动物细胞与组织培养技术
细胞工程-7 细胞培养的基本概念及培养细胞的生物学特征
一、细胞培养发展简史
• 动物细胞（组织）培养技术起源于1885年，德国人 Roux 用温生理盐水在体外培养鸡胚髓板，并使之 存活了数月之久。 • 动物细胞（组织）培养的奠基人是美国生物学家 Harrison。在1907年采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴 培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存 活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程。 Harrison - - isolated pieces of frog embryonic tissue known to give rise to nerve fibres - grew them in frog lymph - observed outgrowth of axons over period of weeks in 1907.
5，由于细胞培养有可能在同一时期、相同条 件、相似性状的条件下提供大量的实验样 本，所以相对耗资较少，因而也就成为生物 制品、单克隆抗体和基因工程制品生产的 重要手段。
6，细胞和组织生长在人工培养环境中，与体 内环境相比仍然存在一定的差异，培养的 细胞或组织，其形态或功能会发生不同程 度的改变。因此再利用培养细胞做实验对 象时，不能将其与体内细胞完全一样看 待，只能把它们视作一种既保持动物体内 原细胞一定的性状、结构和功能又发生某 些改变的特定的细胞群体。
四、体外培养细胞的分型
根据离体细胞在体外生长时是否贴壁的性 质，将其分为贴壁型与悬浮型两类
正常体内组织细胞类型
四、体外培养细胞的分型
贴壁型(anchorage-dependent cell)
按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型
1)成纤维细胞型 （fibroblast） 2)上皮细胞型 （epithelium） 3) 游走细胞型 （wandering） 4)多形型细胞 （polymorphic）
动物细胞组织培养的原理
动物细胞组织培养的原理动物细胞组织培养是指把动物体内的某种细胞组织从体内取出后，通过一系列特定条件，在人工培养环境下维持其正常的生理代谢活动，使其细胞分裂生长，形成一定数量和质量的同质性细胞群。
细胞培养可以提供许多有益的信息，如细胞功能、基因表达、分子生物学和生物化学的信息等，因此被广泛应用于医学、疫苗制备、药物筛选及生物学研究领域。
组织培养的原理是建立在细胞生长、分裂、分化等基本生理现象的基础上，并遵循生物化学、细胞生物学等相关学科的理论，并强调理论与实践相结合的原则。
组织培养主要包括3个基本环节：细胞分离、无菌培养、细胞检查与鉴定。
下面分别进行详细介绍：1. 细胞分离细胞分离是组织培养的第一步，也是最关键的一步，决定了细胞生长及细胞群体的质量。
细胞的来源可以是新鲜组织或建立的细胞系。
组织分离后，需要进行消化，并选用合适的细胞培养基进行培养。
细胞的消化通常通过酶类的作用来完成。
不同的细胞类型需要不同的酶消化方法。
消化酶的种类、酶的浓度、消化时间等因素也会影响细胞分离的质量和效率。
2. 无菌培养细胞分离后，必须进行无菌技术处理，才能将其移入细胞培养器中进行培养。
在细胞培养的过程中，细胞必须保证一个良好的培养环境，包括正常的温度、低细胞密度、合适的营养和生长因子等条件。
细胞密度必须保持在合适的浓度，以避免背靠背的细胞引起的细胞死亡，同时保证细胞生长的速度与增殖，而且必须维持在同一浓度范围内。
营养液中的成分要具有必要的营养物质，如氨基酸、维生素、激素等。
对于一些需要特定培养条件的细胞，需要加入特定的生长因子和细胞因子，如白细胞介素、表皮生长因子等，以支持细胞的生长分裂和分化。
3. 细胞检查与鉴定在培养的过程中需要不断的对细胞进行检查和鉴定，如观察细胞的生长状态和数量，核形态和染色质形态的变化等，并对细胞特性进行检测和鉴定，如细胞的种类和分化状态，遗传学特征和分子特征等。
鉴定可以通过组织形态学、生物学特性、生化成分、免疫学特征、细胞遗传学等方面进行。
动物细胞培养技术
人们设计了多种类型的培养瓶。
1940年，Earle首创单个细胞克隆培养的方法，建立了可无
限传代的C3H小鼠结缔组织细胞系。
1948年，Sanford创立了单层细胞培养法，建立了各种细胞
系。他还创建了单个细胞培养方法。
1951年， Dulbecco等采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养
基的方法，获得了单层细胞培养。单层培养法的出现，极大 地推动细胞培养的发展，利用该技术建立了很多细胞系。单 层培养成了细胞培养普遍应用的技术。
氨基酸可作为细胞培养的能量来源；
培养基中常加入蛋白质和多肽，能促进细胞迅速生长。
维生素
