免疫学检测ppt概论
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临床免疫学与检验--概论 ppt课件
临床免疫执行生理性免 疫防卫功能,当免疫反应调节异常或功能缺陷时,将 导致免疫性疾病。与免疫反应有关的各种免疫活性 物质的检测和免疫技术的应用,是医学检验专业学 习的主要目的,也为本书的重点及与《医学免疫学》 的区别。 为便于学生更好地学习，配合第4版《临床免 疫学与检验》教材同时出版了“习题集”和“多媒 体光盘”等辅助教材。希望广大师生在使用过程中 提出宝贵意见，以便在今后的教材修改中更趋完善。
Snell S, Dausset J, Benacceraf B
Milstein C, Kohler GE Jrena NK Tonegawa S Thomas ED, Murry J
Major histocompatibility complex
Monoclonal antibody Theory for immune regulation Gene re-arrangement in antibody production Transplantation immunology
识别阶段（recognition phase） 活化阶段（activation phase） 效应阶段（response phase）
执行效应功能
课件 12
抗原识别处理 传递信息 免疫细胞活化增殖产生 效应细胞、分子
补体 细胞因子 免疫球蛋白 浆细胞 B细胞
粒细胞 单核细胞
T细胞
巨噬细胞
课件
13
免疫应答效应大多为生理性，是机
课件 9
一、免疫学概念与免疫应答
宿主体内的免疫系统，能识别并清除从外环境中侵入的病 原生物及其产生的毒素、内环境中因基因突变产生的肿瘤 细胞、自身衰老残损的组织细胞或自身变性抗原，实现 免疫防御 (immunological defence) 免疫自稳 (immunological homeostasis)
Snell S, Dausset J, Benacceraf B
Milstein C, Kohler GE Jrena NK Tonegawa S Thomas ED, Murry J
Major histocompatibility complex
Monoclonal antibody Theory for immune regulation Gene re-arrangement in antibody production Transplantation immunology
识别阶段（recognition phase） 活化阶段（activation phase） 效应阶段（response phase）
执行效应功能
课件 12
抗原识别处理 传递信息 免疫细胞活化增殖产生 效应细胞、分子
补体 细胞因子 免疫球蛋白 浆细胞 B细胞
粒细胞 单核细胞
T细胞
巨噬细胞
课件
13
免疫应答效应大多为生理性，是机
课件 9
一、免疫学概念与免疫应答
宿主体内的免疫系统，能识别并清除从外环境中侵入的病 原生物及其产生的毒素、内环境中因基因突变产生的肿瘤 细胞、自身衰老残损的组织细胞或自身变性抗原，实现 免疫防御 (immunological defence) 免疫自稳 (immunological homeostasis)
医学免疫学免疫学检测技术ppt课件
14
双抗体夹心法、间接法ELISA
15
间接法ELISA
16
ELISA操作图
可调移液器
8孔道可调移液器 17
3. 放射免疫测定（RIA）
常用 125I，测定微量物质 4. 化学发光免疫分析
常用 鲁米诺，测定超微量物质 5. 免疫印迹法（Western Blotting）
先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定
1. 免疫荧光法（IFA ）
荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位
（1）直接荧光法 荧光素一抗 对每种抗体作标记 特异 测Ag
（2）间接荧光法： 荧光素二抗 不必标记每种抗体 敏感 测Ag/Ab
12
免疫荧光法
13
2. 酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化
（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原
10
II ) Precipitation （二）沉淀反应
可溶性抗原 + 相应抗体肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为介质——琼脂扩散/免疫扩散
1. 单向免疫扩散：抗原 的定量（Ig、C3 ）
