微生物学教案

3、固体培养基分离纯培养物的基本方法和原理
纯培养指的是只有一种微生物组成的细胞群体。

自然环境中微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物的基本原理：首先采用方法将单个的细胞与其他细胞分离开，进而提供细胞合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。

进行微生物的分散主要采用稀释的方法，而固体培养基由于能够使分散的细胞固着于一定的位置，与其他的细胞分离，从而生长成为一个单细胞来源的群体－即纯培养，而成为常用而简便的分离介质和营养介质。

固体培养基分离纯培养物由于稀释方法的差异和接种平板的方式差异而分为以下几种方法：
（1）划线平板法
将合适的无菌培养基倒入无菌培养皿中，冷却后制备成平板，按以下方法划线：
平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中，产生的单个细胞在培养基表面生长的后代就是纯培养物。

（2）倾注平板法和涂布平板法
这两种方法的共同点就是在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，最常用的液体稀释方法为10倍系列稀释，参考下图：
随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。

染色操作的基本程序为：
制片，干燥，固定，染色，水洗，干燥，镜检。

ˉ
革兰氏染色（于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。

）
结晶紫初染，碘液媒染，酒精脱色，番红复染。

教案三
第三章：微生物细胞的结构与功能
第一节：原核微生物
1、微生物的主要类群：
2、原核微生物
指细胞核无核膜包裹，只存在由裸露DNA组成的核区（nuclear region) 的原始单细胞生物。

主要类群包括细菌与古生菌。

细菌又称真细菌（eubacteria），包括普通细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体和衣原体等 (三菌三体）。

古生菌，在进化谱系上与真细菌及真核生物相互并列，且与后者关系更近，而其细胞构造却与真细菌较为接近，同属于原核生物。

3、细菌细胞的基本形态
基本形态：球状、杆状、螺旋状和其他形状。

球状菌：细胞个体呈球形或椭圆形，球菌在细胞分裂时形成的不同空间排列方式，常被作为分类依据。

杆状菌：细胞呈杆状或圆柱形，一般其粗细（直径）比较稳定，可作为分类依据；而长度和排列方式常因生长阶段和培养条件不同而发生较大变化，一般不作为分类依据。

螺旋状：包括（1）弧菌，其菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，形似“C”字或逗号，鞭毛偏端生。

（2）螺菌, 菌体回转如螺旋，螺旋数目和螺距大小因种而异(1-20)。

鞭毛二端生。

细胞壁坚韧，菌体较硬。

（3）螺旋体菌,菌体柔软，螺旋数目因种而异(3-70)。

用于运动的类似鞭毛的轴丝位于细胞外鞘内。

其它形状：包括柄杆菌、星形细菌、方形细菌及各种条件下细胞正常发育受阻而产生的异常形态
4、细菌细胞的大小
一般细菌大小的度量单位为微米（micrometer, μm），目前发现的细菌中最小的与无细胞结构的病毒相仿（约50 nm）；最大的肉眼可见（ mm）。

一般细菌的大小范围：球菌， ~ 1μm （直径）；杆菌~ 1μm （直径）× 1~ 80μm（长度）；螺旋菌~ 1 mm （直径）× 1~ 50 mm（长度）(长度是菌体两端点之间的距离，而非实际长度)。

5、细菌细胞的基本结构
6、细胞壁的主要功能
①固定细胞外形和提高机械强度，从而使其免受渗透压等外力的损伤。

②为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需。

失去了细胞壁的原生质体，也就丧失了这些重要功能；
③阻拦酶蛋白和某些抗生素等大分子物质（分子量大于800）进入细胞，保护细胞免受溶菌酶、消化酶和青霉素等
有害物质的损伤；
④赋予细菌具有特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性。

7、革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）细菌细胞壁的化学组成和结构特点
革兰氏阳性（G+）菌细胞壁特点：厚度大（20~80nm），化学组分简单，一般只含90%肽聚糖和10%磷壁酸。

