新城疫抗体检测

新城疫的抗体检测

某些病毒具有凝集某种（些）动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的实验称血球凝集试验，以此来推断被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的血凝可为相应的抗体所抑制，即血球凝集抑制实验（HI ），通过血凝与血凝抑制试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。

一目的意义

1免疫监测（1）免疫效果评价（2）免疫时机确定

2诊断疾病（根据有无抗体或抗体的高低）

3流行病学调查

二试验仪器与试剂

1 试验仪器离心机、离心管两支、50ml 量筒一个、V 型微量反应板、微量加样器（移液

器）、塑料吸头（黄色）若干、1ml 吸管1 支、胶头滴管两支、微量振荡器、

电热恒温培养箱、托盘天平。

2试验试剂鸡新城疫抗原、流感H5 H9抗原、1%鸡红细胞、生理盐水、 3.8%柠檬酸钠抗凝剂、待检血清。

三方法

1 病毒的血凝试验

1.13.8% 柠檬酸钠抗凝剂的配制：用托盘天平称取柠檬酸钠3.8 克溶于100ml 蒸馏水

或纯净水中，摇匀使其充分溶解即可，有条件的可121 C高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至室

温后置4C冰箱中保存备用。

1.21%鸡红细胞制备过程：事先用5ml （或10ml）的注射器吸入抗凝剂若干（其量为

所需血量的1/5）, 从健康公鸡（未经新城疫疫苗注射）的心脏或翅下静脉采取2-4 毫升血液, 以2000 转每分钟，离心5 分钟，吸去上清液（注意要将血细胞泥表面的一种薄膜吸净）。然后用生理盐水（用量为血细胞泥的5-10 倍）洗红细胞，离心5分钟，弃去上清液，如此反复洗3-5 次，直至上清液透明清亮为止，最后一次要用生理盐水将血细胞泥稀释成1%浓度，然后置4 C冰箱备用（一般可保存3天）。

1.3红细胞凝集试验（血凝试验）操作方法（见表1）：

（1）取一块洁净的96孔V型微量血凝反应板，用微量移液器从第一列第一孔开始依次加入生理盐水，每孔25 微升，直至加到第十五孔（第一列12 孔，第二列3 孔）。

（2）取新城疫抗原液25微升加入第一孔中，充分混合后吸取25微升加入第二孔中，如此直至第14孔，混合后吸取25微升丢弃，第15孔不加病毒为对照。

（3）更换移液器前端的塑料吸头，每孔加已备的1%鸡红细胞液各25 微升（注意从后往

前加）。

（4）将反应板置微型震荡器上，振动混合1分钟，取下置37C恒温箱中作用30分钟后

开始观察结果，注意每五分钟观察一次，直至30 分钟，判定并记录结果。

判定结果如下：

++++——红细胞全部凝集，均匀分布于孔底。

++ ---- 红细胞部分凝集，沉积于孔底呈小圆点状。

- ——红细胞全部不凝集，沉积于孔底呈圆点状。

以使红细胞全部凝集的病毒最高稀释倍数为该病毒的凝集效价。4单位病毒的确定，以

上述血凝价除以4即为4单位病毒，如血凝价为1:128，则1:128的0.1ml中有一个凝集单位，4 单位病毒为128/4=32 ，即1:32 为4 个凝集单位。

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

64

128

256

512 1024 2048 4096 8192 16384 对照组

振荡混匀置30C 恒温箱30分钟

2血凝抑制试验(HI )血凝试验可以被病毒血清所抑制，因此可以通过血凝抑制试验检 测抗病毒抗

体。根据抗体效价的高低，可制订预防疾病的合理的免疫程序， 也可间接得知鸡

群是否存在病毒， 对科学地防治具有重要意义。具体方法如下(见表

2):

(1)

清洁的96孔V 型微量血

清反应板一块，在每孔中加生理盐水 25微升(每一份血 清加一

列)。

(2)

将被检血清25微升加入第1孔中，充分混

合后，取 25微升加入第2孔中，如此 稀释直至第10孔，第11孔不加血清为抗原对照孔，第 12不加血

清和抗原为红细胞对照。

(3) 根据血凝试验测定的病毒效价，配制 4个血凝单位

病毒稀释液。

(4) 将反应板置混合器上振荡 3分钟，取下放室温10分钟。 (5) 每孔中加入1 %鸡红细胞各25微升。 (6)

置微型混合器上振荡3分钟，取下放室温 15分钟开始观察，至 60分钟判定记录 结果. 表2 :血凝抑制试验(HI ) 孔号 1 23456789 10

11 12

稀释倍数 2

4

8

16

32

64 128 256 512 1024抗原对照

红细胞对照

孔号 1 2 3 4 5 稀释 亠 2 4

8

16

32

倍数 1%鸡

红细 25 25 25 25 25

胞

25 25 25 25 25 25 25 25 25 25

单位：微升

生理 盐水 抗原

弃

)

25

生理盐水待检血清

4单位病毒1%鸡红细胞

25

25

25 25

振荡混匀

25 25

振荡混匀

25 25

1分钟后置

25 25

1分钟后置

25 25 25

37C恒温箱中作用

25 25 25

37C恒温箱中作用

25

25 25

15分钟

25 25 25

15分钟

50

25

2

25-. 25

25-^5

25

2

2

以100 %抑制凝集的血清最大稀释倍数为该血清的血凝抑制效价即滴度。