细菌内毒素检查方法
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题
凝胶
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名词解释1—鲎及鲎试剂
鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物 门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一 带。
鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机 械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物， 能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应 的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体 外检测内毒素的敏感试剂。
5.吸附性
能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有 一定的电荷，因而可被某些离子交换介质吸附。
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7
❖热原=内毒素 ？
热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物 等使人体发热的物质，不仅仅是细菌内毒素。
但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热 原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒
素就是控制热原。
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凝胶法：
内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；
故：灭菌注射用水≠细菌内毒素检查用水
光度法：
内毒素含量应小于0.005EU/ml；
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细菌内毒素检测之凝胶法
❖ 实验程序 1、试验准备：试剂、仪器及用具 2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度 3、鲎试剂灵敏度复核 4、供试品干扰试验（新药或新方法） 5、供试品细菌内毒素凝胶法检测
浅析细菌内毒素检测方法及常见 问题
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1
内容 ❖细菌内毒素简介
❖细菌内毒素检测方法
❖常见问题及解决方案
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2
一、细 菌 内 毒 素 简 介
❖ 主要内容
—— 来源 —— 特性 —— 与热源的关系 —— 在药检中应用
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3
❖ 主要来源
主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自 溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖， 这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径约 在1~ 5纳米 。
细菌内毒素检查SOP(动态浊度法)
细菌内毒素检查SOP（动态浊度法）1．目的为规范细菌内毒素含量测定的操作，特制定本SOP。
2．范围本SOP适用于细菌内毒素含量测定的操作。
3．定义3.1.动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
3.2.细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
3.3.细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
3.4.细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015 EU/ml（用于凝胶法）或0.005 EU/ml （用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
4．职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行。
4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核。
4.3.质量负责人/质量受权人负责本规程的批准。
4.4.QA负责本规程执行的监督。
5．引用标准《中华人民共和国药典》2020年版三部。
6．材料6.1.仪器设备细菌内毒素测定仪、漩涡混合器、干烤箱6.2.试剂及溶液6.2.1.鲎试剂6.2.2.细菌内毒素工作标准品：国家标准品或经过国家标准品标定的工作标准品。
6.2.3.细菌内毒素检查用水：内毒素含量应小于0.005EU/ml。
6.3.使用的器具移液器、无热原稀释管和反应管、无热原枪头。
7．流程图无8．程序8.1.原理细菌内毒素能激活鲎试剂(TAL)中的酶系统，使凝固酶原变成凝固酶，进而凝固酶再激活其中的凝固蛋白原变成凝固蛋白，呈现凝胶反应，动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，计算内毒素浓度与反应时间关系的双对数标准曲线，利用标准曲线对供试品的内毒素含量进行定量测定。
8.2.试验前准备8.2.1.采样管用硅胶塞塞口，经180℃干烤2小时，除内毒素备用。
细菌内毒素测定技术—细菌内毒素检查方法
知识点：光度测定法
四、结果判断 若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释
倍数后小于规定的内毒素限值，判定供试品符合规定；若 大于或等于规定的内毒素限值，判定供试品不符合规定。