肽聚糖是真细菌细胞壁中的特有成分。

磷壁酸为革兰氏阳性细菌细胞壁中特有的一种酸性多糖。

革兰氏阴性（G-）细菌细胞壁特点结构分为肽聚糖层和外膜层。

其特点是肽聚糖层薄 (2-3nm)，层次多，化学组分复杂，强度低。

8、肽聚糖单体的化学组成和结构
肽聚糖单体中的化学组成：①双糖单位，由由N-乙酰胞壁酸（NAM or M）和N-乙酰葡萄糖胺（NAG or G）l两种单糖之间以β-1,4-糖苷键[ M(1)-G(4)]连接形成。

该糖苷键很容易被溶菌酶 (lysozyme) 所水解，从而引起细菌因肽聚糖细胞壁的“散架”而死亡。

双糖单位是肽聚糖中糖链骨架的基本结构单位。

②四肽侧链，由四个氨基酸分子按
L型与D型交替方式连接而成，连接于糖骨架的N-乙酰胞壁酸分子上。

③肽桥连接一条肽侧链的4位氨基酸和另一条肽侧链的3位氨基酸，变化多样，是不同微生物肽聚糖多样性的基础。

目前所知的肽聚糖已超过100种，主要的变化发生在肽桥上。

（附结构示意图）
9、磷壁酸
革兰氏阳性细菌细胞壁上特有的化学成分，主要成分为甘油磷酸或核糖醇磷酸。

膜磷壁酸(又称脂磷壁酸)跨越肽聚糖层并与细胞膜相交联的，由甘油磷酸链分子与细胞膜上的磷脂进行共价结合后形成。

其含量与培养条件关系不大。

可用45%热酚水提取，也可用热水从脱脂的冻干细菌中提取。

壁磷壁酸，它与肽聚糖分子间进行共价结合，含量会随培养基成分而改变，一般占细胞壁重量的10%，有时可接近50%。

用稀酸或稀碱可以提取。

磷壁酸的主要生理功能 (p41)
①其磷酸分子上较多的负电荷可提高细胞周围Mg2+的浓度，进入细胞后就可保证细胞膜上一些需Mg2+的合成酶提高活性；
②贮藏磷元素；
③增强某些致病菌如A族链球菌(Streptococcus)对宿主细胞的粘连、避免被白细胞吞噬以及抗补体的作用；
④赋予革兰氏阳性细菌以特异的表面抗原；
⑤可作为噬菌体的特异性吸附受体；
⑥能调节细胞内自溶素(autolysin)的活力，借以防止细胞因自溶而死亡。

因为在细胞正常分裂时，自溶素可使旧壁
适度水解并促使新壁不断插入，而当其活力过强时，则细菌会因细胞壁迅速水解而死亡。

10、革兰氏阴性细菌的细胞壁
（1）肽聚糖
它的肽聚糖埋藏在外膜层之内，是仅由1~2层肽聚糖网状分子组成的薄层(2~3nm)，含量约占细胞壁总重的10%，故对机械强度的抵抗力较革兰氏阳性菌弱。

四肽尾的第3个氨基酸不是L-lys，而是内消旋二氨基庚二酸(m-DAP)，一种只有在原核微生物细胞壁上才有的氨基酸。

没有特殊的肽桥，其前后两个单体间的连接仅通过甲四肽尾的第4个氨基酸——D-ala的羧基与乙四肽尾的第3个氨基酸——mDAP的氨基直接相连 ,只形成较为疏稀、机械强度较差的肽聚糖网套。

（2）外膜
位于革兰氏阴性细菌细胞壁外层，由脂多糖、磷脂和脂蛋白等若干种蛋白质组成的膜，有时也称为外壁。

a 脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）
位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚（8~10nm）的类脂多糖类物质，由类脂A、核心多糖(core polysaccharide)和O-特异侧链（O-specific side chain，或称O-多糖或O-抗原）三部分组成。

