糖苷类—链霉素、卡那霉素、庆大霉素 大环内酯类—红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素 多肽类—多黏菌素、杆菌肽等 多烯类—制霉菌素、两性霉素B、万古霉素 苯羟基胺类—氯霉素 蒽环类—柔红霉素、阿霉素 环桥类—利福霉素 其他
平板倍比稀释法
目前抗生素的临床前研究一般采用此法。平板倍比稀释法是 根据药物在琼脂培养基中扩散的原理，将细菌接种在含有不 同浓度抗生素的平板上恒温培养16~18小时，可抑制细菌生长 的最低药物浓度为最低抑菌浓度（MIC），可杀灭细菌的最低 药物浓度为最低杀菌浓度（MBC）。MIC或MBC值愈小，则药 物的抑菌或杀菌作用愈强。
磺胺类耐药菌株合成了对磺胺不敏感的二氢叶酸合 成酶，而引起耐药。 （靶位的改变）
喹诺酮类耐药菌的gyrA(gyrase)基因突变，DNA螺 旋酶A亚单位的变化，对该类药物不敏感。其中， gyrase（DNA旋转酶）为一种类型的拓扑异构酶， 引入负超螺旋至闭环双链DNA中。 （靶位的改变）
实验六、抗菌药物的体外药效试验
实验六、抗菌药物的体外药效试验（药敏试验）各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。
此外，通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。
药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验（Kirby-Baueer Dice Diffusion）；最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最低杀菌浓度试验（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）。
［目的要求］1、熟悉体外抗菌试验操作技术。
2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。
［实验原理］常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法。
琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。
根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。
经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。
浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）。
1、细菌：所用细菌应包括主要致病菌。
革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。
革兰氏阴性球菌如淋球菌等。
革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等。
对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。
其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200-500株。
试验时应包括有国际公认质控菌株(如金葡菌ATCC25925，大肠杆菌ATCC25922和绿脓杆菌ATCC27853等)。
《药学微生物》3-5-1 药物抗菌性的测定技术
挖沟法
可以根据沟和细菌间的抑菌距离的长短， 来判断该药物对这些细菌的抗菌能力。
图 挖沟法
打孔法：
在含菌琼脂平板上打洞（一般打6个孔， 4个小孔加不同浓度标准溶液，另外2个小孔 加血清样品，放在37℃，12-18小时，测定 其抑菌圈直径。所以说微量法适于药物血浓 度的监测。
机体本身对细菌有较强的抵抗力，一 般细菌感染动物后不易使动物致病，所以 体内抗菌实验模型建立比较困难，动物实 验感染模型一般分为全身感染和局部感染 模型。
管碟法：
与打孔法原理相同，只是把药液加入放到琼 脂板上的牛津杯中。加药量相对比较多，适合 中药的体外抗菌试验。
3．抗菌药物的联合应用 （1）棋盘稀释法 （2）琼脂扩散纸片法
纸条试验：
1．只有横条纸 片含抗菌药 2．两条纸片含 不同抗菌药
图 联合抗菌试验纸条法
1．梯度平板制备 2．加强作用 图 纸条梯度平板试验
3、中草药的抗菌作用
4、其他抗菌剂（消毒剂、 防腐剂）的作用机制
试验菌
二、药物抗菌作用试验方法 （一）药物体外抗菌试验 1、影响抗菌试验的因素控制