细胞的生长繁殖需要多种B族维生素，大多 数是与合成和代谢活动密切相关的各种辅酶 、辅基； 必需维生素：肌醇、硫胺素、核黄素、吡哆 醇、泛酸、叶酸、烟碱酸、生物素、胆碱、 对氨基苯甲酸； 常用限定培养基中已成为固定组成成分。
一、基本概念
1．动物细胞与组织培养(Cell and Tissue Culture) ： 用无菌方法将动物体内细胞或组织取出，模拟体内 的生理环境，在体外进行培养，使离体细胞或组织 生存、生长并维持结构和功能的一门技术。
动物细胞工程的基础。
分类：
细胞培养 Cell Culture 组织培养 Tissue Culture 器官培养 Organ Culture
二、动物细胞体外培养特点
动物细胞生长缓慢，培养时间长。 更易受微生物污染 （包括细菌、真菌、病毒、支原体）， 需要防治污染问题。
对培养环境的适应性差，对环境极其敏感。包括pH值、温
度、剪切力 对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半
动物细胞工程动物细胞与组织培养课件
动物细胞工程动物细胞与组织培养课件汇报人：2024-01-10•动物细胞工程概述•动物细胞培养技术•动物细胞与组织的体外培养目录•动物细胞工程的应用案例•展望与挑战01动物细胞工程概述定义与特点定义动物细胞工程是以动物细胞为研究对象，通过细胞培养、细胞融合、基因转移等技术手段，实现动物细胞和组织的体外培养、繁殖和生产，以及动物疾病治疗和生物医学研究的技术。
特点动物细胞工程具有高度的技术性、复杂性和应用性，涉及多个学科领域，如生物学、医学、生物工程等。
它能够实现动物细胞的体外大规模培养，生产出大量的生物制品，如疫苗、单克隆抗体等，为人类疾病预防和治疗提供重要的技术支持。
利用动物细胞大规模培养技术，生产出大量的疫苗、单克隆抗体等生物制品，用于疾病的预防和治疗。
生物制品生产通过动物细胞培养和基因工程技术，实现新药的筛选和开发，提高药物研发的效率和成功率。
药物筛选与开发利用动物细胞工程技术，体外培养出人体组织和器官，用于移植和修复人体损伤的组织和器官。
组织工程通过动物细胞培养和基因工程技术，建立各种疾病模型，用于疾病的发病机制研究和药物筛选。
疾病模型建立动物细胞工程的应用德国科学家Rudolf Virchow首次提出“细胞来源于细胞”的著名论断，为动物细胞工程的发展奠定了基础。
1907年美国科学家Graham和Milstein首次成功实现了哺乳动物细胞的体外培养，开启了动物细胞工程的新篇章。
1958年美国科学家Kohler和Milstein首次成功制备出了单克隆抗体，为动物细胞工程在生物制品生产领域的应用奠定了基础。
1975年随着基因工程技术的发展和应用，动物细胞工程进入了一个新的发展阶段，实现了基因转移和基因编辑等先进技术的应用。
1990年代动物细胞工程的发展历程02动物细胞培养技术细胞生存和增殖条件动物细胞培养需要提供适宜的温度、湿度、pH值、营养物质等条件，以维持细胞的生存和增殖。
细胞贴壁与生长动物细胞在培养过程中需要贴附在培养器皿的表面才能生长，因此需要选择适当的细胞培养器皿和贴壁介质。
细胞工程-复习提纲-3.动物组织和细胞培养
━动物细胞的培养■ 动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。
★特性：■ 倍增时间长，生长缓慢，易受污染；■ 无细胞壁，对机械搅拌或剪切力敏感；■ 细胞间主要以聚集体形式存在，大多数需要粘附在载体表面才能生长；■ 原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。
━接触性抑制：是指由于细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象，使得正常细胞并不会相互重叠，而是呈单层细胞生长。
━密度抑制：细胞接触汇合成片后，只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂。
但当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，密度保持不变。
━动物大规模培养技术：悬浮培养、微载体培养、微囊化培养、中空纤维法等━原代培养：接种组织块直接长出单层细胞或组织分散成单个细胞在进行培养。
━传代培养：从原代培养的细胞继续转接培养。
★常用细胞━组织工程：应用细胞生物学和工程学原理，将人体某部分的组织细胞种植和吸附在生物材料的支架上进行人工培养繁殖、扩增，然后移植到人体内所需要的部位，从而达到器官修复或再造的治疗目的。
━干细胞：一类具有自我更新和分化能力的细胞。
■ 根据功能分类：单能干细胞、多能干细胞与全能干细胞；■ 根据来源分类分为：成体干细胞、胚胎干细胞（ES细胞）。
━干细胞增殖特性：①缓慢性②自稳性①缓慢性：干细胞的增殖速度一般比较慢。
而一旦机体需要时，干细胞就可以进入分化过程，其增殖速度开始加快。
这种缓慢增殖的特点利于干细胞对特定的外界信号做出反应，以决定进行增殖还是分化程序。
缓慢增殖还可以减少基因发生突变的可能性，使干细胞尽量避免产生自身突变。