2. 双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析 3. 免疫电泳： 电泳 + 双向免疫扩散 （抗原分析）
21
3. 细胞因子检测
（1）免疫学检测法—— 夹心法ELISA FCM
（2）生物学检测法—— 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验 细胞毒（或细胞毒抑制）试验
（3） 分子生物学检测法 RT-PCR测定mRNA
4. 皮肤试验： 测试IV型超敏反应能力
22
（二）B细胞功能测定
1. B细胞增殖试验 小鼠：LPS 人： SPA；抗IgM
双抗体夹心法、间接法ELISA
15
间接法ELISA
16
ELISA操作图
可调移液器
8孔道可调移液器 17
3. 放射免疫测定（RIA）
常用 125I，测定微量物质 4. 化学发光免疫分析
常用 鲁米诺，测定超微量物质 5. 免疫印迹法（Western Blotting）
先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定
1. 免疫荧光法（IFA ）
荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位
（1）直接荧光法 荧光素一抗 对每种抗体作标记 特异 测Ag
（2）间接荧光法： 荧光素二抗 不必标记每种抗体 敏感 测Ag/Ab
12
免疫荧光法
13
2. 酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化
（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原
10
II ) Precipitation （二）沉淀反应
可溶性抗原 + 相应抗体肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为介质——琼脂扩散/免疫扩散
1. 单向免疫扩散：抗原 的定量（Ig、C3 ）
2. 双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析 3. 免疫电泳： 电泳 + 双向免疫扩散 （抗原分析）
21
3. 细胞因子检测
（1）免疫学检测法—— 夹心法ELISA FCM
（2）生物学检测法—— 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验 细胞毒（或细胞毒抑制）试验
（3） 分子生物学检测法 RT-PCR测定mRNA
4. 皮肤试验： 测试IV型超敏反应能力
22
（二）B细胞功能测定
1. B细胞增殖试验 小鼠：LPS 人： SPA；抗IgM
免疫学检测技术(课堂PPT)
.
36
一、凝聚反应(Agglutination)
二、沉淀反应
1、溶液中的沉淀反应
2、凝胶扩散沉淀
3、免疫电泳Biblioteka 血清免疫电泳火箭电泳
对流免疫电泳
三、补体参与的反应
四、免疫标记的抗原抗体技术
酶联免疫吸附（ELISA）
.
37
一、凝集反应
凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合 反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整 的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在 一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称 为凝集原，抗体称为凝集素。
. Equivalence – Lattice formatio6 n
抗原或抗体检测原理
.
7
• 免疫学（Immunology）：
是研究抗原性物质、免疫系统、免疫应 答的规律及免疫应答的调节的一门科学。
• 免疫的定义（Immunity）：免疫是机体识 别自我与非自我的过程。排除异己，维护 自身稳定的生理反应。
体细胞会因物理、化学和病毒等生物因素的影响，使
细胞发生癌变，形成肿瘤等，机体可识别、清除这些
细胞，这是免疫系统的第三个功能。当这一功能低下
或失调时，会导致肿瘤或癌. 症。
9
抗原 （Antigen）
抗原概念 凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，
并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生 反应的物质。
亲缘关系越远，差异越大，抗原性越强。
自身抗原：自身组织发生异常变异、免疫功能紊乱、眼球晶体 蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白
2. 大分子胶体：一般在10 kD以上 。
3. 具有复杂的立体结构或空间构象.
