生化实验基本原理及技术

生物化學實習

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緒論

(一) 原理

1. 光依據其波長來分類：

(1) 200nm~400nm 短波屬於紫外光

(2) 400nm~700nm 可見光波長

(3) 700nm~900nm 長波屬於近紅外光

2. 光通過溶液時，特定波長的光被吸收，眼睛察覺到的是沒有被吸收的波長。

核黃素會吸收450nm 的光，紅光與黃光會通過溶液而被肉眼所見。

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圖1-1光譜儀

光譜儀可用來鑑定及定量純或不純的溶液中所含有的特定化合物，主要原理是基於兩個物理定律：1.柏朗定律；2.比爾定律 。

1. 柏朗定律：每單位厚度溶液其吸收入射光的比率為定值，被溶液吸收的入射光量與入射光強度無關。被每單位厚度溶液吸收的入射光比率為定值，每一單位厚度溶液若吸收10%的光，則光經過每一單位厚度溶液時，其強度即減少10%。

I ＝I 0 • e -αι

I ：穿透光強度

I 0：入射光強度

α ：溶液吸光係數

ι：光路徑長度

柏朗定律中以對數為底轉換公式，將吸光係數α轉換成比例常數K

→ log 10 I 0 / I ＝K ι

log 10 I 0 / I ＝ 吸光值(absorbance ；A)

或光密度值(optical density ；

OD)

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2. 比爾定律：光經過吸光物質所產生的吸光值，與溶液中每單位面積所含的吸光物質數目成比例。

比爾定律描述比例常數K 與待測吸光溶液中溶質的濃度有關。

K ＝εc

ε：消光指數

c ：吸光物質濃度

I ＝ I 0• 10-εc ι

log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ι＝ εc ι

當ι（光路徑長度）＝1 cm 時

log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ＝ εc

特定溶質在特定波長下，消光係數ε為一常數。因此，當吸光物質的濃度變成兩倍，於相同的光路徑下，被吸收的光量也會變成兩倍。

圖1-2 22 µM 溶於0.1M 磷酸鈉，pH 7.06，1公分

光路徑(light path)的條件下測定 波長

吸光

值

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(二) 光譜儀的應用

1. 呈色反應：如果分子沒有吸光性，可將此分子與其他分子反應，產生具吸光性的有色化合物。

2. 色度定量法：

(1) 呈色劑必須過量。

(2) 必須在吸光值與該化合物濃度呈現線性下，得出標準曲線，亦即該化合物

濃度之改變必須與吸光值改變成正比。

(3) 色度定量法之最大誤差來源：通常發生在化合物高濃度時，由於其產生數

據為非線性反應所致。應該將未反應之未知溶液重新稀釋後再做一次，切勿直接稀釋已呈色之反應溶液。

(三) 呈色定量：線性反應之標準曲線

圖1-3呈色定量反應的標準曲線

(四) 光譜儀的構造與性質

1. 光源 (Light Source)

(1) 鎢絲燈：

340~900 nm

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(2) 氫-氘燈：200~360 nm

2. 波長選擇器 (Wavelength Selector)

(1) 單色光純度越高，其靈敏度也越高。

(2) 濾光片 (absorption filters)：能夠將高於及低於特定波長的光遮蔽住。

(3) 較為先進的光譜儀會使用稜鏡 (prism) 或繞射柵欄來產生單色光以克服

濾片的缺點。

(4) 狹縫 (slit)：光的路徑中置放一對調節板行成狹縫調整入射光的強度。

(5) 樣品管或比色槽 (sample tubes or cuvettes)：盛裝樣品與空白對照組溶劑的

容器必須是相同的。

(五) 光伏特電池或測光光電管-偵測系統中穿透光

1. 光伏特電池：硒的電子流其靈敏度很低，且對小於270 nm 及大於700 nm 的波長不敏感。

2. 真空電光管：有兩個電極維持一個電位差，當入射的輻射光投至陰極引起電子的反射(光電效應)，電子會在陽極(正極)被收集，光電流可立即被放大偵測。

3. 光電倍增管(photomultiplier tube ，PMT) ：是一般光電管的衍生物。有數個中間電極(倍增電極，dynodes) 。

(一) 基本原理：利用分子經過多孔性介質時會有不同移動速度而將其分離的實驗

技術稱為層析法。層析法基本原理為利用各種物質對吸附用的靜相（stationary phase ；固體材料或基質）和流過靜相的動相（mobile phase ；緩衝溶液或溶劑）有不同的親和力而將其分離。

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6(二) 基礎理論：分配係數及相對移動速度，分離的過程中，分子會被固體材料（靜

相）所吸附，需要先定出該分子對靜相及（或）動相的親和力。

圖1-4管柱層析系統

1. 分配係數（partition coefficient ；α）：表示一個物質對靜相的親和力。分配係數數值介於0與1之間。分配係數α值越大表示該成分對靜相的親和力越大。

數學公式：

被靜相吸附的分子數 α＝

在靜相與在動相的分子總數

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2. 相對移動速度：表示分子對動相之親和力，其定義為：分子與動相通過固體材料的相對移動速度。

R f ＝1-α

3. 解析度 (Resolution;R) 最大化是任何層析想要達成之目標。

圖1-5層析解析度