lipo2000转染操作步骤
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤转染是指将外源DNA或RNA导入到目标细胞中的过程，LIPOFECTAMINE2000是一种常用的转染试剂。
下面是使用LIPOFECTAMINE2000进行转染的详细步骤：步骤一：细胞处理1.1培养要转染的细胞株，并确保细胞达到70%-80%的密度。
1.2使用无菌PBS洗涤细胞，将细胞悬浮于含有10%FBS的完全培养基中。
1.3通过计数细胞数来得到适当的细胞密度，以确保每个孔或皿中有足够的细胞进行转染。
步骤二：DNA/RNA和转染试剂的配制2.1在无菌离心管中配制DNA/RNA和转染试剂的混合液。
按照试剂的说明书中的推荐比例将DNA/RNA和转染试剂混合在一起，并使用无菌PBS 或者培养基和其它试剂进行稀释。
2.2轻轻摇晃混合液，避免产生气泡。
步骤三：转染3.1将配制好的转染混合液加入到每个孔或皿中，并轻轻摇晃培养皿/板使其均匀分布。
3.2将细胞和转染试剂混合液共孵育4-6小时，在37℃的CO2培养箱中进行转染反应。
转染时间可以根据目标细胞的特性进行调整。
步骤四：更换培养基4.14-6小时后，将转染混合液完全去除，并用预温热的完全培养基洗涤细胞，以去除未吸附的DNA/RNA和转染试剂。
4.2加入足够的完全培养基来覆盖细胞，尽量减少液体涡流，以避免对转染效率的不良影响。
步骤五：细胞培养和分析5.1将培养皿/板放回37℃的CO2培养箱中，并进行适当的培养条件。
5.2根据实验需要的时间点收集转染后的细胞进行后续的实验和分析。
需要注意的是，转染步骤中的各种参数（例如细胞密度、转染试剂的浓度和比例等）可能因不同的实验目的和目标细胞而有所不同。
因此，在具体操作中请参考所使用转染试剂和目标细胞的说明书，并根据实验需要进行相应的优化。
lipo转染操作步骤
L i p o2000瞬时转染细胞步骤Stealth?RNAiorsiRNATransfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。
B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将AB两管混合，放置20min。
3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
PlasmidDNATransfectionDNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1中板。
贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。
2转染。
A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。
B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将AB两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cmdish细胞质粒转染量4-6ug足以。
Opti-MEM?I减血清培养基是EMEM的改良型,其中使用了HEPES和碳酸氢钠进行缓冲,并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、痕量元素和生长因子.常用其作为无血清培养基与质粒和lip2000分别混合。
lipofectamine 2000
细胞转染
(1) 转染前一天，用胰酶消化对数生长期的BGC细胞并计数，以3.5×105/孔，将细胞接种于2mL 含10%胎牛血清的无抗生素培养基的6孔培养板中。
(2) 铺板次日，待细胞贴壁生长汇合度约80%，将6 孔板中每个孔的旧培养基吸尽，用不含血清的OPTI-MEM 培养基洗涤细胞2 次，然后 6 孔板每个孔中加入1.5mL 的无血清的OPTI-MEM 培养基。
(3) 取出Trop-2载体，空载体和脂质体Lipofectamine 2000 放置室温中，使其融化。
(4) 对于每孔细胞，用200ul OPTI-MEM 培养基分别稀释Trop-2载体2微克，空载体1微克，轻轻混合。
(5)取5u1 Lipofectamine 2000 缓慢加入至200ul OPTI-MEM 培养基中，并将两者轻轻混均，室温孵育5 分钟。
(25min内进行下一步操作)
(6) 将稀释后的Lipofectamine 2000 分别与Trop-2载体，空载体混合，轻柔操作，以防破坏Lipofectamine 2000 和RNA 链断裂，室温孵育20 分钟。
(7) 缓慢均匀的将上述复合物加入到相应孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
(8) 将培养板放入37℃，5%的CO2 培养箱中孵育6 小时后，换含10%胎牛血清的无抗生素1640 培养液继续。
Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤 注意事项
Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。
已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。
特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA 以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA 混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤1.准备转染试剂：取出存储在-20℃的LIPOFECTAMINE2000试剂，并将其溶解在适量的去离子水或者PBS缓冲液中，制备转染试剂。
2. 根据实验需要确定转染的质粒DNA量和细胞数量。
一般来说，每个转染需要1-2ug的质粒DNA，细胞密度则根据细胞类型的不同而有所变化。
3.将准备好的转染试剂和质粒DNA混合在一起。
首先将质粒DNA加入到含有LIPOFECTAMINE2000的管中，并轻轻混合均匀，然后将混合物静置15-30分钟，使其形成脂质-DNA复合物。
4.在脂质-DNA复合物静置的同时，准备待转染的细胞。
将细胞用无血清培养基洗涤一次，并将其悬浮在新的无血清培养基中。
5.将静置好的脂质-DNA复合物滴加到细胞中。
将脂质-DNA复合物滴加到含有细胞的培养皿中，并轻轻摇晃培养皿，使复合物均匀分布在细胞表面。
6.将转染后的细胞培养在37℃的CO2培养箱中孵育。
具体培养时间视实验需求而定，一般来说，24-48小时后可以进行下一步实验。
7. 检测转染效率。
可以通过荧光显微镜观察细胞内是否表达了目的基因或荧光标记，也可以采用Western blotting或者RT-PCR等方法进行进一步的检测。
总的来说，LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤相对简单，但需要注意的是在每一步操作中都要轻柔并避免产生气泡，以确保脂质-DNA复合物可以均匀地与细胞相结合，从而提高转染效率。
同时，在实验过程中需要注意质粒DNA的质量和浓度，以及细胞的健康状态，这些因素都会对转染效果产生影响。
希望以上介绍对您有所帮助，祝您实验顺利。
