土壤微生物分离与纯化实验原理和方法
环境中微生物的检测和分离纯化
环境中微生物的检测和分离纯化一、实验目的：1.熟悉常用微生物培养基的配制方法。
2.学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物稀释分离、划线分离接种。
3.用平板划线法和稀释法分离微生物。
4.认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。
二、实验原理：（一）微生物的分离与纯化：土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此，土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离和纯化。
常用的是平板分离法。
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、温度和氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某些抑制剂，造成抑制其他菌生长而利于此菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物。
再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直至得到纯菌种。
（二）平板菌落计数法：平板菌落计数法是将样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。
此法缺陷：操作繁琐，结果需要培养一段时间才能取得，测定结果易受多种因素的影响。
此法优点：可以获得活菌的信息，被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等的含菌指数或污染程度的检测。
三、实验材料和仪器：土样10g，未知菌变形杆菌单菌落平板和无菌水。
取液器（5000ul、1000ul各一支），培养箱，培养皿（20个），无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，5000ul、1000ul无菌吸头，记号笔，酒精灯，火柴，试管架。
四、实验步骤：（一）培养基的制备（第二次实验时准备）：肉汤蛋白胨培养基：牛肉膏2g蛋白胨4gNaCl 2g蒸馏水400mL琼脂8g1. 称量：按上述配方称量各类物质。
实验五土壤中细菌纯种分离和培养
（二）培养
将前面制作的平板倒置于培养箱， 30℃培养24～48h，然后观察结果。
（三）挑菌纯化
在平板上选择分离较好的有代表性的单菌 落接种斜面，如果不纯，需进一步挑取此 菌落采取稀释平板法或划线分离法分离， 直至获得纯培养。
分离平板
五、注意事项
制备土壤稀释液时，要注意使土样均匀 分散在稀释液中。
♫将培养皿平放在桌上， 顺时针和反时针来回转 动培养皿，使培养基和 菌液充分混匀，冷凝后 即成平板（每组制培养 皿3套）。
③对 照 取“对照”的无菌培养皿，倒平板待
凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖。
2、平板划线分离法
（1）平板的制作
将融化并冷至约50℃的肉膏蛋白胨琼脂 培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平 板。
1、稀释平板分离法
（1）取样 选择较肥沃的土壤，铲去表土层，挖5-20cm 深度的或特殊要求的地方土壤，装入灭过菌 的袋内，封好袋口，做好编号记录，携回实 验室供分离用。
（2）制备土壤稀释液
◆ 将1瓶90mL和7管9mL的无菌水排列好，按 10-2、10-3、10-4、10-5及10-6依次编号。
（2）划线
用接种环挑取一环土壤悬液，左手拿培养 皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指 和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手 拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环 伸入培养皿内，在平板上轻轻划线（每组 做三皿）。
注意：切勿划破培养基
划线的方式可取图中任何一种
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
注意：在土壤稀释过程中，吸取不 同梯度的菌液需换用不同的吸管。
（3）平板的制作 ①吸取菌液：பைடு நூலகம்
用无菌移液管吸取菌 液于无菌培养皿内。
实验二：土壤中微生物分离与纯化
了解并掌握微生物的生理生化特征， 如营养需求、代谢途径、酶活性等。
微生物纯化
在分离的基础上，进一步通过反复划 线培养或平板克隆培养，获得纯培养 的微生物。
熟悉微生物分离与纯化的实验操作流程
土壤样本采集
选择具有代表性的土壤样本， 采集时要避免污染，并记录采
样点的环境信息。
微生物的纯化
对分离得到的菌落进行纯化， 通过反复划线或平板克隆培养 ，获得纯培养的微生物。
菌落形态观察
观察纯化后的菌落形态，记录菌落 特征。
微生物的保存与鉴定
菌种保存
将纯化的菌株进行冷冻干燥或甘油保 藏，以备后续实验使用。
微生物鉴定
采用形态学、生理生化实验或分子生 物学方法对分离得到的菌株进行鉴定 。
04
CATALOGUE
实验结果与分析
微生物分离与纯化的结果观察
微生物分离
通过划线分离法，成功将土壤中的微生物分离到了培养基上，观察到菌落形态 各养基
根据目标微生物的特性， 选择适合的培养基。
培养
将土壤稀释液涂布或滴加 在培养基上，放入恒温培 养箱中培养。
