第二十篇-药物的体外抗菌试验

图 20-1液体培养基连续稀释法
2、固体培养基连续稀释法
分平板法和斜面法。 1） 平板法可同时测定大批实验菌株的MIC， 且不受药物颜色及混浊度的影响，适于中药 制剂或评价新药的药效学（药物的体外抗菌 活性测定）实验。 将系列浓度的药物混入琼脂培养基，使制成一 批药物浓度呈系列递减的平板。然后将含有 一定细胞数的实验菌液（通常为104左右）以点 接种法接种于平板上，可以逐个点种，也可 采用多点接种器接种；同时设无药空白平板 对照。培养后观察结果。
FIC指数小于1，两药有协同作用，即两药联合较 单独实验的抑菌作用为强。 FIC指数的值愈小， 则联合抗菌作用愈强。如20-2 如20-2 FIC指数与联合抗菌效应 FIC指数 联合抗菌效应 小于0.75 协同 1 累加 1-2 无关 大于2 拮抗
第四节 体外抗菌试验的影响因素
1、试验菌 一般应用标准菌株。标准菌株来 自专门的供应机构。我国由北京卫生部生物制 品检定所菌种保藏中心供应。在特定条件下， 有时需用临床新分离菌株。试验菌加以合理的 保藏，使用前应加以纯化及必要的生物学特征 鉴定。 2、培养基 原料、成品的外观及性能应符合要 求。
另外,石炭酸系数法还有以下缺点: 1)有机物存在时消毒剂失去活性; 2)消毒剂可能对组织有毒性; 3)随温度变化而影响测定结果; 4)只适用于同类消毒剂的杀菌效力测定,对非酚 类、季铵盐及不稳定的次氯酸盐等均不能给 予正确评价.
第三节 联合抗菌试验
在药学中，常需要检查两种抗菌药物在联合应用 时的相互作用以及抗菌药物与不同PH值或不同 离子溶液的相互影响。 加强药物抗菌作用的为协同（synergism）； 减弱药物作用的为拮抗（antagonism）； 互相无影响的为无关（indifference）； 作用二者之和为累加（addition）。
抑菌：即抑制微生物的生长繁殖，但不能杀死微 生物，在药物除去后微生物又能生长； 杀菌：即能杀死微生物，当药物除去后，微生物 也不能再生长繁殖。 两者并非绝对，只是在一定条件下相对而言。
第一节
常用的体外抑菌实验
体外抑菌实验是最常用的抗菌实验，方法简便， 需时短，用药量少，不需要动物和特殊设备， 一般在玻璃器皿中进行。 常用的方法有连续稀释法和琼脂扩散法。
三、石炭酸系数测定法（phenol coefficient）
又称酚系数法，是以石炭酸为标准，在规定的 实验条件下，作用一定时间，将待测的化学消 毒剂与石炭酸对伤寒沙门菌或金黄色葡萄球菌 的杀菌效力相比较，所得杀菌效力的比值。石 炭酸系数是了解消毒剂杀菌效力的一种方法。 石炭酸系数 =消毒剂的杀菌稀释度/石炭酸的杀 菌稀释度 石炭酸系数 大于或等于2为合格。
2）斜面法
是固体培养基上连续稀释法的一种，是将系列 浓度的各药分别混入固体培养基中制成斜面， 在斜面上接种一定量的实验菌，然后观察是否 有菌生长，判断MIC值。
二、琼脂扩散法（agar diffusion test ）
是利用药物可以在琼脂培养基中扩散， 在药物有效浓度的范围内形成抑菌圈或抑 菌距离，以抑菌圈直径或抑菌距离的大小 来评价药物抗菌作用强弱的原理设计而成， 具有各种不同的方法。 常用的有以下几种：
WHO于1981年曾推荐Kirby-Bauer 法（k-B法）作 为标准化的药敏实验。 k-B法基本原理是滤纸片 法，但需用统一的培养基、菌液浓度、纸片质量、 纸片含药量以及其他实验条件。结果判断以卡尺 精确量取，根据抑菌圈的直径大小判断该菌对药 物是抗药、中等敏感或敏感。