Man, mannose, 甘露糖
Abe, abequose, β-脱氧岩藻糖
Rha, rhamnose,鼠李糖
Gal, galactose, 半乳糖
Glu, glucose, 葡萄糖
（1）假肽聚糖(pseudopeptidoglycan)细胞壁：代表菌——甲烷杆菌属( Methanobacterium )。

（2）独特多糖细胞壁：代表菌——甲烷八叠球菌( Methanosarcina )
（3）硫酸化多糖细胞壁：代表菌——盐球菌（Halococcus）
（4）糖蛋白(glycoprotein)：代表菌——盐杆菌属( Halobacterium)
（5）蛋白质细胞壁：有的是由几种不同蛋白组成，如甲烷球菌( Methanococcus )和甲烷微菌( Methanomicrobium )；有的则由同种蛋白的许多亚基组成，甲烷螺菌属( Methanospirillum )。

12、缺壁细菌
（1）L型细菌（L-form of bacteria）：细菌在某些环境条件下（实验室或宿主体内）通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷变异型。

因英国李斯德（Lister）预防研究所首先发现而得名（1935年，念珠状链杆菌Streptobacillus moniliformis）。

大肠杆菌、变形杆菌、葡萄球菌、链球菌、分枝杆菌和霍乱弧菌等20多种细菌中均有发现，被认为可能与针对细胞壁的抗菌治疗有关。

特点：没有完整而坚韧的细胞壁，细胞呈多形态；有些能通过细菌滤器，故又称“滤过型细菌”；对渗透敏感，在固体培养基上形成“油煎蛋”似的小菌落（直径在左右）；
（2）原生质体（protoplast）
在人为条件下，用溶菌酶处理或在含青霉素的培养基中培养而抑制新生细胞壁合成而形成的仅由一层细胞膜包裹的，圆球形、对渗透压变化敏感的细胞，一般由革兰氏阳性细菌形成。

特点：对环境条件变化敏感，低渗透压、振荡、离心甚至通气等都易引起其破裂；比正常有细胞壁的细菌更易导入外源遗传物质，是研究遗传规律和进行原生质体育种的良好实验材料。

（3）球状体(sphaeroplast)? ，又称原生质球
采用上述同样方法，针对革兰氏阴性细菌处理后而获得的残留部分细胞壁（外壁层）的球形体。

与原生质体相比，
它对外界环境具有一定的抗性，可在普通培养基上生长。

（4）枝原体(Mycoplasma)
在长期进化过程中形成的、适应自然生活条件的无细胞壁的原核生物。

因它的细胞膜中含有一般原核生物所没有的甾醇，所以即使缺乏细胞壁，其细胞膜仍有较高的机械强度。

13、细菌细胞膜的特点
细胞质膜是紧贴在细胞壁内侧、包围着细胞质的一层柔软、脆弱、富有弹性的半透性薄膜，厚约7～8nm，由磷脂（占20%～30%）和蛋白质（占50%～70%）组成。

膜蛋白包括具运输功能的整合蛋白）或内嵌蛋白；具有酶促作用的周边蛋白或膜外蛋白等。

细菌细胞膜是一个重要的代谢活动中心，其膜蛋白约占细菌细胞膜的50%～70%，比任何一种生物膜都高，而且种类也多。

真核生物细胞膜中一般含有胆固醇等甾醇，含量为5%-25%。

原核生物与真核生物的最大区别就是其细胞膜中一般不含胆固醇，而是含有（hopanoid）。

由磷脂分子形成的双分子膜中加入甾醇类物质可以提高膜的稳定性。

14、细菌细胞膜的生理功能
①选择性地控制细胞内、外的营养物质和代谢产物的运送；
②是维持细胞内正常渗透压的屏障；
③合成细胞壁和糖被的各种组分（肽聚糖、磷壁酸、LPS、荚膜多糖等）的重要基地；
④膜上含有氧化磷酸化或光合磷酸化等能量代谢的酶系，是细胞的产能场所；
⑤是鞭毛基体的着生部位和鞭毛旋转的供能部位.
15、古生菌的细胞质膜——重点在于其独特性和多样性
在本质上也是由磷脂组成，但它比真细菌或真核生物具有更明显的多样性。

