分子医学技能实验课件：分子医学技能-实验三
分子医学实验：PBMCs的分离和计数
PBMCs的分离和计数
实验ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的和要求
• 掌握PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)分离的方法 • 掌握细胞计数的方法
实验原理
外周血中细胞种类
细胞密度
红细胞和多核白细胞
1.092-1.093
PBMC(淋巴细胞和单核细胞)
1.074
淋巴细胞分离液：Ficoll-Hypague 1.077
不着色）
活细胞数
活细胞百分率 =
细胞总数
× 100%
密度梯度离心法分离PBMCs：
纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上
注意事项
• 稀释的肝素抗凝血，沿管壁轻轻叠加于分离液上 ，使两者形成一个清晰地界面。
• 细胞经离心分层后，缓慢小心吸取，切勿打破形 成的细胞层。
数上不数下，数左不数右。
细胞计数板
细胞计数
用100ulHank’s液重悬细胞
取10ul细胞悬液+40ul Hanks'液 +50ul台盼兰, 混匀
取10ul于细胞计数板上
进行细胞计数
实验结果计算
细胞数量：
单个核细胞浓度（细胞数/ml)
= 2个大方格内细胞总数 ×104×稀释倍数
2
细胞活力检测：（台盼兰染色：死细胞被染成蓝色，活细胞
实验步骤
稀释后的 抗凝血
淋巴细胞 分离液
肝素抗凝静脉血1-1.5
ml 加等体积的Hank’s液稀释
置于2ml淋巴细胞分离液上
(交界液面：一定不要打乱)
离心（2000rpm， 25min）
血浆
分层液 红细胞 粒细胞
分子医学技能实验课件：分子医学技术与科研课题设计
课题设计：
探讨厚朴酚抗东莨菪碱诱导的小鼠学习记忆减退作用的具体机制。 即：其机制可能与厚朴酚抗脂质过氧化、抗海马AChE（乙酰胆碱 酯酶）阳性神经纤维减少有关。
10
题目：应用聚合酶链反应（PCR）分析HBV感染者病毒DNA的 整合状态
1. 研究目的与意义 2. 实验材料和试剂 3. 实验方法和步骤 4. 实验指标 5. 实验预期结果的描述 6. 实验结果的分析及说明的问题
11
1、基础研究类课题设计 2、临床应用类课题设计
形式：2~3人一组，自由组合要撰写标 书并准备PPT，每组组员合作讲解（16W）
厚朴酚怎么实现其抗脂质过氧化损伤，抑制海马神经元退行性变， 维持海马神经元中AChE阳性神经纤维数目、AchE和NOS的正常 活性的，即厚朴酚完成这些作用的信号通路是怎样的？
试剂：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳所用试剂 仪器与设备：电泳仪、电泳槽、染色缸、漂洗缸、烧 杯、吸管、微量移液器
6
3.实验方法和步骤
方法：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 步骤： 试剂准备
制胶 样品处理 电泳 染色与脱色
7
4.实验观察指标
聚丙烯酰胺凝胶上电泳区带的分布 电泳区带颜色深浅
8
5.实验预期结果的描述
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临床应用类课题设计
1、临床应用研究背景及课题研究目的 2、课题研究思路 3、研究方案：材料与方法、仪器、操作步骤 4、预期结果及讨论 5、可行性分析、临床应用前景验背景 2、实验目的 3、实验方案：材料与方法、仪器、操作步骤 4、预期结果或结论 5、讨论和可行性分析 6、参考文献
分子医学实验-DNA多态性
試寫出幾種檢測DNA多態性的基因技術1〃限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多態性，致使DNA 分子的限制酶切位元點及數目發生改變，用限制酶切割基因組時，所產生的片段數目和每個片段的長度就不同，即所謂的限制性片段長度多態性，導致限制片段長度發生改變的酶切位點，又稱為多態性位點。
最早是用Southern Blot/RFLP方法檢測，後來採用聚合酶鏈反應（PCR）與限制酶酶切相結合的方法。
現在多採用PCR-RFLP法進行研究基因的限制性片段長度多態性。
2〃單鏈構象多態性（SSCP）：是一種基於單鏈DNA構象差別的點突變檢測方法。
相同長度的單鏈DNA如果順序不同，甚至單個堿基不同，就會形成不同的構象。
在電泳時泳動的速度不同。
將PCR產物經變性後，進行單鏈DNA凝膠電泳時，靶DNA中若發生單個堿基替換等改變時，就會出現泳動變位（mobility shift），多用於鑒定是否存在突變及診斷未知突變。
3〃PCR-ASO探針法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特異性寡核苷酸探針法。
