遗传代谢性疾病的基因诊断
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? 现在：生化诊断 +基因诊断
宣恩县人民医院返检回验节科
基因诊断的概念
基因诊断就是利用现代分 子生物学和分子遗传学的技 术方法 ,直接检测基因结构及 其表达水平是否正常 ,从而对 疾病作出诊断的方法。
宣恩县人民医院返检回验节科
基因诊断的特点
? 针对性强 ? 特异性高 ? 灵敏度高 ? 适用性强 ? 诊断范围广
? 物质代谢包括合成代谢及分解代谢两个过程。 ? 代谢性疾病是物质代谢过程的紊乱，多为酶或蛋白
异常所致。
? 根据代谢一性、疾代病谢的性病疾因病，的可将分其类分为原发性和继发
性。
二、代谢性疾病的诊断手段
宣恩县人民医院返检回验章科
一、代谢性疾病的分类
原发性代谢性疾病： 又叫先天性代谢性疾病。是指当编码物质代谢所需酶
宣恩县人民医院返检回验节科
四、基因芯片技术
基因芯片技术 就是指将大量特定的靶基因片段或 寡核苷酸片段作为探针有序和高密度地排列固定 于玻璃和硅等固相载体上，然后检测与待测的不 同荧光标记样品基因按碱基配对的原理进行杂交， 通过激光共聚焦系统检测探针分子的杂交信号强 度，经计算机分析处理数据资料，获取不同样品 分子的数量和大量生物信息，从而可对基因序列 及功能进行大规模和高通量的研究。
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A
B
DNA Polymerase
ACCTTGAATTCGTCCTAGGA…… GGATCTT……
TT AA
dNTP Apyrase
(d)NMP
PPi ATP-sulphurylase
ATP Luciferase
Light
C
T
GC
A G TCA G TC AG TC A G TC
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第一节 基因诊断技术
一.DNA测序技术 二.聚合酶链反应技术 三.毛细管电泳技术 四.基因芯片技术
宣恩县人民医院返检回验章科
、DNA 测序技术
所有生物基因组序列的数 据均来自 DNA 测序 特点: ? 稳定简便 ? 自动化程度高 ? 数据准确可靠 ? 公认为国际金标准
基本流程： 第3步 ? 在ATP硫酸化酶的作用下，生成的 PPi可以和APS结合形
成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的 ATP又可以和荧光 素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过 CCD光 学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值高低则和相匹 配的碱基数成正比。
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基本流程： 第4步
一系列的核苷酸链。 ? 循环测序反应产物经沉淀、洗涤和纯化，从而去除多
余的未反应的 BigDye ? Terminators 。 ? 电泳与结果分析。
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宣恩县人民医院返检回验节科
焦磷酸测序技术
原理: 引物与模板 DNA退火后，在 DNA聚合酶、 ATP硫
酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等 4种酶 的协同作用下，将每一个 dNTP的聚合与一次荧光 信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度， 以荧光信号的形式实时记录模板 DNA的核苷酸序列。
DNA 序列
G
C
-
A GG CC T
GC
T
A
GC
T
核苷酸递增
宣恩县人民医院返检回验节科
焦磷酸盐测序法步骤
宣恩县人民医院返检回验节科
二、聚合酶链反应技术
PCR是体外酶促合成特异 DNA片段的方法。
? 四种主要成分： DNA模板、引物、 DNA 聚合酶和 dNTP。
? 三个反复步骤： 高温变性、低温退火和 适温延伸。
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三、毛细管电泳技术
? 毛细管电泳统指以高压电场为驱动力， 以毛细管为分离通道，依据试样中各组 分间淌度和分配行为上的差异来实现分 离的一类分离技术。
? 基本原理是根据在电场作用下离子迁移 的速度不同而对组分进行分离和分析。
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变性高效液相色谱 (DHPLC)是一种新的 高通量筛选 DNA序列变异的技术，其原 理是利用离子对反向高效液相色谱原理 , 通过一个 DNA分离柱，进行核苷酸片段 的分离和分析。