②自稳性：自我更新维持自身数目的恒定。
━胚胎干细胞：ES细胞，是一种全能干细胞，是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞系，可以分化成任何一种组织类型的细胞。
动物细胞培养
玻璃：最常用，便于观察、易洗涤可反复使
用。 塑料：常用聚苯乙烯，具亲水性，常加工成 多孔板、培养皿等 金属：不锈钢和钛
动物细胞小规模培养
悬滴培养法
培养瓶培养法 旋转管培养法
灌注小室培养法
培养板培养法
悬滴培养法 ①将培养液滴于盖玻
3、游走型细胞 本型细胞在支持物上散在生长，一般不连
成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃 的游走或变形运动，速度快且不规则。此型 细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。 在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片 后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。 4、多形型细胞 形态上不规则，一般分胞体和胞突两部分， 其中胞突细长形，类似丝状伪足，胞体呈多 角形。
贴附型
培养细胞的 生长类型 悬浮型
游走型细胞 多形型细胞
贴附生长是大多数有机体细胞在体内生存和
生长发育的基本存在方式。贴附有两种含义： 一是细胞之间相互接触；二是细胞与细胞外 基质结合。 动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞是必 须附壁即附着在固体表面生长，当细胞布满 表面后即停止生长，这时若取走一片细胞， 存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重 新布满创面。
贴附型细胞 1、成纤维型细胞 本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而 得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生 长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3厘米 个长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由 中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。 2、上皮型细胞 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细 胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动， 处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。 起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生 物、 消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。
动植物细胞培养的主要区别
动植物细胞培养的主要区别第一篇:《动物细胞培养与植物细胞培养的区别》动物细胞培养与植物细胞培养的区别动植物细胞培养的主要区别1.培养基不同：植物细胞（固体培养基），动物细胞（液体培养基）动植物细胞培养的主要区别2.培养基的成分不同：动物细胞培养必须利用动物血清，植物组织培养则不需要，而需要加入植物生长激素3.产物不同：植物组织培养最后一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般不能表达其全能性，因此得到的是只含同一种的细胞的一个细胞系（或者叫细胞群）。
4.原理不同：植物组织培养的原理为植物细胞的全能性，动物细胞培养的原理为细胞的增殖。
动植物细胞培养的主要区别5.过程不同：植物组织培养的过程为脱分化和再分化，动物细胞培养的过程为原代培养和传代培养7.培养目的不同：植物组织培养是为了快速繁殖和获得无病毒植株，动物细胞培养是获得生物制品。
根据培养方式：贴壁细胞培养，半悬浮细胞培养，悬浮细胞培养第二篇:《动物细胞培养和植物细胞培养的比较》动物细胞培养与植物组织培养的对比第三篇:《全国林业有害生物防治知识竞赛题含答案》害预测预报工作的通知》要求，一般常灾区每0.5万一1万亩，偶灾区每亩，无灾区每2万一5万亩，应设一名测报员或病虫情调查员。
在大片林区，可适当增加测报员或病虫情调查员的调查监测面积。
（答案：1万一2万）39、《关于进一步加强森林病虫害预测预报工作的通知》要求，要以或进行病虫情调查，掌握面上的病虫害发生情况。
（答案：林班；小班）40、《关于加强林业有害生物监测预报和突发疫情信息管理的通知》（造防函81号）要求，为了加强林业有害生物监测预报和突发疫情信息报告的管理，各地要严格按照有关要求，新发生（发现）的危险性和发生严重在50公顷以上的林业有害生物必须在日内上报国家林业局。