如明胶分子量虽然为100 kD，但结构简单，免疫原性差。
《免疫学检测技术》课件
免疫荧光技术（IFT）
原理：利用荧 光标记的抗体 与抗原结合， 通过荧光显微 镜观察荧光信
号
应用：检测细 胞表面抗原、 细胞内抗原、
细胞因子等
优点：灵敏度 高、特异性强、
可定量分析
缺点：操作复 杂、成本较高、 需要专业设备
免疫沉淀技术（IP）
原理：利用抗原-抗体特异性结 合，沉淀出目标蛋白
应用：蛋白质相互作用研究、 蛋白质组学研究等
细胞因子 检测：用 于诊断免 疫系统疾 病、肿瘤 等
免疫组化 检测：用 于诊断肿 瘤、感染 性疾病等
流式细胞 术：用于 检测免疫 细胞亚群、 细胞因子 等
免疫荧光 检测：用 于检测抗 原、抗体 等
免疫印迹 法：用于 检测蛋白 质、抗体 等
在生物制品检测中的应用
疫苗检测：检 测疫苗的有效
性和安全性
抗体检测：检 测抗体的浓度
检测方法：开发新 型检测方法，提高 检测灵敏度和准确 性
自动化：实现检测 过程的自动化，提 高检测效率
便携化：开发便携 式检测设备，方便 现场检测和快速诊 断
THANKS
汇报人：
例
Part One
单击添加章节标题
Part Two
免疫学检测技术概 述
免疫学检测技术的定义和分类
免疫学检测技术的发展历程
19世纪末，免疫 学检测技术开始 萌芽
20世纪初，免疫 学检测技术逐渐 成熟
20世纪中叶，免 疫学检测技术快 速发展
21世纪初，免疫 学检测技术进入 分子水平
免疫学检测技术的应用领域
优点：灵敏度高、特异性强、 操作简便
注意事项：选择合适的抗体、 控制反应条件、避免非特异性 结合等
流式细胞术（FC）
《免疫学检查》ppt课件
6
标记
7
第一节 免疫球蛋白〔Ig〕的检测
8
❖Ig的产生、构造与功能 Ig通常是指具有抗体活性和〔或〕抗
体样构造的球蛋白，由浆细胞产生，有特 异性识别抗原的功能，但必须与抗原结合 形成免疫复合物后才能启动效应功能。 ❖包括：IgG、A、M、D、E
9
一、IgG
+ 参考值：7.0-16.6g/L, 占70-80％ + 特点：长效、能透过胎盘，抗菌、抗病毒 + 测定方法：单向免疫扩散〔手工〕
1.E花环〔RFC〕 原理：T细胞外表具SRBC受体 正常 58-72％左右
2.淋巴细胞转化试验〔LCT〕 原理：淋T PHA 淋母细胞 正常：同上 意义：T细胞数量↓免疫缺陷、肿瘤、免疫病
20
3．淋巴细胞分化抗原测定
T细胞：CD3-总T标志 CD4-TH标志 CD8-Ts标志
B细胞： CD19、CD20、CD22等 细胞的荧光免疫标记技术 流式细胞仪的应用
3.CA153〔癌抗原153〕－－对乳腺癌有重要
的辅助诊断作用
28
肿瘤标志物的临床应用
1 筛查：高危人群 2 诊断、良/恶鉴别：辅助指标 3 疗效观察：外科—手术切除/残瘤/姑息
保守—药效、放疗效果 4 预后：病员分群,标志物: 5 随访……
29
第五节 自身抗体检测 〔P423〕
--自身免疫病是指免疫系统对自身成 分的免疫耐受性减低或破坏，产生 自身抗体损伤含有相应自身抗原的 组织器官而造成的疾病。
感染、多克隆增高 ↓反复呼吸道感染 非IgA单克隆，如SLE、
免疫缺陷等
11
三、IgM
+ 参考值：0.5-2.6g/L,占5-10％ + 特点：五聚体，大分子
标记
7
第一节 免疫球蛋白〔Ig〕的检测
8
❖Ig的产生、构造与功能 Ig通常是指具有抗体活性和〔或〕抗
体样构造的球蛋白，由浆细胞产生，有特 异性识别抗原的功能，但必须与抗原结合 形成免疫复合物后才能启动效应功能。 ❖包括：IgG、A、M、D、E