观察与记录
观察微生物的生长情况， 记录菌落形态、颜色、大 小等特征。
微生物的纯化
挑选单菌落
从培养基上挑选单菌落，采用划 线法或稀释涂布法进行纯化。
纯化培养
将纯化的菌株进行多次划线培养或 传代培养，确保获得纯培养物。
01
微生物纯化的原理是利用微生物的单一特性进行分离，使同一种微生物在培养 基上形成单一菌落。
02
常用的微生物纯化方法包括划线分离法、稀释涂布平板法、显微操作法等。这 些方法可以根据不同微生物的特性选择使用，以获得纯培养。
03
土壤中微生物实验报告
一、实验目的1. 了解土壤中微生物的种类和数量；2. 掌握土壤微生物的分离和纯化方法；3. 熟悉微生物的形态和生理生化特性；4. 培养无菌操作和实验记录能力。
二、实验原理土壤是微生物生活的良好环境，其中含有大量微生物，包括细菌、放线菌、真菌、藻类、原生动物、噬菌体、病毒和线虫等。
微生物在土壤中发挥着重要作用，如土壤肥力的维持、植物生长的促进、有机物的分解等。
本实验通过分离和纯化土壤微生物，观察其形态和生理生化特性，进一步了解土壤微生物的种类和功能。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖、酵母提取物、琼脂、无菌水、无菌平板、无菌移液器、显微镜、培养箱等。
2. 实验仪器：天平、酒精灯、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、无菌操作台等。
四、实验方法1. 土壤样品的采集：选取有代表性的土壤样品，注意样品的均匀性和代表性。
2. 土壤微生物的分离和纯化：a. 制备牛肉膏蛋白胨培养基，高压蒸汽灭菌后备用；b. 将土壤样品与无菌水按1:10的比例混合，充分搅拌；c. 将混合液进行系列稀释，取适量稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上；d. 将平板倒置放入恒温培养箱中培养，观察菌落生长情况；e. 挑取单个菌落进行纯化，重复以上步骤，直至获得纯菌株。
3. 微生物的形态观察：a. 将纯菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，培养后进行显微镜观察；b. 观察菌体的形态、大小、排列方式等特征。
4. 微生物的生理生化特性测定：a. 对纯菌株进行革兰氏染色，观察菌体的染色特性；b. 进行糖发酵试验，观察菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖类的分解能力；c. 进行氧化酶试验，观察菌株的氧化酶活性。
五、实验结果与分析1. 土壤样品的微生物数量：通过平板计数法，估算土壤样品中的微生物数量。
2. 微生物的分离和纯化：成功分离和纯化出多种微生物，如细菌、放线菌、真菌等。
3. 微生物的形态观察：观察到的菌体形态、大小、排列方式等特征与文献报道相符。
实验八、土壤微生物的分离和 纯化
实验八、土壤微生物的分离和纯化土壤微生物是指生长在土壤中的微弱的、微小的生物体，包括细菌、真菌、放线菌、原生动物等。
土壤微生物是土壤的重要组成部分，对维持土壤生态系统的平衡和功能发挥起着关键作用。
因此，对土壤微生物的分离和纯化具有重要意义。
本实验就是针对土壤微生物的分离和纯化进行研究。
一、实验原理由于土壤微生物数量繁多而多样，分离出单一的菌落对于此实验来说非常的困难。
但是采用适宜的富培养基后能够轻松的促进土壤微生物菌群的生长。
富培养基包括有机和无机元素、维生素、氨基酸、碳源和氮源。
地衣素琼脂（ISP）是一种富含多种碳源和氮源的优质菌落培养基，是常用的微生物培养基。
本实验的基本原理就是在能够生长的环境中分离出单一的菌落，通过多次分离和鉴定获得纯种菌株。
二、实验器材和试剂1.地衣素琼脂培养基2.试管、移液器、移菌环、烧灼器、电热蚊子香、灭菌器3.已经壳霉菌疫苗接种的贵州悬钩子种子和土壤三、实验步骤1.准备工作。
用移液器将壳霉菌疫苗接种在新的地衣素琼脂培养基板上，将其灭菌，以备之后的使用。
2.准备土壤基质。
将土壤样品剪碎成非常小的颗粒，并放入烧灼的试管中，加入恰当的地衣素酵母素琼脂，变形后形成一个接种板。
在较大的容器中放置电热器设备，以保持环境的湿度和温度适宜。
接下来，将接种板和采样站放在单独的区域以免混淆。
3.接种。
从土壤中取一小部分，倒入试管中，并加入适量的地衣素琼脂培养基，并将其摇动均匀，使菌群溢出。
等到土壤均匀地分散在地衣素琼脂培养基中之后，用移菌环扭曲并切出一个菌落，并将其置于新的地衣素琼脂培养基板中。
重复此步骤至少三次，每次都要将新的分离土壤菌落剪出来。
4.孵育。
将地衣素琼脂培养基板置于电热器设备中，以使温度保持在合适的范围内，并等待菌落的生长。
当新的菌落形成后，即可重复上述步骤以获得更多的菌株。
5.纯化。
检查菌落后，需要进行纯化。
鉴定每个菌落，把每个菌落分别悬浮在新的地衣素琼脂培养基板中，并等待菌落的生长。
实验二土壤微生物的分离鉴定
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5、初步鉴定 对菌体进行革兰氏染色观察，记录结果。
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注意事项
1. 制备土壤稀释液时，要注意应使土样均匀分散在稀释液中。 2. 2. 无菌操作。
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实验思考
1. 在平板划线法中，为何每次都需将接种环上的残余物烧掉？ 2. 为什么要涂布后的平板要先正放一段时间后再倒置培养？ 3. 怎么检验培养皿上的某个单菌落是不是纯培养？