（答案：7）二、选择题１、1999年以来，我国先后建立了个国家级森林病虫鼠害中心测报点（简称国家级中心测报点）。
（答案：D）Ａ.183；Ｂ.510；Ｃ.490；Ｄ.1000２、《国家级森林病虫害中心测报点管理办法》要求：国家级中心测报点发布的主测对象和当地主要病虫鼠害的预报准确率应为。
动物细胞与组织培养
体内外细胞的差异 1. 与体内主要不同 相对孤立、相对单一，
缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 2. 主要表现
抗原决定簇---抗原分子上可以诱导出抗体的部位或片段
多克隆抗体----一种抗原通常具有多个不同的抗原决定簇，因此能刺激多个 B 淋巴细胞产生 相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定簇的单克隆抗体混合物，称为多 克隆抗体
杂交瘤细胞---将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的
人抗鼠抗体（HAMA）反应----鼠来源的单抗在人体内是外源物质，很可能会产生人体免疫系 统对它的排斥反应：产生抗鼠的抗体
血清的缺点 对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，可能改变某种细胞在体内的
正常状态 血清含一些对细胞产生毒性的物质 动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。 取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠 性。 血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产 中分离纯化工作很难完成。 大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部 分之一
体外培养细胞生存所需基本物质 （一）糖 （二）氨基酸 （三）维生素 （四）促生长因子 （五）其它物质
细胞培养的常用液体 水 平衡盐溶液---由无机盐、葡萄糖组成，维持细胞渗透压平衡，保持 pH 稳定及提供简单的营 养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。 消化液---进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液，传代培养时也需要将贴 壁细胞从瓶壁上消化下来。胰酶溶液和 EDTA 溶液，胶原酶溶液 消化酶抑制剂----血清，大豆胰蛋白酶抑制剂 pH 调整液----NaHCO3 溶液，HEPES 溶液 抗生素液---青霉素，链霉素 谷氨酰胺补充液----（1）频繁打开盖子，增加了破坏无菌状态的可能性；
动植物细胞组织培养技术现状及应用实例
动植物细胞组织培养技术现状及应用实例动植物细胞组织培养技术是现代生物科学研究的重要工具，它可以应用在药物研发、农业生产、环境保护等领域。
本文将介绍动植物细胞组织培养技术的现状及应用实例。
一、植物细胞组织培养技术现状植物细胞组织培养技术是指将植物组织、细胞或器官移植到营养饲料中，通过调节培养条件和营养液组成，使其在无土、无阳光的条件下进行生长和繁殖的技术。
植物组织培养技术主要包括植物愈伤组织培养、植物无菌播种等。
目前，植物细胞组织培养技术的应用已经从传统的植物繁殖转移到了植物产生抗性、药用物质和基因转化等方面。
植物组织培养技术的主要应用之一是在植物育种中，例如通过合适的培养条件和营养液配方，可以促进植物遗传变异，产生新的变异体，为植物育种繁殖提供新的材料。
此外，植物组织培养技术还可以用于植物基因工程研究，如通过组织培养体系，将外源基因导入到植物体内，实现对植物性状的基因编辑和调控。
二、植物细胞组织培养技术应用实例1.丹参组织培养产生丹参酮丹参是一种常见的中药材，丹参酮是其中最重要的活性成分之一。
通过植物组织培养技术，可在无污染的条件下，得到大量优质的丹参组织，从中提取出丹参酮，具有较高的药效价值。
2.马铃薯组织培养繁殖马铃薯是世界上重要的蔬菜和淀粉作物之一。
植物组织培养技术可以通过组织切片、愈伤组织的诱导等手段，实现马铃薯的高效繁殖，为农业生产提供了更为丰富的资源。
3.玫瑰无菌苗繁殖玫瑰是世界上重要的观赏花卉之一，通过植物组织培养技术可以实现无菌苗繁殖，克服传统繁殖方式中的传播病害风险，提高玫瑰繁殖的效率和质量。
4.菜豆组织培养产生抗病性菜豆菜豆是我国重要的经济作物之一，由于受病害、虫害、籽粒质量等因素的影响很大，因此，使用植物组织培养技术进行抗性育种具有重要的经济意义。
菜豆组织培养技术可大大缩短育种周期，提高育种效率，是菜豆育种的重要手段之一。
三、动物细胞组织培养技术现状动物细胞组织培养技术是指将动物细胞移植到营养液中，以其自身的生殖能力、分化能力和功能表现进行生长和繁殖的技术。
动物细胞组织培养(精)
