【教学课件】第5章分子生物学研究法(上)

分子生物学第五章分子生物学研究法(上)

分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学夏玉琼西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学夏玉琼西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学夏玉琼西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学夏玉琼西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学夏玉琼西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学夏玉琼西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学夏玉琼西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学夏玉琼西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学夏玉琼西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学夏玉琼西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。

本科生分子生物学课件：第五章分子生物学研究方法(上)

Escherichia coli RY13
属种株序大肠埃希菌RY13株中发现的第一种限制新核酸内切酶
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。
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常用限制性内切酶
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一般克隆基因的检查和鉴定方法
酶切、电泳方法
➢ 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：
磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动
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重组DNA技术操作的主要步骤
载体
目的基因（外源基因）
质粒噬菌体病毒基因组DNA
载体DNA
限制酶消化
cDNA 人工合成 PCR产物
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▪ 所谓柯斯质粒，乃是一类由人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
柯斯质粒载体pHC79，就是由λDNA片段和 pBR322质粒DNA联合组成的。
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M13噬菌体 M13噬菌体（M13 phage）是一种大肠杆菌雄性特异丝
状噬菌体，全长约6.5kb。M13感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。
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质粒克隆载体
质粒—染色体外能自主复制的共价双链闭合环状DNA分子，广泛存在于原核细胞内。
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根据质粒载体的用途进行分类
▪ 克隆载体(cloning vector)指使插入的外源DNA序列被扩增为目的，并不需要得到目的基因所编码蛋白质的载体。
▪ 表达载体(expression vector)能使外源目的基因在宿主细胞中转录和表达的功能性载体

5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术

DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产率。所以再留出5分钟，以使正在复制中的DNA能够复制完全，以合成更多的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min

分子生物学-研究方法(上)PPT课件精选全文完整版

合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对原则，合成一条新的与模板DNA互补的链。
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1个PCR循环产生2条双链分子
一般每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
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PCR的基本原理
模板DNA
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PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
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基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶， 1967年Gellert发现了 DNA 连接酶。
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酶类
重组DNA实验中常见的主要工具酶
功能
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
末端转移酶
在双链核酸的3ˊ末端加上多聚单核苷酸
DNA外切酶III
从DNA链的3ˊ末端逐个切除单核苷酸
λ噬菌体DNA外切酶
从DNA链的5ˊ末端逐个切除单核苷酸
碱性磷酸酯酶
切除位于DNA链5ˊ或3ˊ末端的磷酸基团
科学家已几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分. 子量大小逐一分开，以供下一步研7究。
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（3）PCR的应用
• 反向PCR：扩增已知序列旁侧的未知DNA序列
• 锚定PCR: 用于测定基因结构
• 不对称PCR: 用于扩增某一单链模板
• RT-PCR(逆转录-PCR): 逆转录联合PCR以扩增cDNA
• 复合PCR: 用多对引物同时扩增几条DNA片段
• 易错PCR：引入错配碱基，导致随机突变

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核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN公司提供的超纯质粒抽提试剂盒使您不必为DNA质量操心。随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。
原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行
使细胞中靶基因编码的蛋
白合成量也大为减少
反义技术的应用：
① 基因功能的研究 ② 病毒基因组功能的研究 ③ 作为药物 ④ 抗肿瘤作用
的一种方法。
不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。 ② 退火：降低温度至56℃使引物与模板DNA单链结合
或与目的基因互补配对的
但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。
影响转染效率的主要因素有：可用于DNA、RNA定位研究。
反义基因，通过它们的杂
荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH） ③ 用于药物筛选的动物模型
第五节细胞Βιβλιοθήκη 子生物学研究方法一、原位分子杂交技术
DNA变性: 当溶液中的DNA分子处于高温或高pH值(13)条件下,
维持双螺旋在一起的碱基互补对就被破坏,DNA双链解离成两条单链,这一过程叫DNA变性。
DNA复性: 当温度降低至合适温度或恢复pH值至中性，两条裂
解的单链按碱基互补配对原则重新形成双链结构,这一过程叫DNA复性,又叫DNA杂交。
常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH 新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

分子生物学研究法上

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5.2 DNA基本操作技术
5.2.1 核酸凝胶电泳
➢ 自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。
➢ 核酸凝胶电泳是现在通用的分子生物学研究方法。是DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础。
➢ 纯化 mRNA 在 70% 乙醇中 -
70℃可保存一年以上。
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5.3.3 cDNA的合成
➢ cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。 ➢ 第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为cDNA，
由反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引物是寡聚(dT)。 ➢ 寡聚(dT)引物一般含12~20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后
变性、退火
延伸
PCR扩增原理
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5.2.4 实时定量PCR
➢ 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法称为实时定量PCR。
➢ 常规PCR技术无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
➢ 实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
电泳操作基本程序
称样
溶解
加热
制板
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倒胶
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取样
点样
电泳