培养基
供试药物
对照 试验
2．药物的体外抗菌试验技术 常用的有稀释法和琼脂扩散法。
稀释法是药物系列稀释后加入菌液，观察细菌 生长与否来判断结果。常用于测定药物的最低 抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。
图 液体培养基连续稀释法
琼脂扩散法
纸片扩散法 挖沟法 平板打孔法 管碟法等
纸片扩散法:
一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根 据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性， 是敏感，中度敏感还是耐药。选用吸水力强而且 质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆 纸片，120℃干燥灭菌2小时。然后把配制好的 各种适宜浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入 0.5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中， 37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存。
药物体外抗菌试验
主 要 内 容
教师讲解 1组/2人
4人/组
药物体外抗菌试验
MIC及MBC的测定 药敏试验——纸片法（大肠/金葡） 药物的细菌和霉菌总数测定
体外抗菌试验
：能抑制测试菌生长的最低药物浓度即为 连续稀释法（MIC） MIC。 ：能杀死测试菌的最低药物浓度即为MBC。
琼脂扩散法（K-B纸片法）
药物的细菌和霉菌总数测定
为什么要检定药品中的细菌和 真菌总数 ？ 细菌菌落总数（ Colony Form Unit，简写CFU ），指每克 或每毫升待检药品内含有的活 菌总数。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(1)
无菌操作取供试药品1 g或1mL，取10 mL无菌生理盐水，在无菌研钵中加入药 品和少量pH7.0无菌氯化钠–蛋白胨缓冲 液，将药品研碎，再将剩余的pH7.0无菌 氯化钠–蛋白胨缓冲液全部倒入并研匀， 制成的均匀1：10（ 10-1 ）供试液。
MIC及MBC的测定
MBC
不含药的平板
纸片法的原理
K-B纸片法
无菌吸管少量菌液滴加于平板 培养基（MHA）中央（2滴）； 涂布棒将菌液涂开； 做好标记；镊子夹取相应药物 纸片贴于含菌平板表面； 37℃培养箱内倒置培养24h； 测量抑菌圈直径（3次取平均 值）,并对照NCCLS的解释标准 （105页）来判断试验菌的药 敏性。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(4)计算每个平板上生长的菌落数，选菌 落数小于300之间的平板计算，菌落数乘 以稀释倍数，求得每克或每毫升供试品 中所含的菌落总数。
注意
1 无菌操作。 2 不同稀释剂不可使用同一吸管。 3倾倒培养基时温度不宜过高。 4培养时培养基要倒置。 5 做阴性对照。
体外抗菌药物抑菌试验(亦称细菌对药物的敏感试验-简称药...
❖ 敏感(S)：表示细菌可被常规剂量的药物在体内达到 的浓度所抑制或杀灭。
❖ 中度敏感(MS)：表示细菌可被该药物大剂量的浓度 所抑制或在药物生理性浓集的部位被抑制。
只有少数药物可报告中度敏感，如氨苄青霉素测肠 球菌。
❖ 中介度(1)：是为防止因技术因素失控导致结果误差 而设置的“缓冲域”因其临床意义难以确定，故不 应向临床医师报告。而应重做稀释法根据MIC结果 做出判断。
优缺点
❖ 稀释法是直接定量地检测抗菌药物在体 外对病原菌的抑制或杀灭浓度，有利于 临床根据MIC、药物代谢等拟定合理的 治疗方案，是目前厌氧菌的最佳测定方 法，琼脂稀释法还易于发现污染或耐药 突变菌。稀释法是新药开发，体外药敏 试验常用的经典参照标准，但操作相对 比较烦琐。
❖ 标准菌株的抑菌圈应落在表中所示的预期范 围内。如果超出该范围，应视为失控，须及 时查找原因，予以纠正。
❖ 培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、 试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具 的精度、质控菌株的药敏特性等均能影响结 果的准确性。
（二）肉汤稀释法 及琼脂稀释法