的含待分离微生物的菌液，将其分别涂布在3个牛肉膏蛋白胨培 养基上，共有9个培养基平板，标号，37℃温箱培养24~48 h。
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4. 划线分离（划线培养） 对土壤稀释溶液微生物的培养基平板进行观察，记录区分明显
的细菌特征。挑取此细菌在新的培养基中划线培养（每种细菌培养 3个培养皿），标号，37°C温箱培养。
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（二） 土样
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实验步骤
1. 配制培养基
牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水
3g 10g 5g 15～20g 1000ml
调节pH 至7.2～7.4
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2）121℃灭菌2释液 称取10g土样，放入盛有90ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，
2. 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个 细胞繁 殖形成的。因此可通过挑取单菌落而获得纯培养的 微生物。获得单个菌落的途径可通过稀释涂布平板或平板划 线等方法来完成。
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实验器材
（一）
牛肉膏，蛋白胨， NaCl，琼脂；1mol/L NaOH， 1mol/L HCl； 三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，试管，离心管（50ml）培养皿， 电子天平，高压蒸汽灭菌锅，无菌操作台，恒温培养箱，移液 枪（枪头），pH试纸（pH 6.4~8.0）。
土壤微生物的分离和纯化实验
实验八土壤微生物的分离和纯化一、目的1.了解从土壤中分离与纯化微生物的基本原理及方法。
2.掌握几种常用的分离的基本操作技术。
二、原理在自然界中,土壤是微生物生活中的最适宜的环境,土壤中存在大量的微生物,但土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体,因此,为了研究某一微生物的特性,或者要大量地培养和利用某种微生物,必须把它们从这些混杂的微生物群中分离出来。
从而获得某一菌株的纯培养。
这种获得纯培养的方法称之为微生物的分离和纯化三、器材1.牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏l号培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基。
2.盛有100毫升无菌水的三角瓶,9毫升无菌水的试管,无菌吸管,无菌玻璃涂抹棒,10%的酚液,25%的乳酸,土样,接种环,标签。
四、方法(一)涂抹平板分离法1.制备土壤稀释液称取土样10克,放入装有玻璃珠和100毫升无菌水的三角瓶中,振摇15—20分钟,使土与水充分混合,将菌分散,静止片刻,用吸管从中吸取1毫升土壤悬液注人盛有9毫升无菌水试管中,吹吸三次,并振摇使之充分混匀,然后再吸取1毫升注入另一支盛有9毫升无菌水的试管中,以此类推制成10-1、10-2、l0-3、10-4、l0-5……的各种稀释度的土壤悬液。
2.倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基,高氏1号培养基,马铃薯蔗糖培养基溶化。
待冷至50—60℃时,在高氏l号培养基中加入10%酚2滴,在马铃薯蔗糖培养基中加入25%乳酸2滴,然后分别倒平板,每支培养基倒一皿(用右手持盛培养基的试管,左手拨出棉花塞,试管口在火焰上灭菌,然后左手将培养皿在火焰附近打开少许,迅速注入培养基,加盖后轻轻摇动培养皿使培养基均匀分布,平放在桌面上,待凝后即成平板。
(见图18)。
3.涂抹将上述每种培养基平板标上10-3、10-4、10-5稀释度,然后用无菌吸管分别从10-5、10-4、10-3稀释度的试管中吸取土壤悬液,每一平板注入0.2毫升,再用灭菌玻璃涂抹刮棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,静止5分钟。
微生物大实验 土壤中固氮微生物的分离与纯化
土壤中固氮微生物的分离与纯化一、实验目的1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。
2、学习微生物纯系分离、培养方法。
3、掌握划线分离纯化微生物的方法。
4、对提取的土样进行微生物的分离、纯化培养，并进行简单的形态鉴定5、了解该菌种的生物学特征。
二、实验原理农业生产不仅要求高产、稳产，而且要求品质优良。
长期以来，为确保农产品高产丰收，人们大量使用化学农药化肥，使得生态环境每况愈下，十分不利于农业可持续发展。
生物肥料由于具有增加土壤生物多样性、改善农产品品质、能自我更新增殖和永续利用的特性，其发展备受关注。
微生物肥料是指应用于植物或土壤环境中有生物活性，起肥料效用、或以肥料方法施用的，以微生物活性生物体或其代谢产物为主要作用因子的生物制剂或肥料制品[1]。
固氮菌可将空气中N2还原为可被作物吸收利用的NH4+，由于共生固氮菌具有宿主专一性，所以应用范围窄，而自生固氮菌不受这些因素限制，固氮能力较强，还能产生吲哚乙酸等植物激素，刺激植物生长，促进增产，其生产和使用很方便[3]。