将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然 后继续增殖。 这样的过程叫做传代培养
8、如何理解原代培养和传代培养？ 在第一培养瓶中培养就是原代培养，之 后转移到其它培养瓶中培养就是传代培 养 9、传代培养的细胞能一直传代下去吗？ 不都能 10、有些为何能一直传下去？ 发生突变，朝着癌细胞方向发展 11、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？ 保存10代以内的细胞，因为10－50部分 细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分 还发生突变向癌细胞方向发展
4、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？
成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮 液利于培养，使每个细胞与培养液接触
5、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成 新个体？
不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，因 为动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度 的提高而逐渐受到抑制
6、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再 分裂、增殖？ 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时， 细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象 叫接触抑制。 7、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应 该怎样办？
?）
防止培养过程中污染 防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害
(2)、培养基 成分： 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等
种类： 天然培养基：主要取自动物血清，组织提取液，营 养价值高，成分复杂 合成培养基：人工配置，成分明确，便于控制试验 条件
和植物组织培养基相比有何独特之处？
液体培养基 、成分中有动物血清等
(3)、温度和PH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4 (4)、气体环境 O2和CO2
4.动物细胞生长特性：
细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上， 称为细胞贴壁。 要求： 培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴 附。 细胞的接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞 就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑 制。
动物细胞培养基本技术与原理备课讲稿
二、动物细胞特性
动物细胞在活体内的特性 培养条件下动物细胞生长特性 培养条件下动物细胞生理特性
1. 动物细胞在活体内的特性
在活体内，动物细胞:
增殖 分化
分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有 明显的形态学特征。
如肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能； 神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激； 红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动； 上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。
二、取材、分离和组织消化 (to draw the materials from tissue，separation ，digestion )
（一）取材——获取组织
原则上各种动物组织都可进行体外培养，而实际上幼龄组织（尤其 是胚胎组织）比老龄组织容易培养、分化程度低的比分化程度高的 容易培养、肿瘤组织比正常组织容易培养。 取材前要对所取组织的各种情况进行详细记录；