❖ 原理 是用水解酪蛋白肉汤(MH)或水解酪 蛋白琼脂（MHA）培养基作为稀释剂。 按《美国委员会临床实验室标准》作分 步倍比稀释抗菌药物，定量加入被检菌 株。经培养后观察抗菌药物的最小抑菌 浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。
❖ 根据本国国情，卫生部临床检验中心还制订了关于 临床微生物实验室室内质控要求。临床具体工作须 参照遵守。
❖ 原理 是将定量抗菌药物纸片贴在涂有细菌的 琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散， 其浓度逐渐递减，使纸片周围的敏感细菌受 到抑制生长，形成抑菌圈，测量抑菌圈的直 径来判定细菌对药物的敏感程度。此法简单 易行、价格便宜、药物选择灵活，适用对生 长快的细菌进行药敏试验。
7药物的体外抗菌活性 抗生素效价测定
+ -
+ -
+ +
+ +
+ + +
+ +
+ + + +
MIC≤0.5
MIC＞64 操作有误
MIC=8
注意：计算MIC值时，抗生素的量被 稀释了10倍，注意换算！
二、抗生素效价测定（p288）
Biological Assay of Antibiotics
• 抗生素效价分析：一般用芽孢杆菌，采用微生物
实验内容
一、药物的体外抗菌实验（p277）
二、抗生素效价测定（p288）
一、药物的体外抗菌实验（p277）
• 琼脂扩散渗透法（滤纸法，已做）。
• 系列浓度稀释法，测定药物的MIC。
概 念
• MIC: 最低抑菌浓度, 药物能够抑制微生物
生长的最低浓度；mg/ml或ug/ml为单位。
• MBC: 最低杀菌浓度，能杀灭微生物生长
• Calculation method by formulae
W=(SH +UH) – (SL + UL)
V=(UH +UL) – (SH + SL)
θ= D×antilog(IVFra bibliotekW)• Calculation method by figures
Notes：效价以百分数表示
学方法测定，包括稀释法，比浊法和琼脂扩散法
• 琼脂扩散法-管蝶法 (Cylinder plate method)：
灵敏度高、能直接显示出抗生素的抗菌活性。
已列入药典。
琼脂扩散法-管蝶法
• 一剂量法、二剂量法（常用）、三剂量法
体外抗菌实验PPT精选文档
1
药物的体外抗菌试验
药物的体外抗菌试验是在体外测定微 生物对药物敏感程度的试验，
已广泛地应用于科研、生产和临床。如抗菌 药物的筛选、提取过程中的追踪、抗菌谱的定、 药物含量的测定、药物血浓度测定、指导临床用 药的药敏试验等。
抗菌试验包括抑荫试验和杀菌试验。
抑菌：即抑制微生物的生长繁殖，但不能杀死微 生物，在药物除去后微生物又能生长. 杀菌：即能杀死微 生物，当药物除去后，微生 物也不能再生长繁殖。
2
第一节 常用的体外抑菌试验
连续稀释法：
可用于测定药物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀 菌浓度(MBC)。可以用液体培养基，也可用固体培 养基。
1．液体培养基连续稀释法 2．固体培养基连续稀释法
分平板法和斜面 法。
3
琼脂扩散法：
是利用药物可以在琼脂培养基中扩散，在药 物有效浓度的范围内形成抑菌圈或抑菌距离，以 抑菌圈直径或抑菌距离的大小来评价药物抗菌作 用强弱。
7
第三节 联合抗菌试验
在药学上作中，常需检查两种抗菌药物 在联合应用时的相互作用以及抗菌药物与不 同pH值或不同离子溶液的相互影响。如加强 药物抗菌作用的为协同(synergism)；减弱药 物作用的为拮抗(antagonism)；相互无影响的 为无关(indjfference)；作用为二者之和的为累 加(addition)。
8
纸条试验
即在已接种试验菌的平板表面垂直放置两条各浸有 一种药液的滤纸条，培养后根据抑菌区的加强、减弱或 无影响来判断它们在联合应用时的效应。
梯度平板纸条试验
需先制备含药的梯度平板。将试验菌悬液涂布于 平板表面，取滤纸条浸透另一待检药液，按梯度平板 中药物浓度递减的方向置于平板表面。培养后，如该 待检药液对平板内的药物有加强作用，则可见沿纸条 两边的抑菌区被扩大。
项目7药物体外抗菌试验技术
• 厌氧菌阳性对照菌：生孢梭状芽胞杆菌 CMCC(B)64941
• 真菌阳性对照菌：白色念珠菌 CMCC(F)98001或曲霉菌ATCC16404
需要进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的范围：
(药品、敷料按《中国药典》收载的无菌检查法的规定进行， 生物制品应按照《生物制品制造及检定规程》中有关规定进行)
选择性培养基
❖ 阴性对照及阳性对照
1.
阴性对照
2.