•亲水头（甘油）与疏水尾（烃链）间是通过醚键而不是酯键连接的；
②组成疏水尾的长链烃是异戊二烯的重复单位（如四聚体植烷、六聚体鲨烯等），它与亲水头通过醚键连接成甘油二醚（glycerol diether）或二甘油四醚(diglycerol tetraether)等，而在真细菌或真核生物中的疏水尾则是脂肪
17、细菌芽孢
（1）基本概念：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体，称为芽孢（endospore或spore，偶译“内生孢子”）。

产芽孢的细菌多为杆菌，也有一些球菌。

芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分类和鉴定中的重要指标。

（2）芽孢的构造
（3）芽孢的形成与萌发
芽孢形成的7个阶段：轴丝形成；隔膜形成，产生前孢子；前孢子被吞没，双层膜形成，抗辐射力提高；皮层形成；芽孢衣形成；孢衣完成，折光性和抗热性增强-芽孢成熟；芽孢囊裂解，成熟芽孢释放。

由休眠状态的芽孢变成营养状态细菌的过程，称为芽孢的萌发。

包括活化(activation)、出芽(germination)和生长(outgrowth)3个阶段。

4）芽孢的耐热机制
渗透调节皮层膨胀学说：芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差，皮层的离子强度很高，产生极高的渗透压夺取芽孢核心的水分，结果造成皮层的充分膨胀。

皮层含水量约70%，核心部分的细胞质高度失水含水量极低（10%～25%），因此，具极强的耐热性。

其他学说：针对在芽孢形成过程中会合成大量的为营养细胞所没有的DPA-Ca，不少学者提出Ca2+与DPA的螯合作用会使芽孢中的生物大分子形成一种稳定而耐热性强的凝胶。

总之，有关芽孢耐热机制是一个重要的有待进一步深入研究的基础理论问题。

5）伴孢晶体（parasporal crystal）
少数芽孢杆菌，例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体——δ内毒素，称为伴孢晶体。

它的干重可达芽孢囊重的30%左右，由18种氨基酸组成。

伴孢晶体对200多种昆虫尤其是鳞翅目的幼虫有毒杀作用。

6）芽孢研究意义
①芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分类、鉴定中的重要形态学指标；
②利用芽孢的耐热特性，提高芽孢产生菌的筛选效率；
③芽孢是细菌的休眠体，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞；
芽孢菌的长期保藏
④芽孢是抗逆性最强的生命体，是否能消灭芽孢是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。

肉毒梭菌（Clostridium botulinum）产生肉毒素， pH＞时在100℃下要煮沸～；115℃下进行加压蒸汽灭菌，需10～40min才能杀灭；121℃下则仅需10min。

这就要求食品加工厂在对肉类罐头进行灭菌时，应掌握在121℃下维持20min 以上。

破伤风梭菌(Clostridium tetani)产生破伤风毒素，121℃灭菌10min或115℃下灭菌30min才可。

18、糖被
包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的胶状物质，称为糖被。

糖被按其有无固定层次、层次厚薄又可细分为荚膜、微荚膜、粘液层和菌胶团糖被的化学成分：
荚膜的功能
①保护作用：¨其上大量极性基团可保护菌体免受干旱损伤；
¨防止噬菌体的吸附和裂解；
¨一些动物致病菌的荚膜还可保护它们免受宿主白细胞的吞噬；
¨作为透性屏障或（和）离子交换系统，可保护细菌免受重金属离子的毒害；
②贮藏养料，以备营养缺乏时重新利用；
③表面附着作用
细菌糖被的研究意义
1、营养菌丝(基内菌丝、基丝、初级菌丝体)：匍匐生长于培养基内，吸收营养，一般无隔膜，不断裂，直径 mm，长度差别很大，有的可产生色素。