或蛋白的基因发生突变、不能合成或合成了无活性的 产物时，就会导致有关代谢途径不能正常运转，造成 具有不同临床表型的各种代谢缺陷病。 继发性代谢性疾病：
继发性代谢性疾病是由其它原发性疾病导致的代谢性 疾病，如糖尿病导致的继发性高脂血症。
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二、代谢性疾病的诊断手段
? 过去：主要依靠与物质代谢相关的各种酶的 生物化学方面的诊断
宣恩县人民医院返检回验节科
基本流程： 第1步 ? 一个特异性的测序引物和单链 DNA模板结合，然后加入
酶混合物(包括DNA Polymerase 、ATP Sulfurylase 、 Luciferase 和三磷酸腺苷双磷酸酶 Apyrase) 和底物混合 物(包括腺苷酰硫酸 APS和Luciferin) 。
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基本流程： 第2步
? 向反应体系中加入 1种dNTP，如果它刚好能和 DNA模板 的下一个碱基配对，则会在 DNA 聚合酶的作用下，添加 到测序引物的 3' 末端，同时释放出一个分子的焦磷酸 (PPi)。
(DNA)n+dNTP
聚合酶
(DNA)n+1+PPi
宣恩县人民医院返检回验节科
卫生部“十一五” 规划教材
全国高等医药教材建设研究会规划教材
第十九章 遗传代谢性疾病 的基因诊断
第三军医大学 府伟灵 黄庆
宣恩县人民医院退检出验科
主要内容
前言 一、基因诊断技术 二、遗传代谢性疾病的基因诊断
宣恩县人民医院检验科
前言
? 细胞、组织、器官和机体的生存与功能维持都必须 依赖不断进行的物质代谢过程。
? 反应体系中剩余的 dNTP和残留的少量 ATP在Apyrase的 作用下发生降解。
dNTP
ATP双磷酸酶
dNDP+dNMP+Pi
ATP
ATP双磷酸酶 ADP+AMP+Pi
宣恩县人民医院返检回验节科
基本流程： 第5步
? 加入另一种 dNTP，使 第2－4步反应重复进 行，根据获得的峰值 图即可读取准确的 DNA 序列信息
宣恩县人民医院返检回验节科
双脱氧链终止法
原理: ? 测序基础是以 ddNTP
为测序反应的链终止剂 ? 掺入到延伸链中的
ddNTP 可阻止后续 ddNTP 或dNTP 的掺入
宣恩县人民医院返检回验节科
宣恩县人民医院返检回验节科
示例：BigDye ? Terminators ? 循环测序反应扩增到未端为 BigDye ? Terminators 的
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基因诊断的概念
基因诊断就是利用现代分 子生物学和分子遗传学的技 术方法 ,直接检测基因结构及 其表达水平是否正常 ,从而对 疾病作出诊断的方法。
宣恩县人民医院返检回验节科
基因诊断的特点
? 针对性强 ? 特异性高 ? 灵敏度高 ? 适用性强 ? 诊断范围广
? 物质代谢包括合成代谢及分解代谢两个过程。 ? 代谢性疾病是物质代谢过程的紊乱，多为酶或蛋白
异常所致。
? 根据代谢一性、疾代病谢的性病疾因病，的可将分其类分为原发性和继发
性。
二、代谢性疾病的诊断手段
宣恩县人民医院返检回验章科
一、代谢性疾病的分类
原发性代谢性疾病： 又叫先天性代谢性疾病。是指当编码物质代谢所需酶
宣恩县人民医院返检回验节科
四、基因芯片技术
基因芯片技术 就是指将大量特定的靶基因片段或 寡核苷酸片段作为探针有序和高密度地排列固定 于玻璃和硅等固相载体上，然后检测与待测的不 同荧光标记样品基因按碱基配对的原理进行杂交， 通过激光共聚焦系统检测探针分子的杂交信号强 度，经计算机分析处理数据资料，获取不同样品 分子的数量和大量生物信息，从而可对基因序列 及功能进行大规模和高通量的研究。
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A
B
DNA Polymerase
ACCTTGAATTCGTCCTAGGA…… GGATCTT……
TT AA
dNTP Apyrase
(d)NMP
PPi ATP-sulphurylase
ATP Luciferase
Light
C
T
GC
A G TCA G TC AG TC A G TC
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第一节 基因诊断技术
一.DNA测序技术 二.聚合酶链反应技术 三.毛细管电泳技术 四.基因芯片技术
宣恩县人民医院返检回验章科
、DNA 测序技术
所有生物基因组序列的数 据均来自 DNA 测序 特点: ? 稳定简便 ? 自动化程度高 ? 数据准确可靠 ? 公认为国际金标准
基本流程： 第3步 ? 在ATP硫酸化酶的作用下，生成的 PPi可以和APS结合形