(完整版)LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染实验步骤：(在生长培养基中直接加入复合物)1。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数,将细胞转至24孔板，控制密度使其在转染日密度接近90％.细胞铺板在0。
5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2.对于每孔细胞,使用50μl OPTI—MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
温柔混匀LIPOFECTAMINE 2000,室温温浴5分钟（在5-25分钟内同稀释的DNA混合.保温时间过长会降低活性。
可以批量制备。
）注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI—MEMⅠ稀释,细胞也可以使用D-MEM培养. 3。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI—MEMⅠ培养基)稀释0。
8μg-1.0μg DNA。
多孔操作可以批量制备。
4。
混合稀释的DNA（由第3步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000(由第2步).在室温保温20分钟。
注意:溶液可能会混浊,但不会影响转染。
复合物可以在室温保持6小时稳定.5。
直接将复合物（100μl）加入到每孔中，前后（或左右）摇动培养板,轻轻混匀.注意：如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。
在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.2ml无血清培养基。
6.在37℃，5％的CO2中保温18—48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4—5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。
7.在细胞中加入复合物18—72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。
这依赖于细胞类型和启动子活性.对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中（1:10），两天后加入筛选抗生素。
进行稳定表达需要数天或数周.。
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤转染是一种将外源DNA或RNA导入到细胞内的技术，以研究基因功能、蛋白质表达、细胞信号转导等方面的问题。
LIPOFECTAMINE2000是一种常用的转染试剂，广泛应用于多种细胞系中。
以下是LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤的详细介绍。
一、细胞种植与处理准备1.1细胞传代：将细胞进行传代，以保证其在良好的状态下进行实验。
1.2细胞密度调整：将细胞于适宜培养皿中培养至60-80%的密度，以保证细胞的适宜转染。
1.3细胞处理准备：在转染前，将细胞用无酶EDTA或胰酶剥离并重新悬浮在适宜的培养基中，以保持细胞的完整性和适宜的状态。
二、试剂配制2.1DNA或RNA的制备：将外源DNA或RNA在无菌条件下制备，并使用纯化试剂进行纯化和浓缩。
2.2转染试剂配制：将冻干的LIPOFECTAMINE2000转染试剂通过加入合适的无菌水，稀释成适宜浓度的转染试剂。
三、转染操作3.1转染试剂与DNA/RNA的混合：将适量的LIPOFECTAMINE2000转染试剂与DNA或RNA混合在无菌的管中，轻轻混合均匀。
注意，避免过量试剂和核酸的使用，以减少细胞的毒性和副作用。
3.2孵育混合物：将混合物在常温条件下孵育15-30分钟，以促使脂质体与核酸形成稳定的复合体。
四、转染过程4.1转染试剂与细胞的混合：将混合物缓慢滴加到处理好的细胞培养基上，缓慢摇晃培养皿以使混合物均匀分布。
4.2转染时间及培养条件：将细胞放置在转染液中，保持静止状态，同时将培养皿放回培养箱中，在37℃、5%CO2的恒温恒湿条件下进行转染。
转染时间需要根据细胞系和转染试剂的要求进行优化，一般为4-6小时。
4.3转染液的去除：将转染液小心去除，并将细胞用含有适宜抗生素或筛选剂的培养基洗涤一次，以去除残留的转染试剂。
五、细胞处理及分析5.1细胞培养：将细胞放回恒温恒湿培养箱中，用适宜培养基进行细胞的培养。
lipo转染操作步骤
l i p o转染操作步骤 This manuscript was revised by the office on December 22, 2012L i p o2000瞬时转染细胞步骤Stealth?RNAiorsiRNATransfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。
B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将AB两管混合，放置20min。
3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
PlasmidDNATransfectionDNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1中板。
贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。
2转染。
A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。
B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将AB两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
lipo2000转染操作步骤
.Lipo2000 瞬时转染细胞步骤RNAi or siRNA Transfection Stealth?1 24孔板为例，其余规格的转染见表以适宜30-50%。
1 中板，细胞密度为如果转染后需要长时间注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
24-36小时后）每个孔转染方式如下：2 第二天（无血清培养基中。
溶于A 将20pmol siRNA50ul Opti-mem 。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min 两管混合，放置C 将A B20min。
加管mix3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C 孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
入24Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
70-80%5 时转染 cells/well贴壁细胞：0.5-2X10，第二天待细胞密度达到 5 ，中板后随即转染。
