灭菌是指用物理或化学的方法

灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。

消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、物品上还有活着的微生物。

而通过严格灭菌的操作空间（接种室、超净台、等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行操作，就叫做无菌操作。

常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类。

物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。

化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。

2. 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌

在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。

3.玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌

干热灭菌是利用烘箱加热到160～180℃的温度来杀死微生物。通常采用170 ℃持续90分钟来灭菌。

4. 不耐热的物质采用过滤灭菌

一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法-防细菌滤膜。

5.空间采用紫外线和熏蒸灭菌

（1）紫外线灭菌

在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌。

细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200～300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，且要求距照射物以不超过1.2米为宜。

（2）熏蒸灭菌

用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。升汞与高锰酸钾，常用熏蒸剂是甲醛。

物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手表面、植物材料表面等。可用70％的酒精反复涂擦灭菌，１％～２％的来苏儿溶液以及0.25～１％的新洁尔灭也可以。

7. 植物材料表面用消毒剂灭菌

外植体的选择:

外植体部位：不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件的反应不一样；

取材季节：大多数植物应该在生长开始的时候采集；

器官的生理状态和发育年龄：幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力；

外植体大小：茎尖培养中，外植体越小成活率越低。

外植体的灭菌方法:

植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体。

首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗，硬的材料用刮刀刮。

第二步是对材料的表面浸润灭菌。

第三步是用灭菌剂处理。

最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3分钟左右，视采用的消毒液种类，涮洗3～10次左右。

接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。

接种前后的程序：

A：接种室消毒：用酒精擦拭台面，接种工具摆放好后用紫外灯照射表面灭菌15-20分钟，然后通风20分钟；

B：手要洗净，用75%酒精擦手，在操作过程中要经常用酒精擦手；

C：将初步洗涤及切割的材料放入烧杯（烧杯用75%酒精擦杯壁），带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗．最后沥去水分，取出放置在灭过菌的４层纱布上

或滤纸上。

D：材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。

E：用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。

培养：指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件）里，使之生长，分裂、分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。

一）培养方法

1．固体培养法

即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。该法设备简单，易行。但养分分布不均，生长速度不均衡。并常有褐化中毒现象发生。

2．液体培养法

即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇

床进行培养，其速度一般为50～100转／分，这种定期浸没的方法，既能使培养基

均一，又能保证氧气的供给。

静止培养：滤纸桥培养

振荡培养：磁力搅拌器、摇床、自旋式培养架

1．初代培养：即接种某种外植体后，最初的几代培养。初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。

继代培养：在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等,数量都还不多，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。