2、打孔法
2、打孔法 在含琼脂平板上打孔，孔内加入药液， 经培养后可产生一定大小的抑菌圈。适于药物血 浓度的监测，血清用量少，敏感性高，操作简便。
联合抗菌试验的常用方法
一、纸条试验（paper strip test）
即在已接种实验菌的平板表面垂直放置两条浸 有一种药液的滤纸条，培养后根据抑菌区的加 强、减弱或无影响来判断它们在联合应用时的 效应。 图20-2是纸条实验的示意图。
图20-2是纸条实验的示意图。图中A列的两纸条 中只有一条含有抗菌药物，另一条不含抗菌药物； B列的两纸条均含有抗菌药物。
MBC（或MLC）的含义也可定义为在一定条 件下，使绝大多数微生物被杀死，但允许有最少 量微生物存活的药物最低浓度。 据此进行实验时，在药物连续稀释后，每管内 加入定量实验活菌液（105-106细菌/ml）。培养 后从肉眼观察无菌生长的试管内各取培养液 0.1ml或0.01ml涂布于平板上测定存活菌数，以 使99.9%微生物致死的药物最低浓度为MLC， 即在一定条件下，存活的菌数不多于原始接种 数的0.1%.
表20-1石炭酸系数测定
浓度 石炭酸 1:90 1:0 1:10 1:150 1:170 1:200 1:225 1:250 1:275 作用时间 5 10 + + + + + +
消毒剂
15 -
根据5分钟不能杀菌，10分钟能杀菌的最大稀释 度为标准来计算，则石炭酸系数=250/100=2.5
或根据三个相同杀菌结果的稀释度比值的平均值 来计算,则: 石炭酸系数 =(225/90+250/100+275/110)/3=2.5 石炭酸系数愈大,则被测消毒剂的效力愈高.但石 炭酸系数的应用有一定局限性,因为某一消毒剂 对伤寒沙门菌的石炭酸系数的大小并不能完全 代表它对其他细菌作用的强弱.
图 20-3 纸条梯度平板试验
三、棋盘格法（check board test）
是由于在试验时,含两种不同浓度药物的试管排 列呈棋盘状而得名,用以评价两种药物同时用不 同浓度进行联合试验时的抗菌活性。实验时排 列6排试管，每排6管，共36管使成方块，A及 B药各以液体培养基进行稀释，A药各稀释度 纵行定量加入各管，B药各稀释定量按横排加 入，两药同时作单独抗菌实验对照。然后加入 定量菌液，经培养后观察结果。
举例：将石炭酸准确稀释为1：90、1： 100，、、等；待测消毒剂准确稀释1：150、1： 170、、、。 分别取上述稀释液各5ml（10ml）加入一系列 无菌试管中，置于20℃恒温水浴，使反应保持 在20℃以下进行。各管内再加入伤寒沙门菌培 养液各0.5ml,立即开始准确计时,在加菌后5、10、 15分钟，分别从管中取一接种环的混合液接种 于一支5ml（或10ml）的肉汤培养基中，培养 一定时间后，观察并记录结果。+为有菌生长， -为无菌生长。
3、抗菌药物 药物的浓度和总量直接影响抗菌试 验的结果，需要精确配制 。固体药物应配制成溶 液使用，有些不溶于水的药物需用少量有机溶剂 或碱先行溶解，再稀释成合适浓度，如氯霉素及 红霉素需用少量乙醇溶解。药液的PH值应尽量接 近中性，使能保持药物的稳定性而又不致影响试 验菌的生长。 中药制剂中含有鞣酸，且具有特殊色泽，影响 结果判断。
第二十章 药物的体外抗菌试验
药物的体外抗菌试验（antimicrobial test in vitro） 是在体外测定微生物对药物敏感程度的实验， 已广泛地应用于科研、生产和临床。 如：抗菌 药物的筛选、提取过程中的追踪、抗菌谱的测 定、药物含量的测定、药物浓度的测定、指导 临备琼脂平板，在平板上挖沟，