9
一、IgG
+ 参考值：7.0-16.6g/L, 占70-80％ + 特点：长效、能透过胎盘，抗菌、抗病毒 + 测定方法：单向免疫扩散〔手工〕
1.E花环〔RFC〕 原理：T细胞外表具SRBC受体 正常 58-72％左右
2.淋巴细胞转化试验〔LCT〕 原理：淋T PHA 淋母细胞 正常：同上 意义：T细胞数量↓免疫缺陷、肿瘤、免疫病
20
3．淋巴细胞分化抗原测定
T细胞：CD3-总T标志 CD4-TH标志 CD8-Ts标志
B细胞： CD19、CD20、CD22等 细胞的荧光免疫标记技术 流式细胞仪的应用
3.CA153〔癌抗原153〕－－对乳腺癌有重要
的辅助诊断作用
28
肿瘤标志物的临床应用
1 筛查：高危人群 2 诊断、良/恶鉴别：辅助指标 3 疗效观察：外科—手术切除/残瘤/姑息
保守—药效、放疗效果 4 预后：病员分群,标志物: 5 随访……
29
第五节 自身抗体检测 〔P423〕
--自身免疫病是指免疫系统对自身成 分的免疫耐受性减低或破坏，产生 自身抗体损伤含有相应自身抗原的 组织器官而造成的疾病。
感染、多克隆增高 ↓反复呼吸道感染 非IgA单克隆，如SLE、
免疫缺陷等
11
三、IgM
+ 参考值：0.5-2.6g/L,占5-10％ + 特点：五聚体，大分子
第三章免疫学检测技术精品PPT课件
第二节 免疫组织化学检测技术
抗原＋抗体（特异性）＋酶标记抗体，通过酶与 底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗 原的一门技术。 免疫组织化学：用带标记物的抗体或抗原在组织细 胞原位通过抗原抗体反应或组织化学反应，对相 应抗或抗体进行定性、定量、定位测定的技术。
免疫组化分类
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为： 免疫荧光法 免疫酶法 免疫铁蛋白法 免疫金法 放射免疫自显影法 按标记抗体的方式分： 标记抗体IHCT法 非标记抗体IHCT法
抗原（多价）抗体（2价或以上）不等价性，使 抗原抗体反应时存在比例关系，生成物的量与 反应物的量（浓度）有关。
比例性：抗原抗体结合生成复合物的量与反应 物浓度的关系。
只有2者分子比例合适，结合价相互饱和，才生 成可见的复合物。
在等价带区的溶液中几乎不存在游历的抗原和 抗体。
滴度（效价）指抗原或抗体与一定量的对应物 产生明显可见的反应所需的最小量。
• 可作为抗原的物质有 酶、 受体、 抗体、 细 胞外基质 激素、 细胞结构蛋白、病原体。
二、免疫标记物显色原理
① 免疫酶测定法 ② 免疫荧光技术 ③ 放射免疫测定法 ④ 免疫胶体金技术
①免疫酶测定法
a) 夹心法ELISA
b) 间接ELISA
a）
c) BAS—ELISA 利用生物
素和抗生物素蛋白为桥梁
单向免疫扩散 Ab in gel
用于确定 抗原浓度
Ag
Ag
Ag
Ag
免疫比浊
过量Ab Ab
Ab
Ab
双向免疫扩散
Ag1 Ag2
Ag3
Ag4
Ab
鉴定多种抗原是完全相同、 部分相同或完全不同
沉淀反应—免疫电泳
免疫学检查-PPT课件
二、生殖感染的免疫实验诊断
HPV感染的检测：HHPV分型及病理学作用 目前已知的HPV有110多种，根据病毒致癌性的大小分为两大类：
(1)低危型HPV(非癌性相关型，LRHPV)
(2)高危型HPV(癌相关型，HRHPV)
HPV感染与宫颈癌及癌前病变的关系
宫颈癌常规筛查方法分析：宫颈巴氏涂片及组织学荧光分光镜检查法 等