阳性对照
阴性对照应不长细菌，说明培养基本身是无 菌可靠的；阳性对照试验必须长菌，说明应 用的细菌是可以在该试验条件下正常生长的。
❖ 抑菌试验
❖ 无菌检查法
❖
无菌检验结果判断
•
需氧菌阳性对照菌：金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003或藤黄八叠球菌
CMCC(B)28001
绿脓杆菌 4. 用创伤、溃疡、止血、深部组织的药材药粉制剂不
得检出破伤风杆菌。
活螨的检验
用于口服、创伤、粘膜和 腔道的药品均不得检出活 螨
01
直接观察法：用肉眼直接 观察被检药物上有无白点 移动，再用放大镜或解剖 镜观察。
02
04
分离法：将药物放在特制分离器或附 有筛网的漏斗内，离药物６cm上放置 ６０～１００Ｗ的灯泡，照射１～２h. 螨有避光怕热的习性，便沿漏斗细颈 向下爬，在漏斗下口处置一装有甘油 水的烧杯，收集爬出的螨，然后在显 微镜下观察，根据其形态特征、足肢 游动情况判断是否为活螨。
1. 目的
▪ 细菌数测定我们是为了考察每克或每毫升供试品所 污染的活细菌数，来判明供试品被细菌污染的程度。
▪ 霉菌的测定是考察每克或每毫升供试品所污染的活 的霉菌数，以此来判明供试品被真菌污染的程度。
七种抗真菌药物对马拉色菌的体外抑菌试验研究
七种抗真菌药物对马拉色菌的体外抑菌试验研究郑晓晖;夏修蛟;王志东;许爱娥【期刊名称】《中国皮肤性病学杂志》【年(卷),期】2006(20)2【摘要】目的应用液基微量稀释法测定酮康唑、联苯苄唑、伊曲康唑、氟康唑、咪康唑、特比萘芬、环比酮胺7种抗真菌药物对马拉色菌的最小抑菌浓度。
方法液基微量稀释法，制备微量药敏板，观察不同浓度药物中，真菌生长情况。
结果7种药物的MIC范围为酮康唑〈0．125μg/ml，联苯苄唑0．5～2μg/ml，伊曲康唑〈0．125-0．25μg/ml，氟康唑8—32μg/ml，咪康唑8～32μg/ml，特比萘芬0．5—4μg/ml，环比酮胺16—32μg/ml，对照二甲基亚砜〉64μg/ml。
结论7种药物抑菌效力从高到低依次为酮康唑、伊曲康唑、联苯苄唑、特比萘芬、咪康唑、氟康唑、环吡酮胺，为临床用药提供了参考。
【总页数】3页(P75-76)【关键词】马拉色菌;抗真菌剂;液基微量稀释法【作者】郑晓晖;夏修蛟;王志东;许爱娥【作者单位】杭州市三医院皮肤科【正文语种】中文【中图分类】R519【相关文献】1.苦参不同制剂及成分对合轴马拉色菌标准株体外抑菌实验研究 [J], 张丰川;蔡玲玲;李元文;赵雅静;周志强;赵凤珠2.二味蒙药对糠秕马拉色菌的体外抑菌试验研究 [J], 任志欣;李东霞;杨丽敏3.香鳞毛蕨有效部位对糠秕马拉色菌的体外抗真菌作用研究 [J], 王洁;唐春萍;江涛;沈志滨;陈艳芬;黄奕曦4.马拉色菌对八种抗真菌药物的体外敏感性检测 [J], 穰真;杨戈;王有为5.马拉色菌对三种唑类抗真菌药的体外药敏试验 [J], 黄欣;温海;徐红;朱元杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
从而测得抗菌药物的最低抑菌浓度MIC
１、最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。
２、液体稀释法和滤纸片法的原理和方法。
教学难点：
１、最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的概念。
２、用液体稀释法测定MIC和MBC值的原理和方法。
３、滤纸片法的测定原理整和理p方pt 法。
2
第七章 药物体外抗菌试验 第一节 药物体外抗菌试验
一、稀释法
稀释法是在培养基中含有按几何级
两种药物产生的作用之间既可能产生相互影响，
也可能彼此间没有影响（无关）。产生影响时，
既可能是相互加强（协同作用），也可能是相互
减弱（拮抗作用）。在已经接种过细菌的平板上，
垂直放置两条浸有不同药液的滤纸条，经培养后
根据两种药液形成抑菌区的图形来判断这两种药
物对该细菌的作用是无关、拮抗还是协同（图7-
4）。
（2）试管法
此法适用于需长时间培养而用平板
又易于污染的试验菌，如霉菌有孢子易
分散污染环境，结核杆菌培养时间长
（需一个月），易造成污染，都不宜用
平板法，而使用本整法理pp。t
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二、琼脂扩散法
利用抗菌药物可以在琼脂培养基中扩 散并能在一定浓度范围内抑制细菌生长的 原理进行抗菌试验。
1．滤纸片法
常用于新药的初步筛选试验，用来初 步判断新药是否具有抗菌作用，也用于病 原性细菌的药物敏感试验，以测定临床分 离的某种细菌对各种药物的敏感强度，供 医生选用治疗药物时参考。
抑菌圈大小的解释和判断见 P113-114
整理ppt
9
2．挖沟法
常用于测试一种药物对几种细菌
的抗菌作用。这种方法是先制备普通
琼脂平板，然后在平板上挖直沟，在
沟内滴加药液。在沟两侧接种细菌
（图7-2）。经培养后观察细菌生长
项目七 药物体外抗菌实验技术
只适用于同类消毒剂的杀菌效力测定,对非酚 类、季铵盐及不稳定的次氯酸盐等均不能给 予正确评价.