沟的两边垂直划线接种各种实验菌，再在沟内 加入药液。培养后根据沟两边所生长的实验菌 离沟的抑菌距离来判断对这些菌的抗菌效力。 适用于在一个平板上实验一种药物对几种实验 菌的抗菌作用。H:\其他--中药妇炎乐药敏实验 结果
第二节 杀菌试验
一、最低杀菌浓度或最低致死浓度的测定 杀菌实验用以评价药物对微生物的致死活性。 最低杀菌浓度指该药物能杀死细菌的最低浓度。 从对微生物广义而言，也可称之为最低致死浓度 （MLC）。一般是将待检药物先以合适的液体 培养基在试管内进行连续稀释，每管内再加入 一定量的试验菌液，培养后可得该药物的MIC， 取MIC终点以上未长菌的各管培养液，分别移 种于另一无菌平板上图20-1，培养后凡平板上 无菌生长的药物最低浓度即为该药物的MBC （或MLC）
二、梯度平板纸条试验 （paper strip-gradient plate test） 需先制备含药的梯度平板。梯度平板的制备是 先将琼脂培养基倒入平皿，平皿斜置待凝，再 将平板放置水平，加入含抗菌药物的琼脂培养 基。在重叠的双层平板中含有梯度浓度的抗菌 药物，自高浓度（+）至低浓度（-）依次递减。 要求其抑菌浓度的位置约处于平板的一半。将 实验菌悬液涂布于平板表面，取滤纸条浸透另 一待检药液，按梯度平板中药物浓度递减的方 向置于平板表面。培养后，如待检药液对平板 的药物有加强作用，则可见纸条两端的抑菌区 被扩大。
4、对照实验
1）试验菌对照：在无药情况下，应能在培养
基内正常生长。 2）已知药物对照：已知的抗菌药物对标准的敏 感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药 菌应不出现抗菌效应。 3）溶剂及稀释液对照：抗菌药物配制时所用 的溶剂及稀释液应无抗菌作用。
一、连续稀释法（serial dilution test））
可用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最 低杀菌浓度（MBC）。可以用液体培养基，也 可用固体培养基。 1、液体培养基连续稀释法 在一系列试管中，将液体培养基按一定的倍数 稀释药物，获得药物浓度递减的系列试管，然 后在每一管中加入定量实验菌，经培养一定时 间后，肉眼观察试管混浊情况，记录抑制实验 菌生长的最低浓度（即MIC）。
棋盘格法的结果用部分抑菌浓度（FIC）及FIC指 数来评价。
FIC：又称联合抑菌分数，指某一药在联合前后 所测得的MIC比值。如二待测药为A、B，则 FIC（A）=A 药与 B药联合试验时A药的 MIC A 药单独试验时的MIC FIC（B）=B药与 A药联合试验时B药的 MIC B药单独试验时的MIC 所谓FIC指数，指二药各自的FIC之和，即 FIC指数= FIC（A）+ FIC（B）
二、活菌计数法（viable counting method） 是在一定浓度的定量药物内加入定量的实验菌， 作用一定时间后，取样进行活菌计数，从存活 的微生物数计算出药物对微生物的致死率。 活菌计数的方法：一般是取实验菌与药物作用 后的混合液，经稀释后取定量混入琼脂培养基， 倾注成平板。培养后计数长出的菌落数或菌落 形成单位（CFU）。再乘以稀释倍数，即可得 药物稀释后每毫升内存活的细菌数或CFU。如 果药物作用后，存活菌数很少，也可采用微孔 滤膜过滤法测定。