梅毒螺旋体感染的实验室诊断 根据梅毒螺旋体（treponema pallidum，TP） 性，检测方法主要有以下几种： 1病原体的检查 2梅毒血清学试验 的生物学及免疫学特
3基因诊断技术
二、生殖感染的免疫实验诊断
基因诊断技术 ：聚合酶链反应（PCR）从选择的标本扩增梅毒螺旋体 DNA序列，使其拷贝数量增加，再用特异性探针来进行检测，能选择性 地将靶基因扩增106以上，方法敏感特异。 分子生物学检测方法 ：有基因探针、PCR、蛋白表达等方法
免疫学检查
盖星月
人们对生殖活动的免疫学研究已证实，全部 生殖过程均存在着复杂的免疫学现象。免疫 因素参与生殖过程和男女不育症的发生有着 密切的关系。
免疫学
概பைடு நூலகம்：
免疫系统的组成：由主宰或执行机体免疫功能的器官、组织和细胞所组 成的一个系统，称为免疫系统。由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。 免疫系统的功能：免疫反应是机体对外来抗原的特殊反应。主要有三大 免疫功能，即免疫防御、免疫稳定和免疫监视。在免疫功能正常条件下， 机体对非己抗原可形成体液免疫和细胞免疫并产生排异效应，发挥免疫 保护作用。
固相非竞争的直接夹心ELISA法检测肿瘤标记物 以双抗体夹心法为例，操作步骤如下
1）本法测定二价或二价以上的大分子抗原。不适用于测定半抗原及 小分子单价抗原。 （2）标本中含RF存在时，可出现假阳性，采用F（ab'）或Fab片段 作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，可消除RF的干扰。
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二、免疫细胞功能测定
单核-吞噬细胞功能测定 T淋巴细胞功能测定 B淋巴细胞功能测定 NK细胞功能测定
（一）单核-吞噬细胞功能测定
巨噬细胞吞噬功能测定 巨噬细胞胞毒作用测定 中性粒细胞趋化功能测定 中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定 ①中性
粒细胞噬菌试验② 硝基蓝四氮唑③化学发 光试验
（二）T细胞功能测定
免疫学检测技术
纲要
免疫细胞及其功能的检测 免疫分子的检测 免疫相关基因的检测 免疫学检测的临床应用
第一节 免疫细胞及其亚群的检测
免疫细胞及亚群的分离、鉴定与计数 单核-吞噬细胞功能测定 T淋巴细胞功能测定 B淋巴细胞功能测定 NK细胞功能测定
一、免疫细胞及亚群的分离、鉴定与计数
（二） 影响抗原抗体反应体系的因素
适宜的抗原抗体浓度和比例 反应时间 电解质 温度 酸碱度
（三）抗原、抗体检测的方法
沉淀反应 凝集反应 补体参与抗原抗体反应 免疫标记技术 蛋白质芯片技术
1. 沉淀反应
可溶性抗原与相应抗体在有适量电解质存在下，出现肉 眼可见的沉淀现象，称为沉淀反应。
T细胞功能的体内试验
迟发型超敏反应(DTH)： 结核菌素反应
（三） B淋巴细胞功能测定
B细胞增殖(转化)试验 溶血空斑形成试验 酶联免疫斑点法(ELISPOT)
溶血空斑试验
B
温育
+
浆B
1-3h
绵羊红细胞
+ 补体
B 有丝分裂原
浆
（四） NK细胞功能试验
放射性核素51Cr、125I-UdR释放法 乳酸脱氢酶释放法 形态学检测 化学发光法
（一）外周血单个核细胞的分离
根据比重的不同将血液离心分层
血浆 PBMC
分离液 多形核白细胞
红细胞
取PBMC
单核细胞吸附,未吸 附的为淋巴细胞.
玻璃平皿
免疫细胞数量与功能的是判断机体免疫功能状态的重要指标.