因此，试验将从农田土壤中分离得到自生固氮菌，为研究开发新型生物氮肥提供理论依据。
通过土壤微生物的分离与计数及划线纯化，涂布分离长出的单菌落，须经划线纯化，再转斜面培养后保藏备用。
涂布分离细菌的平板，温箱培养1d～2d后，然后挑取各单菌落的部分培养物，在预先制备好的平板上划线纯化。
根据所得纯种菌，依次进行简单染色，革兰氏染色，芽孢染色，确定菌种的形态特征。
然后根据伯杰手册确定菌种的大体范围，有针对性的进行生理生化实验，从而最终确定菌种所在的属。
三、实验材料1．土样浙江理工大学百果园土壤2．培养基阿须贝培养基：葡萄糖10g，KH2PO4 0.2g，CaSO4 0.2g，NaCl 0.2g ，CaCO3 0.2g，MgSO40.2g ，1000mL水，pH 7.2无氮培养基：3．实验仪器超净工作台、恒温培养箱、微量移液枪、冰箱、电子天平、显微镜、酒精灯、试管、培养皿、锥形瓶、糖瓷杯、玻璃棒、接种环、棉塞、标签、打火机、酒精棉球、试管架、照相机等。
微生物分离与纯化实验报告
微生物分离与纯化实验报告微生物分离与纯化实验报告引言：微生物是一类极小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。
微生物的分离与纯化是微生物学研究中的重要步骤，它可以帮助研究者从复杂的微生物群落中获取纯种菌株，以便进一步研究其生理特性和应用价值。
本实验旨在通过分离与纯化微生物的实验操作，掌握微生物分离纯化的基本原理和方法。
材料与方法：1. 样品采集：从自然环境中采集样品，如土壤、水体等。
2. 稀释：将样品进行适当的稀释，以降低微生物的浓度，避免过于密集的菌落。
3. 培养基制备：制备适合微生物生长的培养基，如琼脂培养基、液体培养基等。
4. 涂布法分离：取适量的稀释液，用铁环或棉签均匀涂布在培养基表面。
5. 培养条件：将培养基培养于适宜的温度和湿度条件下，利于微生物生长。
6. 菌落观察：观察培养基上的菌落形态、颜色、大小等特征，选择目标菌落。
7. 纯化：将目标菌落进行传代培养，以获得纯种菌株。
结果与讨论：本实验采集了来自土壤样品的微生物，并进行了分离与纯化实验。
经过稀释和涂布法分离，我们观察到了多个菌落形成在琼脂培养基上。
根据菌落的形态、颜色和大小等特征，我们选取了几个目标菌落进行纯化。
经过传代培养，我们成功地获得了纯种菌株。
通过显微镜观察，我们发现这些菌株具有不同的形态特征。
有的菌株呈圆形，有的呈梭形，还有的呈链状。
这些形态特征与微生物的分类有关，也可以为进一步研究提供线索。
在纯化的过程中，我们还进行了一些生理特性的初步鉴定。
通过对菌株的代谢产物进行检测，我们发现其中一株菌株能够产生抗生素。
这为进一步研究该菌株的抗生素合成基因提供了方向。
微生物的分离与纯化在微生物学研究中具有重要的意义。
通过分离纯化，我们可以获得纯种菌株，进一步研究其生理特性、代谢产物和应用价值。
同时，纯化的菌株也可以用于微生物鉴定和分类，为微生物多样性研究提供数据支持。
结论：通过本实验，我们成功地进行了微生物的分离与纯化实验。
通过稀释和涂布法分离，我们获得了多个菌落，并通过纯化获得了纯种菌株。
土壤中微生物的分离与鉴定实验报告
Sdu微生物大实验土壤微生物的分离纯化与鉴定【实验目的】1、从各地区土壤中筛选含几丁质酶的真菌及含果胶酶的菌株；2、通过从土壤中分离纯化菌株，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的筛选、分离纯化方法和无菌操作技术。
3、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。
4、掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。
【实验原理】1、微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：a.选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。
b.微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。
微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。
前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。
2、霉菌：霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。
霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。
霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3-10μm ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。
观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本实验采用载玻片培养观察法。
3、果胶酶筛选培养基：配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。
刚果红（Congo Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。
实验一土壤中微生物的分离纯化
目录
• 引言 • 土壤样品采集与处理 • 微生物分离纯化方法 • 微生物培养条件与培养基选择 • 微生物鉴定与结果分析 • 实验注意事项与误差分析
