细菌内毒素检查

细菌内毒素检查

1、实验原理

2、实验试剂

3、试验器具

4、检查方法概述

5、供试品溶液的制备

6、内毒素限值的确定

7、最大有效稀释倍数（MVD）的确定

8、鲎试剂灵敏度复核

9、干扰试验

10、供试品的细菌内毒素检查

1、实验原理：利用鲎试剂与微量内毒素产生凝聚反应的现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。

2、实验试剂：

①鲎试剂：从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制的生物制剂。

鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示，即鲎试剂的灵敏度，单位为EU/ml。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

②细菌内毒素国家标准品：系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。

③细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

④细菌内毒素检查用水：指内毒素含量少于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005 EU/ml （用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。

3、实验器具：刻度吸管、凝聚管（10×75mm）、三角瓶、小试管（10×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。

耐热器皿常用干热灭菌法（250℃，30分钟以上）去除，塑料用具应选用无内毒素并且对试验无干扰的器械（目前多为无热源的一次性用品）。

4、检验方法概述

①凝胶法：限量法、半限量法

②光度测定法：浊度法（终点浊度法和动态浊度法）、显色基质法（终点浊度法和动态浊度法）

凝胶法：最简单、经济、应用广泛、中国药典的“仲裁”方法，对干扰相对不敏感，较光度测定法不灵敏。

5、供试品溶液的制备

某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸取制成供试品溶液。

一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。

可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节PH值。

6、内毒素限值的确定

一般按公式：L≡K／M

式中：

L为供试品的细菌内毒素限量，以EU／ml，EU／mg、或EU／U（活性单位）表示。

K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K＝5 EU（kg.h）,放射性药品注射剂K＝2.5EU（kg.h）靶内用注射剂K＝0.2 EU（kg.h）。

M为人人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，依据药品使用说明书，≤临床用药须知≥规定。

7、最大有效稀释倍数（MVD）的确定

最大有效稀释倍数（MVD）指在试验中供试品溶液被稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限度的测定。

MV D＝Cl／λ

式中：

L为供试品的细菌内毒素限量, C为供试品溶液的浓度，当L以EU／ml表示时，则C 等于1.0ml／ml，当L以EU／mg表示时，C的单位为mg／ml, λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（E U／ml）。

8、鲎试剂灵敏度复核

目的：考察鲎试剂的灵敏度是否符合标准，考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。

当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检查结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

细菌内毒素标准溶液的准备：①、取细菌内毒素工作标准品（或国家标准品）一支，轻弹瓶壁，使粉末洛入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75℅酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。②、按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟，然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、λ、0.5λ和0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30分钟。

示例：某待复核鲎试剂的灵敏度标示值为0.25E U／ml，细菌内毒素工作标准品规格为150 E U／ml，将细菌内毒素工作标准品用1 ml细菌内毒素检查用水，再稀释制备成浓度为0.50E U／ml，0.25 E U／ml，0.125 E U／ml和0.06 E U／ml的细菌内毒素标准溶液。

细菌内毒素标准溶液的制备过程图示：

待复核鲎试剂的准备

取规格0.1m l∕支的鲎试剂18支，每支加入0.1ml检验用水使溶解备用（规格大于0.1m l ∕支的鲎试剂，按其标示量加入细菌内毒素检查用水复溶后按0.1m l∕管分装到凝聚管中，至少准备18管）。

加样

将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支，1列2支。其中4支4列分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ和0.25λ内毒素标准溶液，另2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。

加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，垂直放入37±1℃恒温器中，保温60±2分钟。

观察结果

将试管轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑落者为阳性，未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑落着为阴性。

计算

当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果。

λC＝lg-1（∑X／4）

式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。

反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。

例子：