在PCR擴增DNA片段後，直接與相應的寡核苷酸探雜交，即可明確診斷是否有突變及突變是純合子還是雜合子。
其原理是：用PCR擴增後，產物進行斑點雜交或狹縫雜交，針對每種突變分別合成一對寡核苷酸片段作為探針，其中一個具有正常序列，另一個則具有突變堿基。
突變堿基及對應的正常堿基勻位於寡核苷酸片段的中央，嚴格控制雜交及洗脫條件，使只有與探針序列完全互補的等位元基因片段才顯示雜交信號，而與探針中央堿基不同的等位元基因片段不顯示雜交信號，如果正常和突變探針都可雜交，說明突變基因是雜合子，如只有突變探針可以雜交，說明突變基因為純合子，若不能與含有突變序列的寡核苷探針雜交，但能與相應的正常的寡核苷探針雜交，則表示受檢者不存在這種突變基因。
分子医学技能
*分子医学与分子医学技术 *分子生物学实验室安全与环保 *视频：21 世纪的生命科学
*分子医学与分子医学技术
Molecular medicine and molecular medical technology
分子生物学 的成长过程
19世纪末
核素
1944年确认了遗传的物质基础是DNA。
1953年J Watson 和F CricK提出了DNA双 螺旋结构模型。
分子医学 (Molecular Medicine)
从基因的角度重新认识疾病，运用基因技术预防和 治疗疾病。
目前基因技术大多数尚待完善，前景却未可限量。 从伦理、道德、法律、社会的角度审视基因技术的应 用和对生命的干预。
“Molecular medicine encompasses the discovery of fundamental molecular components that determine normal cellular behavior, the dissection of aberrant genetic expression or interaction, and the modulation or correction of those aberrations for the purpose of disease diagnosis, treatment and prevention. The key difference between the molecular medicine and the traditional medicine is that the former bases its understanding of the diseases and operations upon a molecular and genetic level.”
分子生物学实验技能
PCR反应体系与反应条件
dH2O 10ΧPCR反应缓冲液 25 mM Mg2+ 6.1 μ L 1 μL 0.8 μ L
95℃ 2’30’’
DNA 双螺旋结构
1953年沃森和克里克提出 了DNA的双螺旋结构,开创 了分子生物学的新纪元。
并在此基础上提出的中心
法则，描述了遗传信息从 基因到蛋白质结构的流动
常见的DNA符号
gDNA（基因组DNA） plasmid DNA（质粒DNA） mtDNA（线粒体DNA） ssDNA(鲑鱼精DNA) cDNA(互补DNA)
问题可能原因解决方法产量太低样本裂解或匀浆不充分延长匀浆时间rna沉淀溶解不充分65加热可促进溶解a260a280165匀浆时样本太多而抽提液使用量太小增加rna抽提试剂用量匀浆后样本没有静置室温静置5分钟促进裂解反应水相中可能有酚残留吸取上清时应注意操作的正确性rna沉淀溶解不充分加热可促进溶解测比值时rna溶解在depc水中低的离子浓度和ph值增加了280nm的吸光值比值时采用te溶液溶解rnarna降解取样操作不正确取样后应立即抽提和冻存样本保存不当80或液氮保存液相中可能有rna酶污染采用rna抑制剂制胶时所用甲醛的ph值小于35试剂新鲜配制dna污染匀浆时样本太多而抽提液使用量太小增加抽提液用量蛋白多糖污染抽提时蛋白和多糖去除不彻底rna沉淀时加入部分盐溶液选择性沉淀rna原位杂交insituhybridization原位核酸分子杂交技术insitunucleicacidmolecularhybridization简称原位杂交技术
分子医学实验实验报告
一、实验名称分子生物学实验：基因表达调控研究二、实验日期2023年3月20日三、实验目的1. 了解基因表达调控的基本原理和方法；2. 掌握分子生物学实验操作技术；3. 研究特定基因在不同条件下的表达调控情况。
四、实验原理基因表达调控是指生物体内基因转录和翻译过程中，通过一系列分子机制对基因表达水平进行精确调控的过程。
本实验采用实时荧光定量PCR技术，检测特定基因在不同条件下的表达水平，以研究其表达调控机制。