“代”：继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年 龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚 成纤维细胞约可以培养50代，而成年人的成纤维细胞则 不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维 细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。
大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超 过有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是 发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久 细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细 胞培养中称为体外转化(in vitro transformation)。
用特点及组织成分不同适当选用 （4）EDTA：最适于消化传代细胞时，常与胰蛋白酶配合使用。
2、组织消化操作方法(tissue digestion method of operation)
植物组织培养与动物细胞培养的比较
植物组织培养与动物细胞培养的⽐较
植物组织培养与动物细胞培养的⽐较⽐较项⽬植物组织培养动物细胞培养
区别
原理植物细胞的全能性细胞增殖
培
养
基
状态固体或半固体培养基液体培养基
成分包括矿质元素、蔗糖、维⽣素、
琼脂、植物激素等
包括⽆机盐、葡萄糖、维⽣素、
氨基酸、动物⾎清等
培养条件再分化阶段需光不需光
细胞来源离体植物器官、组织或细胞胚胎或幼龄动物组织、器官过程脱分化、再分化原代培养、传代培养结果获得新个体或细胞产品⼤量产⽣细胞或细胞产物
⽤途
①快速繁殖名贵花卉和果树
②培养⽆病毒植株、转基因植物
③⼤规模⽣产细胞产品如药物、
⾷品添加剂、⾹料、⾊素等
①⽣产蛋⽩质制品如病毒疫苗、
⼲扰素、单克隆抗体等
②检测有毒物质
③研究⽣理、药理、病理
相同点
①都需要⼈⼯条件下的⽆菌操作，⽆菌培养
②都是合成培养基
③都需要适宜的温度、pH等条件
④都进⾏有丝分裂。
细胞工程(动物部分)
绪论1.细胞培养与组织培养：属于体外培养，是指生物细胞和组织在离体条件下的生长和增值。
细胞的离体培养称为细胞培养，组织的离体培养称为组织培养。
2.细胞融合：又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞融合形成一个细胞的过程。
3.细胞核移植：是利用显微镜操作技术将细胞核与细胞质分离，然后再将不同来源的核与质重组，形成杂合细胞的过程。
4.干细胞：是动物体内具有分化潜能、并能自我更新的细胞，分为胚胎干细胞和组织干细胞。
5.转基因动物：是通过基因工程技术将外源的目的基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。
第一章1.细胞工程实验室与其他一般实验室的区别：要求保持严格无菌环境、避免微生物及其他有害因素的影响。
2.细胞工程能进行的六方面工作：无菌操作、培养、制作、清洗、消毒灭菌处理和储藏。
3.植物细胞工程实验室特殊的设置：光照条件的培养箱、试管苗需要温室和移植驯化室。
4.细胞工程实验室通用的仪器设备：超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、电热干燥箱、水纯化装置、低温装置、高压蒸汽消毒器。
5.实验室的生物安全分为p1，p2 ，p3 和p4四个生物安全等级，其中P4生物安全实验室等级最高。
第二章1.清洗的主要目的是清除培养器皿中的杂质和微生物等影响细胞生长的成分。
2.细胞培养过程中主要使用两类消毒方法:物理灭菌法法和化学消毒法。
物理法灭菌法：a.紫外线法适用于无菌室或超净工作台的台面等大面积消毒。
紫外线照射工作台面的距离不应超过1.5cm,照射时间以30min左右为宜。
（注意：紫外灯关闭5min后方可进入使用）b. 湿热消毒:适用于含有不耐热成分的培养基和试剂的消毒，为121.3℃，20min .（注意点：加足水、排尽气、气压降到0时才能打开盖）c.干热消毒法:适用于消毒玻璃仪器，160℃以上，并保持90~120min，以杀死细菌和芽孢 d.过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤,薄膜0.22~0.45um直径。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2、pH：最适为7.2～7.4
大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4,偏离这一范围对细胞培养将
产生有害的影响.但细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境 中更利于细胞生长.但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如 成纤维细胞最适合pH是7.4-7.6，每种细胞都有其最适pH值.