01
引言
实验目的
分离土壤中的微生物
鉴定微生物
通过特定的培养条件，将土壤中的不 同种类微生物分离开来。
对分离纯化的微生物进行形态学、生 理生化特性等方面的鉴定。
废弃物处理
将实验废弃物分类收集，妥善处理，避免对 环境造成污染。
常见误差来源及减小误差方法
样品采集误差
试剂误差
确保采样工具干净，避免交叉污染；采样 点要具有代表性，避免偶然性误差。
使用优质试剂，确保试剂纯度和浓度准确 ；注意试剂保存条件和使用期限。
操作误差
设备误差
提高操作技能，减少操作失误；保持实验 环境稳定，避免外部因素干扰。
促进目标微生物的分离和纯化。
03
鉴别培养基
在基础培养基中加入某种试剂或化学物质，依据微生物代谢产生的某种
物质与特定试剂反应，产生明显的颜色变化或沉淀，从而鉴别不同种类
的微生物。
培养条件设置（温度、pH等）
温度
不同微生物对温度的需求不同，一般分为低温、中温和高温 微生物。在实验中，需根据目标微生物的生长温度要求，设 置相应的培养温度。
采样工具及容器准备
采样工具
使用无菌的铲子、勺子或土壤钻 等工具进行采样，避免交叉污染 。
容器准备
选择无菌的塑料袋、玻璃瓶或塑 料瓶等容器，确保容器干净、干 燥、密封性好。
采样方法及注意事项
01
02
03
04
去除表面杂质
去除土壤表面的植物残渣、石 块等杂质。
实验十二土壤中微生物的分离纯化
（三）平板菌落计数法的原理
将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上，经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度（一般选择每个平板上长有50-200个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适）。
由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自两个或多个细胞。因此，平板菌落记数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落形成单位取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。
实验十二 土壤中微生物的分离及纯化 （设计性实验）
此处添加副标题内容
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；
学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能。
初步观察来自土壤中的三大类群微生物的菌落形态特征；
一、目的要求
二、基本原理
土壤是微生物生存的大本营，所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的，原因是什么？ 由于土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。可以说，土壤是微生物的“天然培养基”，也是它们的“大本营”因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可与从中分离、纯化获得许多有价值的菌株。
从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征（产酸产气情况、染色情况、营养要求、氧气需求、酸碱度、渗透压和温度等）鉴定方能得到。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
微生物学 实验7 土壤中细菌的分离纯化及计数
交叉划线法
连续划线法
正置培养过程中，培养基中水分蒸发后，会在培养皿
计算公式：
平均菌落数(个) 相应释倍数 CFU/g 100mL 0.2mL 10 g
平均菌落数——某一稀释度下三个平皿上的菌落平均数； CFU——菌落形成单位（colony-forming units，CFU）； 0.2mL——每个平皿加入的菌悬液体积； 100mL——10-1菌悬液的体积； 10g——称取的土壤重量。
平板菌落计数法根据微生物在固体培养基上所形成的 菌落一般由一个细胞繁殖而成的原理进行。即一长成的菌 落代表一个活的细胞。计数时先将待测样品作一系列稀释， 使其中的微生物充分分散成单个细胞，再吸取一定量的稀 释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基 内，经培养单个细胞繁殖形成菌落，统计菌落数目即可计 换算出样品的含菌数。
菌落计数原则（六条）
1、先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个 平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应 以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌 落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其 余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的 菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该 稀释度的平均菌落数。
计算菌落总数方法举例（加样量为1mL）
例次 １ 不同稀释度的平均菌落数 10-1 1365 10-2 164 10-3 20 两个稀释 度菌落数 之比 － 菌落总数 （个／mL） 1.64×104 备注