4-8X10cells/well悬浮细胞：2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
1 / 3.：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考* 足以。
6孔板细胞质粒转染量1-2ug**：足以。
6cm dish细胞质粒转染量4-6ug***：和碳酸氢钠进行缓HEPES 其中使用了减血清培养基是EMEM 的改良型,Opti-MEM? I常用其作为无.谷氨酰胺、痕量元素和生长因子并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、冲,L-lip2000分别混合。
lipo2000转染protocal6孔板中文
转染6孔板
1、转染前一天，接种到6孔培养板上。
（4*105/ml.）
转染时，细胞要达到90~95%的融合。
细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2、溶液A：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
3、溶液B：246 ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）（此为推荐剂量）
｛摸5个梯度分别是4 ug 质粒：4ul lipo，
4ug 质粒：6ul lipo
4 ug 质粒：8ul lipo
4ug 质粒：10ul lipo
4ug 质粒：12ul lipo
4、将溶液A与溶液B混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液A与溶液B的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h 检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。
lip2000转染说明书
4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。
目前用的最多的是阳离子脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
lipo2000转染方法
lipo2000转染方法Lipo2000转染方法引言：Lipo2000是一种常用的转染试剂，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将介绍Lipo2000转染方法的原理、步骤以及其在实验中的应用。
一、原理：Lipo2000转染试剂是一种基于脂质体的转染方法。
其原理是通过脂质体与目标DNA或RNA结合形成复合物，然后将复合物转染至靶细胞中。
脂质体的疏水性结构使其能够与负电荷的核酸结合，从而实现核酸的传递。
二、步骤：1. 准备工作：a. 将Lipo2000转染试剂取出并放置于室温下回温。
b. 根据实验需要，准备好需要转染的靶细胞。
c. 根据转染试剂和靶细胞的要求，选择合适的培养基和培养条件。
2. 转染复合物的制备：a. 将所需的DNA或RNA与Lipo2000转染试剂按照一定的比例混合，轻轻摇晃使其均匀混合。
b. 将混合液静置一段时间，使其形成稳定的脂质体-核酸复合物。
3. 细胞转染：a. 将转染复合物滴加到准备好的细胞培养基中，轻轻摇晃培养皿使其均匀分布。
b. 将培养皿放回培养箱中，按照细胞的培养要求进行后续处理。
4. 细胞培养：a. 根据实验需要，选择合适的培养基和培养条件进行细胞培养。
b. 根据实验设计，进行所需的时间点采样或进一步处理。
三、应用：Lipo2000转染方法在生物医学研究中有着广泛的应用。
以下列举几个常见的应用领域：1. 基因功能研究：通过转染特定基因的siRNA或miRNA，可以实现对基因的特定抑制，从而研究其功能。
2. 蛋白表达调控：通过转染携带特定启动子的DNA或RNA，可以实现对目标蛋白的表达调控。
3. 细胞信号通路研究：通过转染特定信号通路相关基因的DNA或RNA，可以研究该信号通路的调控机制及其在疾病发生发展中的作用。
4. 肿瘤药物筛选：通过转染肿瘤细胞系，可以评估特定药物对肿瘤细胞的抑制效果，为药物筛选提供参考依据。
5. 病毒感染研究：通过转染携带特定病毒基因的DNA或RNA，可以模拟病毒感染过程，研究病毒的传播机制和致病机理。
lip2000转染说明书
lip2000转染说明书4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染⽅法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导⾄真核细胞中的⽅法主要有以下⼏种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离⼦脂质体试剂。
⽬前⽤的最多的是阳离⼦脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极⼩的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进⼊⽬的细胞的细胞质。
沉淀物的⼤⼩和质量对于磷酸钙转染的成功⾄关重要。
在实验中使⽤的每种试剂都必须⼩⼼校准，保证质量，因为甚⾄偏离最优条件⼗分之⼀个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的⾼场强电脉冲中转导分⼦。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染⾮常重要，因为过⾼的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜⽽裂解细胞。
⼀般，成功的电穿孔过程都伴随⾼⽔平（50%或更⾼）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分⼦使得DNA 可以结合在细胞表⾯。
通过使⽤DMSO或⽢油获得的渗透休克将DNA复合体导⼊。
两种试剂都已成功⽤于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使⽤机械的⽅法，⽐如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使⽤⼀根细针头将DNA，RNA或蛋⽩直接转⼊细胞质或细胞核。
基因枪使⽤⾼压microprojectile将⼤分⼦导⼊细胞。
4.1.5 阳离⼦脂质体试剂在优化条件下将阳离⼦脂质体试剂加⼊⽔中时，其可以形成微⼩的（平均⼤⼩约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作⽤结合到DNA的磷酸⾻架上以及带负电的细胞膜表⾯。
lipo2000转染操作步骤 new
Stealth™ RNAi or siRNA Transfection以6孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