三、联合抗菌试验
在药学中，常需要检查两种抗菌药物在联合应用时 的相互作用以及抗菌药物与不同PH值或不同离子溶液的 相互影响。
加强药物抗菌作用的为协同（synergism）；
减弱药物作用的为拮抗（antagonism）；
操作步骤
A 配置不同浓度的石碳酸稀释液、消毒剂稀释液
B
量取石碳酸和消毒剂稀释液于无菌试管中， 20℃恒温水浴
C 各管内依次加入伤寒杆菌或大肠杆菌培 养液0.5ml，管上标明5min处理、10min 处理字样，加入后准确计时。
D
到标定时间后取出一接种环的混合液接种于一 支5ml（或10ml）的肉汤培养基中，培养一定 时间后，观察并记录结果。+为有菌生长，-为 无菌生长。
原理：
药物可以在琼脂培养基中自由扩散，形成一定浓度的含药 区域。 由于各种微生物对不同药物或同一药物不同浓度的敏感性 不同，因而形成一定大小的抑菌圈或抑菌距离，根据其大小， 可以了解药物的抗菌作用大小或是微生物对试验药物的敏感性。
（1）滤纸片法（103页，3min）： 以倾注法制成含菌平板后，将滤纸片蘸取药液置于平板上，
表1 石炭酸系数测定
浓度 5 作用时间 10 + + 15 -
石炭酸
消毒剂
1:90 1:100 1:110 1:150 1:170 1:200 1:225 1:250 1:275
+ + + +
根据5分钟不能杀菌，10分钟能杀菌的最大稀释度为标准计算： 石炭酸系数=250/100=2.5
注意事项
1 2 3 4 有机物存在时消毒剂容易失去活性; 消毒剂可能影响微生物生长; 随温度变化而影响测定结果;
《药学微生物》3-5-2 实训 体外抗菌试验
纸条法
用于测定两种抗生素 的联合抗菌
（三）材料和用具
普通琼脂培养基、培养皿、滴 管、镊子、无菌滤纸片、金黄 色葡萄球菌培养液、大肠杆菌 培养液、0.1%新洁尔灭、0.9% 生理盐水等。
（四）操作步骤
1、滤纸片法测定几种抗生素的抑菌效果 以一定直径（6-8mm）的无菌滤纸片，
蘸取一定浓度的被检药液，将其紧贴在含 菌平板上，如果纸片上含有药液，便会沿 琼脂向四周扩散，且对该试验菌有抑制作 用，经一定时间培养后，就可在滤纸片周 围形成不长菌的透明圈。
验菌株；
◆ 加药、培养---将半流动药物或中药液用无菌
吸管或直接加入沟内，30-35℃培养箱中培养 24-48h后观察结果。
观察沟槽两侧各试验 菌株的生长情况，根 据沟槽和试验菌间的 抑菌距离大小，判断 该药对试验菌株的抗 菌能力，抑菌距离越 大，抗菌能力越强。
3、连续稀释法测定药物的最小抑菌浓度
（五）实训结果 （六）思考题 ﹡化学药物对微生物所形成的抑菌圈未长
菌部分是否说明微生物已经被杀死？如 何通过实验加以确定，请自行设计实验。 ﹡影响MIC测定的主要因素有哪些？抗生 素有哪几种联合抗菌效果？
实训 体外抗菌测 定技术
（一）实训目的
1、掌握体外抗菌技术的方法
2、掌握琼脂扩散法和联合抗菌 试验技术
（二）实训原理
琼脂扩散法是利用药物可以在琼脂培养基中扩 散，并在一定浓度范围内抑制细菌生长的原理。
测定方法
滤纸片法 挖沟法
ห้องสมุดไป่ตู้
最常用，适于新药的初筛
试验 、临床的药敏试验
用于测试一种药物对 几种细菌的抗菌作用
﹡试验菌株的培养--金黄色葡萄球菌 ；
﹡稀释--分别稀释成0.2U/ml、0.1U/ml、 0.05U/ml、0.025U/ml、0.0125U/ml 的青霉素溶液，每管为1ml；
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抗菌药物指药物本身为抗菌剂(如抗生素、磺胺药等)以及在药物制剂中含有部分抗菌 剂(如防腐剂)的药物。抗菌药物及含防腐剂的药物进行无菌检验时，与一般药物不同之 处在于进行无菌检验前，必须用某些方法使抗菌药物或防腐剂消除、失效，才能不影 响对被检药物是否无菌作出确认。
三、抗菌试验的影响因素
在抗菌试验中应有效控制其影响因素，才能确保试验的科学性和准确性， 主要的影响因素有： ①试验菌 ②培养基 ③供试药物 ④对照试验
.