当PH低于6或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。
这种细胞的形态特点：胞体始终为球形。 优点：生存空间大，培养效率高，利于大量生产，与培养基 充分接触无需消化传代，易于收获细胞。 缺点是不如贴附生长型观察方便，而且并非所有的培养细胞 都能悬浮生长。 ������ 贴壁细胞经悬浮适应后也可以长期悬浮培养
＊实际情况下，所培养的细胞并不一定呈现
某种典型的形态，能影响细胞形态的因素很 多，细胞形态学特征仅是对培养物判断或识 别的一种参考性指标，如果想明确某一培养 物的确切类型，必须借助于更为特异的鉴定 方法。
培养物中发现有自发的融合细胞。
1962年，冈田善雄又发现了已灭活的仙台病毒可
以诱发体内艾氏腹水瘤细胞和非恶性细胞融合。 且融合细胞染色体丢失，恶性特征受到抑制。
四、动物细胞的体外培养一般条件
1、恒定的温度:37 ℃
维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标 准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影 响，甚至死亡。 培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细 胞代谢与温度成正比； 人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复； 在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复； 41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢 复可能； 当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降 低
1913年，Steinhardt建立了单盖片悬滴培养法。 1925年，Maximow采用双盖片法。 1934年，Gey和Lewis 用旋转管培养了许多细胞系。相继，人们设计
了多种类型的培养瓶。
1948年，Sanford创立了单层细胞培养法，建立了各种细胞系。他还
创建了单个细胞培养方法。
转化细胞
二、动物细胞体外培养特点
动物细胞生长缓慢，培养时间长。 更易受微生物污染 （包括细菌、真菌、病毒、支原体）， 需要防治污染问题。
对培养环境的适应性差，对环境极其敏感。包括PH值、、盐类、葡萄糖或半
乳糖外，一般还需要血清。
原代细胞一般繁殖50代左右退化死亡。
五、 动物细胞的体外培养生物学特性
（一）培养细胞的生长方式及类型 （二） 培养细胞的生长特点
（三） 培养细胞的生长与增殖过程
（一）培养细胞的生长方式及类型
贴附于支持物表面 才能生长的细胞 成纤维细胞 上皮型细胞 游走型细胞 多形型细胞
贴壁依赖型细胞
非贴壁依赖型
于悬浮状态下 即可生长
1、贴壁依赖型细胞 含义：一是细胞之间相互接触，二是细胞与细胞外 基质结合。 单层附壁培养：指动物细胞培养中，大多细胞必 须附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止 生长。
1907年，美国胚胎学家Ross Harrison （哈里森）培养蛙
胚神经细胞长出了轴突（盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法）。 他被公认为动物组织培养的开山鼻祖。
1912年,法国学者Alexis Carrel（卡雷尔）采用鸡胚匀浆组
织液与血浆混合使用，培养了各种动物组织的组织块。 在技术方面，卡雷尔把无菌操作技术引入组织培养中。 1923年，他设计了卡氏培养瓶。
取自不同组织的上皮细胞，其生化特征及其原来的形态要有
差异，而来自不同组织的形态相似的成纤维细胞，其发展的 方向可能并不相同。
（3）游走型细胞：
不常见，具有类似巨噬细胞样的特征。。
本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞
质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，
速度快且不规则。
此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在
多形型细胞
神经细胞
神经细胞（DAB显色）
大鼠 海马神经细胞
2 非贴附型细胞
悬浮型细胞：指细胞在体外培养时不必贴壁，可在培养液 中悬浮生长。
见于少数特殊的细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、杂交 瘤细胞转化细胞系、某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体
圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。
皮肤、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮细胞，血管 内皮细胞等。
Hela细胞呈现为典型的上皮细胞型。
人口腔皮样癌细胞
人宫颈癌上皮细胞（Hela）
单层扁平上皮细胞
上皮细胞型
成骨肉瘤细胞(多角形)
奶牛肾脏上皮细胞(上皮细胞型)
体外培养时所谓的上皮细胞型细胞或成纤维细胞型细胞，仅 是因为其形态与体内的上皮细胞或成纤维细胞类似，并不能 将体外培养的这些细胞与体内同名的细胞完全等同；而且， 这种名词系使用于描述细胞的外形而并非说明细胞的起源。 与这两种形态类似的细胞，可能来自不同性质的细胞亚类。
细胞将伸展成其原来的形态。
贴附过程
影响细胞的贴附和伸展的因素：细胞因素；生物因 素（如促附着因子）； 机械、物理因素（如低温或
影响细胞形态学特征的因素