五、主要仪器与试剂1. 仪器：实时荧光定量PCR仪、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等；2. 试剂：DNA模板、引物、PCR反应试剂、实时荧光定量PCR试剂、DNA提取试剂盒等。
六、实验步骤1. DNA提取：采用DNA提取试剂盒提取细胞总DNA；2. 引物设计：根据基因序列设计特异性引物；3. PCR扩增：以提取的DNA为模板，进行PCR扩增；4. 实时荧光定量PCR：将PCR产物进行实时荧光定量PCR，检测基因表达水平；5. 数据分析：分析实时荧光定量PCR结果，比较不同条件下基因表达水平的差异。
七、注意事项1. DNA提取过程中，应避免DNA降解；2. 引物设计应保证特异性，避免非特异性扩增；3. PCR扩增过程中，应控制好反应条件，避免假阳性结果；4. 实时荧光定量PCR过程中，应严格控制反应条件，保证数据准确性。
八、实验结果1. DNA提取：成功提取细胞总DNA；2. 引物设计：设计特异性引物；3. PCR扩增：成功扩增目的基因；4. 实时荧光定量PCR：检测到目的基因在不同条件下的表达水平差异。
九、讨论1. 实验结果表明，目的基因在不同条件下具有不同的表达水平，表明基因表达受到多种调控因素的影响；2. 通过实时荧光定量PCR技术，成功研究了目的基因的表达调控机制，为后续研究提供了实验依据；3. 本实验采用的技术手段较为成熟，为分子生物学实验提供了参考。
十、实验结论1. 成功提取细胞总DNA，设计特异性引物；2. 实时荧光定量PCR技术成功检测到目的基因在不同条件下的表达水平差异；3. 本研究为基因表达调控研究提供了实验依据，为进一步研究提供了参考。
分子生物学实验基本技术
分子生物学实验进程
实验一 真核细胞染色体DNA的分离制备 DNA样品的纯化、定量和电泳检测 实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化 实验三 碱变性法小量制备质粒 DNA的限制性酶切 实验四 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 质粒DNA的连接和转化 实验五 真核细胞RNA的制备和逆转录PCR 实验六 Western印迹（上） 实验七 Western印迹（下） 实验八 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测 实验九 多聚酶链式反应（PCR）反应 实验十 Northern印迹 实验十一 Southern印迹 考试
1966
1972 1973 1973 1977 1977 1982 1986 2001
Finished unraveling the code; Nirenberg & Khorana
Recombinant DNA made in vitro; P. Berg DNA cloned on a plasmid; H. Boyer & S. Cohen Discovery of reverse transcriptase; H. Temin Rapid DNA sequencing; F. Sanger & W. Gilbert Discovery of split genes; Sharp, Roberts et al. Discovery of ribozymes; T. Cech & S. Altman Creation of PCR; K. Mullis et al. Human Genome Project; Venter, Collins and many others
段连接起来构成一个新的DNA分子的过程。
分子克隆（molecular cloning）：重组体分子的无性 繁殖过程。
分子医学医学分子生物学
ห้องสมุดไป่ตู้免疫疗法
干细胞治疗
免疫疗法是当前研究的热点，未来将进一 步探索免疫细胞和分子在疾病治疗中的作 用，为癌症等疾病提供新的治疗策略。
干细胞治疗具有巨大的潜力，未来将进一 步研究干细胞分化机制，为再生医学和疾 病治疗提供新的途径。
技术挑战与伦理问题
技术挑战
随着分子医学技术的不断发展，如何提高检测的灵敏度和特异性、降低检测成本、实现高通量检测等是当前面临 的技术挑战。
细胞周期与细胞凋亡
细胞周期
细胞周期是指细胞分裂和增殖的过程，分为间期和分裂期两个阶段。间期是细胞进行DNA复制和蛋白 质合成的时期，分裂期是细胞将遗传物质平均分配到两个子细胞中的时期。
细胞凋亡
细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，自主结束生命的过程。细胞凋亡是一种正常的细胞死 亡方式，有助于维持机体内环境的稳定。然而，异常的细胞凋亡也与许多疾病的发生和发展有关。
展提供有力支持。
分子医学的历史与发展
历史回顾
分子医学的研究可以追溯到20世纪初遗传学的兴起，随着 分子生物学和生物技术的不断发展，分子医学逐渐成为一 门独立的学科。