第二节 灭菌制剂的无菌检查
❖ 无菌检查的基本原则
1. 严格进行无菌操作 2. 正确进行样品采集
3. 无菌检查用培养基
4. 需氧菌、厌氧菌培养基：硫乙醇酸盐培养基
3．酚系数测定
是用来测定消毒剂效力的一种指标，是以石炭酸为标准，在相同的实验条件下，将 消毒剂和石炭酸的杀菌力作比较，所得的杀菌效力的比值，石炭酸系数≥2为合格。
（三）联合抗菌试验法
同时应用两种抗菌药物时，两种药物之间既可能 产生相互影响，也可能彼此不影响；产生影响时，既 可能是相互加强(协同作用)，或两药作用出现累加现 象(即两药作用之和)也可能是相互减弱(拮抗作用)， 要确定两种药物之间的作用关系时，通常需用联合抗 菌试验法。 最简便、最常用的方法：纸条或纸片试验法。
• 厌氧菌阳性对照菌：生孢梭状芽胞杆菌 CMCC(B)64941
• 真菌阳性对照菌：白色念珠菌CMCC(F)98001或 曲霉菌ATCC16404
需要进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的 范围：
(药品、敷料按《中国药典》收载的无菌检查法的规定进行， 生物制品应按照《生物制品制造及检定规程》中有关规定进行)
二、控制菌的检查
1. 口服制剂中不能检出大肠杆菌 2. 脏器口服制剂不得检出沙门氏菌和大肠杆菌 3. 一般外用药和眼科制剂不得检出金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌 4. 用创伤、溃疡、止血、深部组织的药材药粉制剂不得检出破伤风杆菌。
活螨的检验
用于口服、创伤、粘膜和腔道的药品均不得检出活螨
◇直接观察法：用肉眼直接观察被检药物上有无白点移动，再
2．活菌计数法
在—定浓度的定量药物内，加入—定量的试验菌，作用—定时间后取样稀释，再取— 定量的此稀释液混入未凝固的琼脂培养基中，立即倾注成平板，培养后计算菌落数。 由于每个菌落是由—个菌细胞繁殖而来，则菌落数或菌落形成单位CFU)乘以稀释倍数， 再除以稀释液用量，即得该药物与试验菌的混合液中每毫升内存活的细菌数或CFU， 从而可算出该药物对细菌的致死率。
体外抑菌试验是最常用的抗菌试验，常用的方法主要有琼脂扩散法和系列稀释法。 １.连续稀释法 1)液体培养基连续稀释法 2)固体培养基连续稀释法: 平板法、斜面法 ２.琼脂扩散法 1）滤纸片法 2）挖沟法 3）管碟法 4）打孔法
(二)体外杀菌试验
用途：评价药物对微生物的致死活性
1．最小杀菌浓度的测定
是取MIC终点以上未长菌的各管培养液，分别取出并移种于无菌平板上，培养后凡平 板上无菌生长的药物最低浓度，即为该药物的MBC。对微生物广义而言，也可称之为 最小致死浓度 (MLC)。某药物能杀死微生物的最低浓度。
用放大镜或解剖镜观察。
◇漂浮法：将被检药物放入容器内，加饱和盐水至容器的２／
３处，搅匀，取液镜检，或继续加饱和食盐水至容器口，用载 玻片蘸取液面漂浮物镜检。
◇分离法：将药物放在特制分离器或附有筛网的漏斗内，离药
物６cm上放置６０～１００Ｗ的灯泡，照射１～２h.螨有避光 怕热的习性，便沿漏斗细颈向下爬，在漏斗下口处置一装有甘 油水的烧杯，收集爬出的螨，然后在显微镜下观察，根据其形 态特征、足肢游动情况判断是否为活螨。
（二）油剂的无菌检验
油剂药物与液体培养基不能混溶，故常漂浮于液体培养基表面而影响试验结果。因 此，此类药物做无菌检验时，应在培养基内加入表面活性剂(吐温—80)，使药物均匀分 布于培养基中，以利于细菌的生长和检出。有的药物如青霉素油剂等，由于粘稠度过 大，可先用灭菌植物油或灭菌液体石蜡进行一定倍数的稀释，然后取样接种到含吐 温—80的培养基中，充分摇匀使药物均匀分散在培养基中。