血清成分、培养基成分、添加成分、培养 基的酸碱度、气相环境、温度等。 如,Hela细胞原本是一种上皮型癌细胞,但 在过酸或过碱的条件下培养,可以呈现梭形, 当酸碱度适中时又可以恢复上皮型特征。
(二）培养细胞的生长特点
贴附和伸展 接触抑制 密度抑制
1．贴附
贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。
有限细胞系(infinited cell line)：不能连续培养的细胞株。
无限细胞系(finited cell line)：能够连续培养的细胞株， 也称无限系。
无限系细胞大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的 可能已成为恶性细胞。
细胞株、细胞系的命名： ������ 以组织来源定名，如BHK(幼地鼠肾细胞)
第三章 动物细胞与组织培养技术
第一节 概述
一、动物细胞与组织培养的基本概念 二、动物细胞体外培养的特点 三、发展历史 四、动物细胞的体外培养一般条件(掌握）
五、体外培养细胞生物学特性(掌握）
第二节 动物细胞、组织培养的基本方法(掌握） 第三节 培养细胞的检测和特性鉴定 (掌握） 第四节 动物细胞体外培养举例 第五节 细胞同步化（了解） 第六节 组织工程、器官培养（定义、培养方法及应用（了解）
游走细胞型
单核巨噬细胞（未刺激状态）
单核巨噬细胞（活化剂刺激6h后）：向四周伸展伪足
需要注意的是：在实际细胞培养中，可能同时存在2种及其以 上细胞形态；其影响因素包括（1）不同来源细胞细胞形态学 表现不同；（2）不同培养条件下同一细胞表现不同形态；如 血清成分，培养基，温气环境等
（4）多形型细胞：形态上不规则的细胞，不 常见，一般分胞体和胞突两部分，胞突细长 形类似丝状伪足；胞体略呈多角形，但较规 则。如神经组织细胞如神经元、神经胶质细 胞等。
第一节 概述
一、基本概念
1．动物细胞与组织培养(Cell and Tissue Culture) ： 指从用无菌方法将动物体内细胞或组织取出，模拟 体内的生理环境，在体外进行培养，使离体细胞或 组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。
是动物细胞工程的基础。
分类：
细胞培养 组织培养 器官培养
中胚层细胞体外培养时一般表现为这一形式。如人胚肺细胞。
人的成纤维细胞
小鼠的成纤维细胞
人骨髓间充质细 胞（MSC）
成纤维细胞型
大鼠血管平滑肌细胞
成纤维型细胞
在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，
皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成 纤维细胞的形态相似而得名. 除真正的成纤维细胞 外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态 生长。
在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值.
4、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅
酶、核酸、激素、生长因子等。
5、无菌
培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要
条件。当细胞放臵于体外培养时，与体内相 比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力， 一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致 细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生 存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持 细胞生存的基本条件。
3、 气体
气体：需要O2、CO2 （95%空气、5% CO2） 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要
有氧气和二氧化碳.氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长
增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分.开放培养时 一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中.
二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它
1951年，Pomerat设计了细胞培养灌流小室技术，使细胞生活在不断
更新的培养液环境中，便于做细胞显微摄影和代谢等研究
1951年， 厄尔 （Earle） 发明了体外培养动物细胞的人工合成培养
基。
1952年．Gey建立了第一个人体细胞系，人体宫
颈癌Hela细胞系。
1960年，Barski等人在两种不同类型的细胞混合
一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类
似多角型或成纤维细胞形态。
如单核巨噬细胞系统的细胞中的颗粒型白细胞、淋巴细
胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。
体外培养的游走型细胞具有类似巨噬细胞
样的特征。主要是：单核巨噬细胞系统的 细胞，淋巴细胞，肿瘤细胞。
单
核
巨
噬
细
胞
1、游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成 片、形成群落； 2、细胞胞质常伸出伪足和突起。 3、生长位置不固定，呈游走和变形运动，速度快、 方向不规则。 4、细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。