成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的 ATP又可以和荧光 素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过 CCD光 学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值高低则和相匹 配的碱基数成正比。
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基本流程： 第4步
一系列的核苷酸链。 ? 循环测序反应产物经沉淀、洗涤和纯化，从而去除多
余的未反应的 BigDye ? Terminators 。 ? 电泳与结果分析。
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焦磷酸测序技术
原理: 引物与模板 DNA退火后，在 DNA聚合酶、 ATP硫
酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等 4种酶 的协同作用下，将每一个 dNTP的聚合与一次荧光 信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度， 以荧光信号的形式实时记录模板 DNA的核苷酸序列。
DNA 序列
G
C
-
A GG CC T
GC
T
A
GC
T
核苷酸递增
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焦磷酸盐测序法步骤
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二、聚合酶链反应技术
PCR是体外酶促合成特异 DNA片段的方法。
? 四种主要成分： DNA模板、引物、 DNA 聚合酶和 dNTP。
? 三个反复步骤： 高温变性、低温退火和 适温延伸。
宣恩县人民医院返检回验节科
三、毛细管电泳技术
? 毛细管电泳统指以高压电场为驱动力， 以毛细管为分离通道，依据试样中各组 分间淌度和分配行为上的差异来实现分 离的一类分离技术。
? 基本原理是根据在电场作用下离子迁移 的速度不同而对组分进行分离和分析。
宣恩县人民医院返检回验节科
变性高效液相色谱 (DHPLC)是一种新的 高通量筛选 DNA序列变异的技术，其原 理是利用离子对反向高效液相色谱原理 , 通过一个 DNA分离柱，进行核苷酸片段 的分离和分析。
或蛋白的基因发生突变、不能合成或合成了无活性的 产物时，就会导致有关代谢途径不能正常运转，造成 具有不同临床表型的各种代谢缺陷病。 继发性代谢性疾病：
继发性代谢性疾病是由其它原发性疾病导致的代谢性 疾病，如糖尿病导致的继发性高脂血症。
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二、代谢性疾病的诊断手段
? 过去：主要依靠与物质代谢相关的各种酶的 生物化学方面的诊断
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基本流程： 第1步 ? 一个特异性的测序引物和单链 DNA模板结合，然后加入
酶混合物(包括DNA Polymerase 、ATP Sulfurylase 、 Luciferase 和三磷酸腺苷双磷酸酶 Apyrase) 和底物混合 物(包括腺苷酰硫酸 APS和Luciferin) 。
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基本流程： 第2步
? 向反应体系中加入 1种dNTP，如果它刚好能和 DNA模板 的下一个碱基配对，则会在 DNA 聚合酶的作用下，添加 到测序引物的 3' 末端，同时释放出一个分子的焦磷酸 (PPi)。
(DNA)n+dNTP
聚合酶
(DNA)n+1+PPi
宣恩县人民医院返检回验节科
卫生部“十一五” 规划教材
全国高等医药教材建设研究会规划教材
第十九章 遗传代谢性疾病 的基因诊断
第三军医大学 府伟灵 黄庆
宣恩县人民医院退检出验科
主要内容
前言 一、基因诊断技术 二、遗传代谢性疾病的基因诊断
宣恩县人民医院检验科
前言
? 细胞、组织、器官和机体的生存与功能维持都必须 依赖不断进行的物质代谢过程。
? 反应体系中剩余的 dNTP和残留的少量 ATP在Apyrase的 作用下发生降解。
dNTP
ATP双磷酸酶
dNDP+dNMP+Pi
ATP
ATP双磷酸酶 ADP+AMP+Pi
宣恩县人民医院返检回验节科
基本流程： 第5步
? 加入另一种 dNTP，使 第2－4步反应重复进 行，根据获得的峰值 图即可读取准确的 DNA 序列信息
宣恩县人民医院返检回验节科
双脱氧链终止法
原理: ? 测序基础是以 ddNTP
为测序反应的链终止剂 ? 掺入到延伸链中的
ddNTP 可阻止后续 ddNTP 或dNTP 的掺入
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示例：BigDye ? Terminators ? 循环测序反应扩增到未端为 BigDye ? Terminators 的