可吸收的止血剂：如凝血酶等用于止血并可被组织吸收的各种 药物制剂。
无菌检查法
（一）非抗菌剂、无防腐剂、及非油剂药物的无菌检验
一般药品的无菌检验，通常应用直接接种法。若被检品是液体，可直接接种于培养基内。 若被检品是固体粉末或冻干制剂，则需用无菌生理盐水溶解，或制成均匀悬液再作检验。若被 检品是无菌敷料，则以无菌操作打开包装，于各部位剪取1cmX3cm大小的样品，再接种到培 养基中。
1、灭活法 ２、薄膜过滤法 ３、离子交换树脂法 4、稀释法
第三节 微生物的限度检查
微生物限度检查项目内容：
❖ 微生物限度检查的基本原则 ❖ 染菌量的检查 ✓ 细菌数 ✓ 霉菌数 ❖ 控制菌的检查 ✓ 大肠埃希氏杆菌(大肠杆菌) ✓ 金黄色葡萄球菌 ✓ 沙门氏菌 ✓ 铜绿假单胞菌(绿脓杆菌) ✓ 破伤风杆菌 ❖ 活螨的检验
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二、药物的体内抗菌试验
体外抗菌试验有效的药物，还需要经过体内抗菌试验证明有 效后，才能推荐应用于临床。
体内抗菌试验即动物的实验治疗或保护力试验。动物实验治疗的方法，大 致是先用致病菌使动物体表或体内感染，造成感染动物模型，然后按不同剂 量、不同给药方法(如腹腔注射、皮下注射、肌肉注射或口服等)以及间隔不同 时间进行实验治疗。实验时还要设立一组动物用生理盐水代替药物进行对照 治疗。然后根据实验组与对照组的动物死亡数或内脏的含菌数，评价药物的 作用和效力。
项目7 药物体外抗菌试验技术
▪ 模块1 必备知识——药物的体外抗菌试验
主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性，又称药敏试验。 体外抗菌试验包括抑菌和杀菌两个方面。
（一）体外抑菌试验
最小抑菌浓度(MIC) ：MIC是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度。通常用表示。其值越小，说明抑菌作用愈强。
一、染菌量的检查
1. 目的
▪ 细菌数测定我们是为了考察每克或每毫升供试品所污染的活细菌数，来判明供试品 被细菌污染的程度。
▪ 霉菌的测定是考察每克或每毫升供试品所污染的活的霉菌数，以此来判明供试品被 真菌污染的程度。
2. 测定的方法
➢ 细菌总数的测定 营养琼脂平板培养基 +0.001%三苯四唑氯化物（TTC） ➢ 霉菌总数的测定 玫瑰红钠（马丁）培养基
各种注射剂：用于肌肉、皮下和静脉的各种针剂，包括注射用 的无菌水、输 液、注射剂 原液等。
眼用及外伤用制剂：用于眼科手术、角膜创伤及一般创伤、溃 疡和烧伤等外科用药制剂。
外科用的敷料、器材：如外 科手术用的脱脂棉、纱布、缝合线 及一次性注射器与一次性无菌手术刀片、输血袋等。
植入剂：用于包埋于人体内的药物制剂，如不溶于水的激素、 免疫药物及抗肿瘤药物等无菌的制剂。
5. 真菌培养基 6. 选择性培养基
7. 阴性对照及阳性对照
8. 阴性对照
阴性对照应不长细菌，说明培养基本身 是无菌可靠的；阳性对照试验必须长菌， 说明应用的细菌是可以在该试验条件下 正常生长的。
9. 阳性对照
10. 抑菌试验 11. 无菌检查法 12. 无菌检验结果判断
• 需氧菌阳性对照菌：金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003或藤黄八叠球菌CMCC(B)28001