注：本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容 器，如微孔板中的孔。
技能点：凝胶限度试验操作规程
检验供试品中的内毒素含量是否小于限值的定性方法，按下表制 备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供 试品溶液来制备溶液A 和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
3、如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内 毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
4、若内毒素浓度小于规定的限值，判定供试品符合规 定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判定供试品不 符合规定。
知识点：光度测定法
一、方法
光度测定法分为浊度法和显色基质法。 浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度 变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终 点浊度法和动态浊度法。 显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产 生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素 含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色 法。
试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品 符合规定；否则判定供试品不符合规定。
技能点：凝胶限度试验操作规程
4、阳性对照结果出现阴性，可能是由于内毒素工作品效价标 示不准确或效价衰退或失败；稀释内毒素没有使用旋涡混合器或 稀释操作不当；鲎试剂效价标示不准确或效价衰退或失效；反应 试管放入水浴保温前试管中内容物没有摇匀造成。阴性对照出现 阳性结果可能是由于鲎试剂或者水污染，试验器具污染，试验过 程操作不当污染造成。
A：没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品系列稀释液。 B：供试品阳性对照。（为确证不存在干扰作用） C：标准内毒素系列。（为确证本次试验的操作和环境都符合要求。）D：阴性对照。
中华人民共和国国家标准细菌内毒素检测方法
医用输液、输血、注射器具细菌内毒素检验方法中华人民共和国国家标准 GB/T14233.2—93 1993-03-16发布一、定义及适用范围:本法系列用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。
用以代替家兔法对供试品进行热原初试。
本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。
其他产品可参照使用。
二、主要设备:超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。
三、试剂 1、细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。
2、细菌内毒素工作标准品：用于标定鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。
3、鲎试剂：灵敏度为0.25EU/ml，规格为0.5ml。
4、无热原水：内毒素含量小于0.05EU/ml。
四、试验前准备1、器具除热原:与试验液接触的所有器具均应除热原。
玻璃器具置电热干燥箱内250℃干烤至少60min；塑料器具置30%双氧水中浸泡4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。
2、鲎试剂灵敏度测定（1）试验前应核对使用批号鲎试剂的灵敏度，应符合规定。
（2）灵敏度测定：根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作标准品用无热原水以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液。
取同一批号鲎试剂若干支，分别按标示量加入无热原水溶解为鲎试剂溶解液。
取10mm×75mm试管若干支，分别加入0.1ml鲎试剂溶解液，加入内毒素稀释液0.1ml，每一稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混匀内容物，封闭管口，置37±1℃恒温水浴中保温60±2min观察结果。
最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应为阴性。
五、试验方法1、供试品数量 :同一批号至少3个单位供试品。
2、浸提介质:无热原水。
3、供试液制备:在无菌条件下，每套输液器内腔注入10ml，输血器内腔注入15ml浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37±1℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无热原具塞玻璃容器内。
药典三部版通则细菌内毒素检查法
药典三部版通则细菌内毒素检查法标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
中国药典细菌内毒素检测方法
检测细菌内毒素的方法
1、热原检查
通常以家兔作为试验介质，检查在规定时间里观察家兔的体温变化，反应了热原物质引起哺乳类动物的体温反应过程。
2、凝胶法
通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。
3、光度法
浊度法
利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。
显色基质法
利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。
中国药典 细菌内毒素检验方法
中国药典细菌内毒素检验方法