（二）淋巴细胞及其亚群的分离
免疫吸附分离法 磁珠分离法(immune magnetic bead，
T细胞介导的细胞毒试验
检测机体抗肿瘤、抗病毒免疫功能或移植排斥反应时可 应用T细胞介导的细胞毒试验，具体方法包括放射性核 素释放法、形态学检测法、流式细胞术等，其中放射性 核素释放法较为常用，基本过程是将51Cr 标记靶细胞， 用受检者外周血分离的单个核细胞与51Cr标记的靶细胞 按一定比例混合，37℃温育后用γ测量仪检测上清液中 51Cr的含量。靶细胞被杀伤的越多，上清中51Cr的含量 越多，由此推算出Tc杀伤活性的高低。
IMB) 流式细胞术(flow cytometry，FCM) 尼龙毛分离法 E花环沉降法 抗原肽-MHC分子四聚体技术
免疫吸附分离法： 利用表面标志分离 淋巴细胞亚群
Removal of T cells from marrow graft
Magnetic antibodies Magnet
（三）单核-吞噬细胞分离
体外：Percoll连续密度梯度离心法 平皿黏附法分离(阳性分选) 体内：斑蝥敷贴法等
（四）免疫细胞的计数
1. T细胞检测
间接免疫荧光法 免疫组织化学法 葡萄球菌花环法 微量细胞毒试验
2. B细胞检测
膜表面免疫球蛋白（mIg）检测 间接免疫荧光法 细胞亚群检测
溶 血 空 斑 实 验
酶联免疫斑点试验(enzyme-Linked immonospot assay，ELISPOT)
第二节 免疫分子的检测
抗原抗体的检测 补体的的检测 细胞因子及其受体的检测
一、抗原抗体的检测
抗原抗体检测的原理与基本特点 影响抗原抗体反应体系的因素 抗原、抗体检测的方法
T淋巴细胞增殖试验 T细胞介导的细胞毒试验 T细胞分泌功能测定 流式细胞术对T细胞功能的检测 T细胞功能的体内试验 ：包括接触性超敏反应、
移植物抗宿主反应(GVHR)、迟发型超敏反应 (DTH) 等
1. T淋巴细胞增殖试验
形态学方法 放射性核素掺入法 MTT法 抗TCRV等位基因片段产物检测法 CFSE标记技术
抗原抗体检测的原理与基本特点
基本特点 特异性和交叉反应 可逆性 可见性与带现象 反应的阶段性
可见性与带现象
抗原抗体结合出现可见反应具有一定的量比关系，当两 者分子比例合适时，抗体分子的两个Fab段分别与两个 抗原决定基结合，相互交叉连接成网格状复合体，形成 肉眼可见的反应物（沉淀物或凝集物） 前带现象（prozone）:抗体过剩 后带现象(postzone) :抗原过剩
T细胞功能检测
PHA
TLeabharlann 母ConA增殖
TT T
T细胞毒性试验
形态学测转化率
CTL +
-51Cr 靶
靶细胞溶解， 51Cr释放
测放射活性
淋巴细胞增殖实验： 放射性核素掺入法
T细胞增殖过程中，胞内DNA、RNA合成增加。 氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）作为合成 DNA的原料，在淋巴细胞与有丝分裂原培养 终止前8～16小加入，3H-TdR被转化的细胞摄 入。培养结束后，用液体闪烁仪测定细胞内同 位素的相对含量，即代表淋巴细胞的转化能力。 同位素掺入法灵敏，结果客观，重复性好，但 需一定的仪器设备，若操作不规范，结果重复 性受影响，且存在放射性核素污染的危险。
1. 沉淀反应 2. 凝集反应 3. 补体参与抗原抗体反应 4. 免疫标记技术 5. 蛋白质芯片技术
（一）抗原抗体检测的原理与基本特点
抗原抗体检测的原理 抗原与相应抗体可发生特异性结合，并
在外界条件影响下出现肉眼可见或借助仪器 可检测的各种现象，如凝集或沉淀。借此可 用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（或抗 体），因所采用的抗体常存在于血清中，故 称为血清学反应。
磁珠分离法
利用FCM技术进行细胞分选
抗原肽-MHC分子四聚体技术
/uploadfile/2011/0609/20110609102753764.jpg
MHC抗原肽四聚复合物，作为TCR结合的亲合力配 体，借助亲和素-生物素结合的原理，通过流式细胞仪分选 获得高纯度的特异性T细胞克隆，结合分析细胞表面分子、细 胞内效应分子等，用于检测和分离特异性T细胞。