2、气生菌丝(二级菌丝体)：营养菌丝发育到一定阶段，伸向空间形成气生菌丝，叠生于营养菌丝上，可覆盖整个菌落表面。

在光学显微镜下观察，颜色较深，直径较粗（ mm），有的产色素。

3、孢子丝：气生菌丝发育到一定阶段，其上可分化出形成孢子的菌丝，即孢子丝，又称产孢丝或繁殖菌丝。

孢子丝形状和排列方式因种而异，常被作为对放线菌进行分类的依据。

绝大部分菌具有生长发育良好的菌丝体，以孢子进行繁殖，菌落特征类似于霉菌。

4、孢子：孢子形状有圆形、椭圆形、杆状或柱形, 不稳定；孢子表面形状：光滑、瘤状、鳞片状、刺状、毛发状，稳定。

孢子的形状、颜色和表面纹饰是分类的特征之一。

22、放线菌的生长与繁殖
孢子在适宜的条件下萌发，长出1-3个芽管，形成营养菌丝，渐次分化出气生菌丝和繁殖菌丝（孢子丝），孢子丝释放孢子。

教案四
真核微生物
1、真核生物
凡是细胞核具有核膜、能进行有丝分裂、细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等细胞器的生物，称为真核生
物。

具有上述特征的微小生物，称为真核微生物。

真核微生物包括真菌，单细胞藻类和原生动物。

真菌的主要类群有酵母、霉菌和蕈菌。

真菌的特点为：
（1）具有细胞核，进行有丝分裂；
（2）细胞质中含有线粒体但没有叶绿体，不进行光合作用，无根、茎、叶的分化；
（3）以产生有性孢子和无性孢子二种形式进行繁殖；
（4）营养方式为化能有机营养（异养）、好氧；
（5）不运动（仅少数种类的游动孢子有1-2根鞭毛）；
（6）种类繁多，形态各异、大小悬殊，细胞结构多样。

2、酵母(yeast)
酵母菌是一群单细胞的真核微生物。

通常指以芽殖或裂殖来进行无性繁殖的单细胞真菌，以区分霉菌。

有些可产生子囊孢子进行有性繁殖。

3、酵母的形态与结构
个体细胞形态：卵圆、圆、圆柱、梨形等单细胞，其细胞直径一般比细菌粗10倍左右。

有的酵母菌子代细胞连在一起成为链状，称为假丝酵母。

其细胞的模式构造见下图：
酵母的群体——菌落形态：与细菌菌落类似，但一般较细菌菌落大且厚，表面湿润，膏状，易被挑起。

菌落质地均匀，颜色一致。

多为乳白色，少数呈红色，黑色（褐色）。

一般有悦人的香味。

4、酵母细胞壁结构
酵母菌细胞壁的厚度为25～70nm，重量约占细胞干重的25%，主要成分为葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和少量几丁质、少量脂质。

它们在细胞壁上自外至内的分布次序是甘露聚糖、蛋白质、葡聚糖。

蜗牛酶中含有纤维素酶，甘露聚糖酶，葡糖酸酶，几丁质酶和脂酶等30多种酶，可水解酵母菌细胞壁，制备酵母原生质体，或者水解子囊壁，释放子囊孢子。

5、酵母的液泡
液泡内含有一些水解酶代谢中间产物，金属离子，聚磷酸，类脂等物质；其功能储存营养物，如糖原和脂肪；含有多种酶类，如蛋白酶、核酸酶、纤维素酶等；持细胞渗透压。

6、酵母的生长繁殖
（1）无性繁殖
①芽殖，是酵母主要的无性繁殖方式，成熟细胞长出一个小芽，到一定程度后脱离母体继续长成新个体。

②裂殖：少数酵母菌可以象细菌一样借细胞横割分裂而繁殖，例如裂殖酵母。

③无性孢子：某些酵母菌可以产生芽孢子(假丝酵母)，掷孢子(掷孢酵母)，厚壁孢子(假丝酵母)等无性孢子进行繁殖。

（2）有性繁殖
酵母菌以形成子囊和子囊孢子的形式进行有性繁殖，其过程为：①两个性别不同的单倍体细胞靠近，相互接触；
②接触处细胞壁消失，两个细胞的细胞质融合，称为质配；③两个细胞的细胞核融合，形成二倍体核，称为核配。