中国药典细菌内毒素检验方法中，按以下步骤进行实验。
首先，制备试样溶液。
将待测样品溶解在合适的溶剂中，并通过过滤将溶液过滤至少两次以去除杂质。
然后，制备标准溶液。
将内毒素标准品按照指定浓度配制成溶液。
接下来，准备试管。
将标准溶液和试样溶液分别装入两个试管中，并加入适量的无菌生理盐水作为空白对照。
然后，进行混合。
轻轻旋转试管混合样品，确保溶液均匀混合。
接着，培养细菌。
将特定的细菌株接种在培养基中，分别加入试管中的样品溶液，并在适当条件下进行培养。
培养结束后，观察结果。
通过观察培养基的变化，比较试管中的样品溶液和空白对照的差异，判断样品中是否存在细菌内毒素。
最后，记录结果。
根据观察结果，记录样品的检验结果，并进行数据分析。
细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法1 简述1.1 本规范适用于细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。
后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
1.2 供试品细菌内毒素限值的确定1.2.1 药典中有规定的，按供试品各论中规定限值；1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L=K／M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U表示。
K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(k g•h)表示。
其中注射剂，K=5EU／(k g•h)；放射性药品注射剂，K=2．5EU ／(k g•h)；鞘内用注射剂，K=0.2EU／(k g•h)。
M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以m1／(k g•h)、mg／(k g•h)、U／(k g•h)表示。
药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于l小时的按l小时计。
若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积计量乘以0.027即可转换为每千克体重计量［即M=(最大给药剂量/(m2·h)×1.62m2)/60kg］。
1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算：MVD＝CL/λL为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。
当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L的单位以EU／mg或EU／U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／m1或U／m1。
作业指导书指导书编号TYFDC-SOP-FF-073细菌内毒素检查法第2页共18页第二版批准李忠华初审吴雅凝起草吴雅凝λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。
如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C：λ／L。
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题解读
3、实验条件达不到要求 实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室， 应备有一台超净工作台。
4、温度不符合要求 实验室温度为25±2℃较好，恒温水浴箱温度为 37±1℃为宜。
5、忽视样品本身干扰
供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采 用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要 原则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。
《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进 行检查。
将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在 规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供 试品中所含热原的限度是否符合规定。
热原检查法
❖ 与热源对比内毒素检查法优势
❖ 方便、快捷、经济； ❖ 重现性好、灵敏度高； ❖ 避免抗原的产生，克服生物测定的误差；
- / 0.125 -0.903
λc＝lg-1(∑X/4) ＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（ -1.22 ）＋（ -1.22 ）］/4｝ ＝0.104（EU/ml）
λc在0. 5λ～2.0λ范围内，符合规定。
❖ 方法学验证—供试品干扰预试验 目的：
确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强）， 得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍 数，为正式干扰实验提供依据。
内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。
故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
❖ 主要特性（实验器材处理方法）
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。
故：不可用湿热灭菌法处理实验器具
❖ 主要特性（去除内毒素方法）
4.滤过性
原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除 菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不 能通过半透膜。
EU/ml EU/ml