２ ３
４ ５
2760 2890
无法计数 27
295 271
1650 11
46 60
513 5
1.6 2.2
4、若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应 按稀释度(倍数)最高的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例4）。
土壤分离细菌实验报告
一、实验目的1. 掌握土壤中细菌的分离和纯化方法。
2. 学习观察和描述细菌的形态特征。
3. 了解细菌在不同培养基上的生长情况。
二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，其中含有丰富的细菌。
细菌分离和纯化是微生物学实验中常用的基本技术。
本实验通过土壤稀释涂布平板法，将土壤中的细菌分离出来，并在选择培养基上进行纯化。
通过对纯化后的细菌进行观察和描述，了解细菌的形态特征。
三、实验材料与仪器1. 材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、伊红美蓝培养基、无菌水、无菌滤纸、无菌镊子、无菌接种环、酒精灯、培养皿、显微镜等。
2. 仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、移液器、电子天平、接种箱等。
四、实验方法1. 土壤样品的采集：在实验地点采集土壤样品，注意避免污染。
2. 土壤样品的稀释：将土壤样品与无菌水按一定比例混合，进行系列稀释。
3. 涂布平板：将稀释后的土壤样品涂布在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每个稀释度涂布3个平板。
4. 培养与观察：将涂布好的平板放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。
5. 挑取单菌落：在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，挑选生长良好的单菌落，进行纯化。
6. 纯化：将挑取的单菌落划线接种在伊红美蓝培养基平板上，37℃培养24小时。
7. 观察与描述：观察纯化后的细菌在伊红美蓝培养基上的生长情况，描述细菌的形态特征。
8. 结果分析：根据细菌的形态特征，对分离得到的细菌进行初步鉴定。
五、实验结果与分析1. 土壤样品的稀释：通过系列稀释，将土壤样品中的细菌浓度降低，便于分离和纯化。
2. 涂布平板：涂布平板是分离细菌的重要步骤，保证菌落单一生长。
3. 培养与观察：经过24小时的培养，观察到的菌落为细菌。
4. 挑取单菌落：通过挑取单菌落，实现细菌的纯化。
5. 纯化后的细菌在伊红美蓝培养基上的生长情况：细菌在伊红美蓝培养基上形成黑色或紫色菌落。
6. 结果分析：根据细菌的形态特征，初步鉴定分离得到的细菌为革兰氏阴性菌。
六、实验总结1. 通过本实验，掌握了土壤中细菌的分离和纯化方法。
实验四 土壤微生物的分离与纯化
稀释涂板：新鲜土壤。 实验材料：新鲜土壤。 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏 一号培养基、马铃薯蔗糖培养基。 一号培养基、马铃薯蔗糖培养基。 实验仪器与用具 ∗ 无菌水：带有玻璃珠装有 无菌水：带有玻璃珠装有90ml无菌水三角瓶、 无菌水三角瓶、 无菌水三角瓶 装有9mL无菌水的试管。 无菌水的试管。 装有 无菌水的试管 ∗ 其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、 其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、 电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴等。 电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴等。
高氏一号培养基
∗ 用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方 用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。 如下： 如下： 20.0g 可溶性淀粉 ∗ KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4• 7H2O 0.5g ∗ NaCl 0.5g FeSO4• 7H2O 0.01g pH 7.4~7.6 20g 琼脂 1000mL 自来水 灭菌： 灭菌： 1.05kg/cm2 30min
制备无菌水
∗ 无菌水为下一次微生物分离实验中所需要的材 料。 ∗ 250mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水 三角烧瓶（ ），装自来水 三角烧瓶 装有玻璃珠）， 45mL，试管中装 自来水， ，试管中装9.0mL自来水，塞上棉塞，包 自来水 塞上棉塞， 灭菌备用。 扎、灭菌备用。
物品的准备
∗ 三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等的包扎准备。 三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等的包扎准备。
一实验目的土壤是微生物生活的大本营为了获得某种微生物的纯培养一般是根据该微生物对营养酸碱度氧等条件要求不同而供给它适宜的培养条件或加入某种抑制剂淘汰其他一些不需要的微生物再用各种方法分离纯化该微生物直至得到纯菌二实验原理稀释涂板法稀释混合平板法划线分离培养基
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土壤微生物分离与纯化实验原理和方法
一、实验目的
了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计
数的技能。
二、实验原理
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平
板计数法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。
菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，
一般细菌则采用彼得罗夫· 霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。
两
种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个
平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边
上面各有一个计数区（图 21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数
区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个
小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。
但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1
/400mm2。
盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的
体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1 /4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换
算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3
所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小
方格，即系数K=4×106 。
因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系
数（K）×菌液稀释倍数（d）
三、实验器材
1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。
2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、
计数器、滴管、擦镜纸。
四、实验方法
1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），
以每小格的菌数可数为度。
2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的
沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液
体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流
出的多余菌悬液。
也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数
区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。
然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。
4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计
数区后，再转换高倍镜观察并计数。
由于生活细胞的折光率和水的折
光率相近，观察时应减弱光照的强度。
5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、
左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。
如果是25个大
方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的
菌数（即80个小格）。
如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线
不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个
菌体计算。
每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则
应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每
ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。
7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬
物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。
洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。