二倍体核进行减数分裂时，形成4个或8个子囊孢子，而原有的营养细胞就成为子囊。

子囊孢子萌发形成单倍体营养细胞。

7、霉菌——丝状真菌
霉菌（mold）是一些“丝状真菌”的统称，不是分类学上的名词。

霉菌菌体均由分枝或不分枝的菌丝（hypha）构成。

许多菌丝交织在一起，称为菌丝体（mycelium）。

8、霉菌细胞壁结构
如图所示：
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四层真菌细胞壁结构：A，细胞膜；B，几丁质（甲壳质）微纤维镶嵌在无定形的蛋白质、甘露糖和糖原组分中；C，不连续蛋白质层；D，糖蛋白层；E，不定形糖原层。

9、霉菌的鞭毛结构
鞭毛：“9+2”结构，微管二联体。

10、霉菌的菌丝类型：
如图所示：
（a）无隔膜菌丝：整个菌丝为长管状单细胞，细胞质内含有多个核。

其生长过程只表现为菌丝的延长和细胞核的裂殖增多以及细胞质的增加。

(b) 有隔膜菌丝：菌丝由横隔膜分隔成成串多细胞，每个细胞内含有一个或多个细胞核。

有些菌丝，从外观看虽然像多细胞，但横隔膜上有小孔，使细胞质和细胞核可以自由流通，而且每个细胞的功能也都相同。

11、霉菌的菌丝形态：
霉菌菌丝分为：营养菌丝、气生菌丝、繁殖菌丝。

霉菌菌丝直径约为2~10um，比一般细菌和放线菌菌丝大几到几十倍
12、菌丝的特化
营养菌丝和气生菌丝对于不同的真菌来说，在它们的长期进化过程中，对于相应的环境条件已有了高度的适应性，并明显地表现在产生各种形态和功能不同的特化结构上。

也称菌丝的变态。

（1）特化的营养菌丝
①假根，匍匐菌丝：类似树根，吸收营养；匍匐延伸。

②吸器：一些专性寄生真菌从菌丝上分化出来的旁枝，侵入细胞内分化成指状、球状或丝状，用以吸收细胞
养基上不常见。

2）有性繁殖方式因菌种不同而异，有的两条营养菌丝就可以直接结合，有的则由特殊的性细胞（性器官）----配子囊或由配子囊产生的配子来相互交配，形成有性孢子。

3）核配后进行减数分裂，因此菌体染色体数目为单倍，双倍体只限于接合子。

14、异核现象和准性生殖
有一些霉菌，至今尚未发现其生活史中有有性繁殖阶段，这类真菌称为半知菌。

异核现象：即不同类型的核存在于同一个体的现象。

异核现象来源：由两个不同基因型核的菌丝融合而成；或者菌丝中少数细胞核突变；或者少数单倍体核融合成二倍体核。

异核现象是许多霉菌，尤其是半知菌存在的一种普遍现象。

由于没有发现半知菌的有性生殖，所以异核现象成为这类型真菌遗传重组的一个重要机制。

一旦异核体形成，准性生殖重组就有可能发生。

准性生殖(无性重组)过程：①质配：异核现象；②核配：双倍体化；③单倍体化：一系列有丝分裂中一再发生的个别染色体的减半，直至最终形成单倍体的过程。

频率低10-5-10-7，区别于减数分裂。

15、霉菌的菌落特征
由粗而长的分枝状菌丝组成，菌落疏松，呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状，表面有颗粒状孢子比细菌菌落大几倍到几十倍，有的没有固定大小。

各种霉菌，在一定培养基上形成的菌落大小、形状、颜色（营养菌丝和孢子堆表现出不同的颜色）等相对稳定，所以菌落特征也为分类依据之一。

根霉曲霉青霉
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教案五。