细菌内毒素检测方法
（85）细菌内毒素检查法✹本章内容已与《欧洲药典》和/或《日本药局方》相应的内容统一，不一致的部分用符号（✹✹）标记。
✹细菌内毒素检查法（BET）系利用鲎试剂（美洲鲎或中国益）检测或量化革兰阴性菌产生的细菌内毒素。
可采用三种技术进行细菌内毒素检查：基于凝胶形成的凝胶法；基于内源性底物裂解后浊度变化的比浊法；基于合成胁显色基质复合物裂解后发生颜色变化的显色法。
可采用上述任意一种方法进行检测。
当对测定结果有怀疑或争议时，除另有规定外，以凝胶法测定结果为准。
本法操作过程中应防止内毒素的污染。
器具应按照经过验证的程序将所有玻璃器皿和其他热稳定材料置于干热烤箱中去除热原。
✹①✹通常使用的最低温度和最短时间为250℃加热30分钟。
如果使用多孔板和微量加样器吸头等塑料器具时，只有证明其不含有可检出的内毒素并对试验无干扰方可使用。
（注：本章中的“管”包括微孔板中的孔等所有反应容器。
）试剂和试液试剂是由鲎（美洲鲎或中国鲎）的阿米巴细胞（白细胞）溶解产物制得的冻干品。
这种试剂必须是按照权威机构认定的规程生产的产品。
（注：除内毒素外，鲎试剂也与P葡聚糖反应。
通过消除G因子或抑制G因子反应系统，能够制得不与葡聚糖反应的鲎试剂，此种鲎试剂可用于葡聚糖存在情况下的内毒素检查。
）内毒素检查（BET）用水在检测限内不与鲎试剂产生凝集反应的注射用水或用其他方法制备的水。
鲎测试液将鲎试剂溶解于内毒素检查用水或鲎试剂生产企业推荐的缓冲液中，轻轻混匀。
复溶的鲎试剂须按照生产企业的规定冷藏或冷冻保存。
溶液的制备内毒素标准品贮备液使用经现行WHO国际内毒素标准品标定过的美国药典内毒素标准品配制内毒素标准品贮备液。
按照包装说明书和标签上的规定制备、贮存贮备液。
内毒素的单位用EU表示。
[注：1个美国药典内毒素单位（EU）等于1个国际内毒素单位（IU）]内毒素标准品溶液将内毒素标准品贮备液充分混匀后，用内毒素检查用水进行连续稀释。
为避免因内毒素的吸附而导致失活，配制后的稀释液应尽快使用。
药典三部(2015版)-通则-细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
光度法细菌内毒素检查实验方法
光度法细菌内毒素检查实验方法
光度法细菌内毒素检查实验方法主要包括以下步骤:
1.准备试剂和样品:准备所需的宣试剂、内毒素标准品、样品等。
2.加样:按照实验要求，将室试剂、内毒索标准品和样品加入反应管中。
3.孵育:将反应管放入恒温箱中，在适宜的温度下进行孵育。
4.检测:在孵育结束后，使用光度计检测反应管中的吸光度或透光率。
5.结果分析:根据检测结果，计算样品中的内毒素含量，并与标准品进行比较，判断样品是否合格。
需要注意的是。
光度法细菌内毒索检查实验方法的具体操作步骤可能因不同的实验条件和仪器而有所差异。
因此，在进行实验前，应仔细阅读实验说明书，了解实验原理和操作步骤，并严格按照实验要求进行操作。
同时，为了保证实验结果的准确性和可靠性，还应进行必要的实验质星控制和验证。
内毒素检测方法
内毒素检测方法一、内毒素的检测方法常用的检测内毒素的方法有以下几种：1.凝胶法：通过鲎试剂（鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等）与内毒素发生凝集反应产生凝固蛋白（凝胶）的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。
凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。
此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。
2.动态浊度法；浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。
内毒素与鲎试剂中的凝固酶原激活呈凝固酶，凝固酶可使凝固蛋白原变成凝固蛋白（即产生凝胶），使液体的浊度发生变化，通过动态观察浊度变化速率检测。
3.终点显色法:通过由于细菌内毒素激活鲎试剂（鲎试剂中含有C 因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等）C因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质（含N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺盐酸盐），使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm）。
同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。
根据产物颜色判断内毒素浓度，又称为比色法。
4.动态显色法:内毒素可激活鲎试剂引起一系列酶促反应，产生黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm），在一定时间内，动态观察对硝基苯胺（pNA）的生成量，与细菌内毒素浓度成正相关。
但此方法需要带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件。
5.其他检测方法：还有一些直接测定内毒素定量的方法如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫学方法（如火箭免疫电泳试验法、L-聚赖氨酸法、双抗体夹心法、荧光偏振法等）等，这些方法的特点是特异性、准确性高，但其应用尚待大量临床实践的验证，操作尚待进一步简化；还有一些间接测定的方法，如生物学方法利用LPS刺激免疫细胞产生IL-1、TNF，通过间接测定IL-1、TNF等细胞因子含量，推算出待检样本中的LPS含量；化学发光法：应用CR1和CR3受体诱导中性粒细胞的氧化反应作为一个反应平台，通过测定内毒素对中性粒细胞的生物学作用来检测内毒素的含量；流式细胞术：应用针对内毒素表面抗原决定簇的单克隆抗体对内毒素进行荧光标定而后应用流式细胞仪进行检测。
细菌内毒素检测方法
细菌内毒素检测方法（译自英国药典BP2004版，等同欧洲药典EP5版。
见原文之附录XIV A 方法2.6.14.）本文所描述的五种方法用于检测产品中是否存在细菌内毒素，而这些方法适用于药典中的细菌内毒素的检查法--限度试验.方法的制定者希望弄清楚，如在生产中能否降低其产品中的内毒素的含量，本篇幅中有关使用这些测试的相关方法将在补充的附录被提供。