（含血清，不含抗生素）注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（12小时后）每个孔转染方式如下：A 将100pmol siRNA溶于250ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将5ul lipo2000溶于250ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，用PBS洗2次，将6孔板培养基换成Opti-mem，每孔1.5ml。
将C 管mix加入6孔板对应孔中， 6小时后换成有血清培养基。
Plasmid DNA Transfection转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
（含血清，不含抗生素）贴壁细胞：第二天待细胞密度达到90%以上时转染悬浮细胞：中板后随即转染。
2 转染。
A 将4ug DNA溶于250ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将10ul lipo2000溶于250ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，用PBS洗2次，将6孔板培养基换成Opti-mem，每孔1.5ml。
将C 管mix加入6孔板对应孔中， 6小时换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
lipo2000转染操作步骤复习过程
Lipo2000瞬时转染细胞步骤Stealth? RNAi or siRNA Tran sfecti on以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，贝呼田胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2第二天(24-36小时后)每个孔转染方式如下：A将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem 无血清培养基中。
B将1ul lipo2000 溶于50ul Opti-mem 无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将A B两管混合，放置20min。
3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA Tran sfecti onDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well ，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well ，中板后随即转染。
2转染。
A将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem 无血清培养基中。
B将2ul lipo2000 溶于50ul Opti-mem 无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
:中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考** : 6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
*** : 6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
Opti-MEM? I减血清培养基是EMEM 的改良型，其中使用了HEPES和碳酸氢钠进行缓冲,并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、痕量元素和生长因子•常用其作为无血清培养基与质粒和lip2000分别混合。
Lipofectamine2000细胞转染protocol
Lipofectamine2000细胞转染protocol1、预处理：转染前一天，换液，胰酶消化细胞并计数，25c㎡的培养瓶中长满细胞可达5×10^6/mL，取3-4×10^5细胞铺在2mL的培养基中（不含双抗含血清），使其在转染时密度为90-95%（张老师做法：在细胞传代时用1mL胰酶消化，再加入4mL培养基（不含双抗含血清）中和。
800rpm，离心5min，5Ml培养基（不含双抗含血清）吹散后计数，留取1mL继续培养，其余按所需分装到4个6孔板，没孔加培养基至2mL）。
2、质粒DNA配制：每孔2ug质粒DNA，用无血清双抗OPTI-MEN培养基稀释至250ul；多孔可批量配制。
质粒DNA配好后，涡旋，瞬离。
3、Lipofect配制：每孔5ul lipofect试剂，用OPTI-MEN培养基稀释至250ul温和混匀，温室放置5min；多孔可批量配制。
4、将稀释的质粒DNA和Lipofect，混合在一起（配制后30min内混合），室温保温20min，保证每孔总体积500ul。
溶液可能变浑浊，但不影响转染。
（DNA-Lipofect复合物室温下6小时内保持稳定）。
5、将前天孵育的6孔板取出，处理细胞。
用移液管吸去上清（注意从边缘吸取，尽可能不要吸去贴附细胞）。
6、每孔2mLPBS清洗1遍，注意移液管要对着边缘加液，不可吹起细胞。
7、每孔用1mLDMEM清洗2遍。
8、每孔先加入OPTI-MEN0.9mL，再加500ulDNA-Lipofect复合物，摇动培养版，轻轻混匀（加质粒DNA时注意不要碰管壁）。
9、置入CO2培养箱，在6h后更换培养液，弃去上清，加入2mL不含双抗的DMEM。
10、再次置入CO2培养箱，72小时后，吸收上清至50mL离心管。
500转，10min 离心，取上清1mL/管（1.5mL进口EP管）分装标注，冻存-80°。
另取200ul 至2mLEP管检测HBsAg定量。
最新整理lipo转染操作步骤知识讲解
最新整理lipo转染操作步骤知识讲解Lipo2000 瞬时转染细胞步骤Stealth? RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。
2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
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Stealth™ RNAi or siRNA Transfection
以24孔板为例，其余规格的转染见表1
1 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：
A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA Transfection
DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3
转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染
悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。
2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection
*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考
**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。