细菌内毒素的检测原理是利用鲎变形细胞的溶解物来进行的（ＬＡＬ试验）。
将含内毒素的溶液加入鲎变形细胞的溶解物可产生浑浊、沉淀或混合物的凝胶化反应。
反应速度依赖于溶液中的内毒素的浓度、pH和温度；反应要求有一定量的二价阳离子、一个原凝酶系和可溶性蛋白的创造，而这些都哪由鲎变形细胞的溶解物提供。
采用从染色基因肽中释放的染料浓度来进行测定样品的内毒素浓度。
下面五种方法将在后面文章中介绍；方法A：凝胶法；限度试验方法B：半定量凝胶法方法C：动力学浑浊法方法D：动力学发色肽方法方法E：发色肽终点法当一篇专门文献中介绍内毒素的测定而没有指明某一种方法时，那么测试的方法就是按照方法A 。
次种方法已经得到证实，否则，产品的有效检测将会在专门文献中特别提到。
很多专著以“细菌内毒素限定浓度”的概念给出了细菌内毒素指标，也即某种产品所含细菌内毒素浓度不能超过限定浓度，要想证明产品符合要求，就必须表明产品所含内毒素的含量是少于内毒素限定浓度的。
试验是利用一种能避免微生物污染的方式进行的。
检测前的准备工作中，必须证实如下内容：——所以的设备器皿不吸附内毒素。
——溶解物的灵敏度λ，λ是被定义为标记的溶解物敏感度或者最低内毒素浓度被用于制作标准曲线的（定量法）。
——干扰素的排除；如有必要时，需对设备和器具进行处理，以减少其本身所带内毒素。
除非特别指明外，否则在文献中从方法A到E中均采用相同标准。
在本篇附录中，术语说明中包括任何其他的容器，诸如一个微滴定率的极板等。
本试验包括如下试剂和标准溶液制备：标准细菌内毒素BRP；与国际标准相比较，对标准内毒素BRP进行效准，并以国际标准单位来表示。
药典三部(版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
药典三部2015版-通则-1143细菌内毒素检查法
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法,后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶限度试验结果为准.本试验操作过程应防止内毒素的污染.细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位(IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价,干扰试验及检查法中编号B 和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0。
005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用.试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上)去除,也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液)的pH值,一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8。
0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L)一般按以下公式确定:L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值,一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位)表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/（kg·h)表示，注射剂K=5 EU/（kg·h),放射性药品注射剂K=2。
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细菌内毒素检查方法综述
【关键词】细菌内毒素检查法；,,,机理；,,,预实验；,,,特殊值
细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。
以前，细菌内毒素检查用家兔热原法进行，自从1980年《美国药典》第20版收载了细菌内毒素实验以来，《英国药典》《欧洲药典》《日本药局方》《中国药典》等相继收载了该方法。
1995年《美国药典》第23版已收载了471种药品进行细菌内毒素检查，而《中国药典》1995年版也收载了12种药品进行细菌内毒素检查［1］，2000版更收载有47种药品利用此方法进行热原检查。
细菌内毒素检查法已逐渐代替家兔热原检查法，显示出其在检查热原方面的重要性。
本文对细菌内毒素检查法作一综述。
1 方法、机理及影响因素
1.1 应用的方法目前，美国药品食品管理局（FDA）承认3种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法，即凝胶（gelclot）法、生色（chromogenic）法和动态浊度（keniticturbidimetry）法［2］。
近年来较新的方法有水箭电泳免疫法（测残余蛋白）、酶联免疫吸附法（测残余酶）。
后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100，且灵敏度更高，抗干扰能力更好。
《中国药典》1995年版只采用凝胶法。
凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂（TAL）溶液在试管中混匀，一般各0.1 ml，（37±1）℃反应（60±2）min。
如果被检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度（λ）时，就会在试管中显示阳性反应，即形成凝胶；否则呈阴性反应，即呈澄明溶液或轻度混浊，视内毒素的浓度而定［1］。
该反应极其灵敏，凝胶形成速率与内毒素浓度成正比，并受温度、反应物中Ca2 /Mg2 离子浓度和pH等因素的影响［3］。
同样，《中国药典》2000年版也只采用凝胶法。
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1.2 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理见图1。
图1 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理（略）
2 影响细菌内毒素检查的因素
2.1 检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分，都会影响到检查结果的准确性，得到所谓“假阳性”或“假阴性”结果。
只有证实检品对凝集反应无干扰之后，检查的结果才是可信的。
判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。
2.2 鲎试剂的非特异性内毒素不是唯一能激活鲎试剂凝集系统的物质，还有其他物质可以通过G因子这个“旁路”激活鲎试剂的凝集系统。
因此鲎试剂并不是专一对内毒素反应的试剂。
由旁路反应产生的阳性结果称细菌内毒素检查的“假阳性”。
3 特殊值的确定
3.1 药品的内毒素限值（L）药品细菌内毒素检查是一种限度实验，首先必须确定供试品的细菌内毒素限值。
当供试品含内毒素低于这个限值时，按规定给药途径用药，就不会引起致热原反应；相反就有可能引起热原反应［1］。
药品细菌内毒素限值确定的方法有3种。
3.1.1 药典给出药典规定细菌内毒素检查的品种，在药典正文可以查到相应的L值。
《中国药典》1995年版规定了12种注射剂的L值，2000年版规定了47种注射剂的L值，USPXXⅢ规定了471种注射剂的L 值。
3.1.2 根据热原检查的兔剂量计算L=K/M，M规定的给药途径，药品的家兔注射剂量，以ml/kg，mg/kg，μ/kg等表示；K为规定的给药途径；临床无任何不良反应的内毒素阈值，以Eu/kg表示。
静脉（包括im，ip，sc，ia）：5.0 Eu/kg；放射性药品：2.5 Eu/kg；鞘内：0.2 Eu/kg。
3.1.3 根据人的最大注射剂量计算L=K・W/M，M为规定的给药途径，人的最大注射剂量同样以ml/kg，mg/kg，μ/kg等表示；W为人的平均体重，中国成人按60 kg计算。
3.2 药品的最大有效稀释（MVD）做药品的细菌内毒素检查时，当品种的L值与所选用的鲎试剂灵敏度（λ）相等时，若经干扰实验证实无干扰，可以直接检查。
但许多药品的L值往往大于鲎试剂的灵敏度（L ＞λ），在这种情况下，若直接检查，得到阳性结果并不能说明该药品的内毒素含量超过限值。
因此，当L ＞λ，需要对检品作适当的稀释，但稀释的倍数不能超过一个有效的限度，这就是“最大有效稀释”，用MVD 表示。
其计算公式如下：MVD=L/λ。
4 重要的实验――预实验
4.1 鲎试剂标示灵敏度的复核实验鲎试剂是一种有生物活性的试剂，其稳定性受多种因素的影响，药品的细菌内毒素检查又是关系到药品安全性的重要检查项。
因此各国的细菌内毒素检查法都规定：每批鲎
试剂在用于细菌内毒素检查前都必须对该批试剂标示的灵敏度进行复核。
当复核的灵敏度值λ0在标示值λ的0.5~2.0λ范围（即0.5λ≤λ0≤2.0λ），方可用于细菌内毒素检查，并且要按标示值使用。
4.2 检品的干扰实验
4.2.1 干扰实验的目的判断某个品种在某种浓度状态下是否宜作细菌内毒素检查，就需要对其作干扰实验。
要求至少对每个厂家连续生产的3~5个批号（不包括亚批）的供试品进行干扰实验，若鲎试剂的来源以及供试品的配方有变化或生产工艺改变时，须重复进行干扰实验［6］。
《美国药典》的细菌内毒素检查法及FDA关于鲎试剂的准则规定，用鲎试剂方法检查任何一种药品的内毒素含量之前，至少要做3批成品的干扰实验，如果鲎试剂的来源或制造工艺改变，或药品的生产工艺、处方、成分改变，要重做干扰实验；如果药品的特殊组分的来源或鲎试剂的批号改变，要用阳性产品对照来复检鲎试剂方法对这一产品的检查有效性。
4.2.2 干扰实验的原理干扰实验在《美国药典》的细菌内毒素检查法中称为抑制或增强实验。
其原理是比较鲎试剂与内毒素的反应在水溶液中进行和在检品中进行的差异。
也就是比较反应在不同介质中进行的差异无差异即无干扰，有差异即有干扰。
4.2.3 干扰实验的方法干扰实验是由两部分实验组成：其一是鲎试剂与内毒素在水溶液中的反应实验，这部分与鲎试剂的灵敏度复核实验完全相同。
其二是鲎试剂与内毒素在检品溶液中的反应实验，也就是在检品中加入相应量的内毒素（或者说用检品的溶液来稀释内毒素），用来做鲎试剂灵敏度的“复核”，比较鲎试剂在不同介质中对内毒素的“灵敏度”是否一致。
4.2.4 阳性产品对照用SMVD复溶鲎试剂，然后加入2 λ浓度的标准内毒素溶液与之反应，若反应结果为阴性，说明检品对检查有抑制作用。
若反应结果为阳性，说明检品对检查无抑制作用，但并未能表示无增强作用。
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5 应用前景
细菌内毒素检查法作为一种新技术载入药典，成为一种法定的药检方法，反映了药典标准水平、药检技术水平的提高，标志着一个国家制药工业水平及药品质量的提高。
随着历史的发展，必将有更多国家的药典收载细菌内毒素检查法。
它具有方法多样化、自动化、微量化的特点。
细菌内毒素检查法所具有的优点表明它比家免热原检查法更适应现代制药工业的发展。
它可以应用于药检，也可以用于药品生产质量控
制、临床诊断及其它领域。
该法用于药品成品的检查，属于一种事前控制的质控手段，对提高药品质量，避免造成药品成批报废有重要意义；在临床上可作为快速诊断革兰氏阴性细菌感染的疾病的一种辅助方法，但不能区分病原体。
其它在食品卫生、环境保护、电子工业（如超纯水的检查）等领域也涉及到细菌内毒素检查的应用。
参考文献：
［1］黄清泉,夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计［J］.中国药学杂志,1997,32(2):72.
［2］王茂林.鲎试剂法检查热原的应用范围［J］.中国医院药学杂志,1990,10(4):41.
［3］高国政,颜锦.pH值影响细菌内毒素测定的实验室研究［J］.中国药学杂志,1998,18(3):162. 淘金者论文范文中心
［4］郭录平.浅谈影响鲎试验的因素［J］.中国药学杂志,1996,31(3):187. :淘金者论文范文是你生活，学习的好助手
［5］国家药典委员会.中国药典，Ⅱ部［S］.北京：化学工业出版社，2000：附录86.
［6］中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典，Ⅱ部［S］.北京：化学工业出版社，1995：附录XXⅢ.。