当前发展
随着基因组学、蛋白质组学、代谢组学等新兴领域的出现 和发展，分子医学的研究范围和深度不断拓展，为疾病的 预防、诊断和治疗提供了更多可能性。
04 医学分子生物学研究方法
基因克隆与表达
基因克隆
通过基因工程技术将特定基因从 生物体中分离出来，并在体外进 行复制和扩增的过程。
基因表达
研究特定基因在不同生理或病理 条件下转录和翻译水平的表达情 况，以及如何调控基因的表达。
基因敲除与敲入
基因敲除
利用基因编辑技术（如CRISPR-Cas9 系统）将特定基因从生物体中删除或 破坏，以研究其在生物学中的作用。
分子医学技能：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
特点：
❖斑点可持久保存并进行计数分析
❖易操作、有效、快速、灵敏度高
✓ 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 ✓ 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍
❖样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分 析系统进行快速、客观的分析
❖
基
Coating Ab
本
包被培养孔
原
理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
❖ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）
▪ 结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即 ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子 的分泌情况；
▪ 用抗体原位捕获培养中的细胞分泌的细胞因子， 并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
❖双色ELISPOT结果示意图
蓝色：IFN-γ,红色：IL-2; 蓝色：IFN-γ,红色：IL-17
❖ ELISPOT
▪ B细胞杂交瘤的筛选 ▪ 化合物和药物免疫学反应的检测 ▪ 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 ▪ 靶向疫苗的质控
方 ▪ 自身免疫疾病的诊断和预后分析 法 ▪ 自身免疫疾病免疫治疗的监控 主 ▪ 过敏性疾病的脱敏治疗的监测 要 ▪ 器官移植中排斥反应的预测 用 ▪ 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析 途 ▪ 结核病的诊断
▪ 显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合
❖ ELISPOT 实 验 结 果 示 意 图
细胞因子A
双抗体包被
❖双色ELISPOT原理
培养细胞 细胞因子B
包被抗体
Biotin-检测抗体
HRP-检测抗体 BCIP/NBT底物
AEC底物
分子医学技能实验报告
分子医学技能实验报告一、实验目的本实验旨在探究分子生物学中的PCR（聚合酶链反应）技术在疾病诊断和基因检测等方面的应用，并通过实验操作熟悉PCR实验的各项操作，掌握PCR技术的具体操作流程。
二、实验原理PCR是一种用于扩增DNA序列的技术，其核心原理是DNA 双链变性后，通过两个寡核苷酸引物为模板引导DNA聚合酶对DNA进行扩增反应，产生数百万倍的DNA复制品。
PCR 有以下三个步骤：1.变性：将DNA双链变性为单链。
2.退火：引物结合到DNA序列上并延伸DNA链。
3.延伸：DNA聚合酶在引物及基因组DNA之间的空隙中延伸新的DNA链。
PCR是分子生物学中处理DNA分子的重要工具，它可以扩增任何DNA片段，也可以检测从单个细胞中获取的微量样本，具有快速、灵敏度高的特点。
PCR技术的应用包括人类基因诊断、遗传学研究、人类免疫缺陷病毒（HIV）病毒负载的测定、药品产生菌落的检测等等。
三、实验步骤1.提取DNA样本：将待检测的物种组织取出并切碎均匀，加入适量的甲醇和EB溶液，振荡混合均匀，静置15分钟。
2.离心和上清取DNA：加入异丙醇，密闭试管，震动混合后放浸泡于50-55°C水浴中，30分钟离心去上清液。
3.洗脱和质控：加入洗脱缓冲液，离心去上清液，将硅胶柱放入洗脱管中并涂满无菌去离子水，样品加入柱中，静置1分钟离心。
4.洗脱：加入洗脱缓冲液，静置1分钟后离心去除。
5.实验板钲嵌合物制备：将PCR反应液中的DNA对每个样品的量吸取1微升到钲嵌合物上，拉上钲盖，翻转钲嵌合物，轻轻地把液滴附着的最上面几个气泡压掉，放到真空拼板中。
6.PCR反应液制备：按照PCR反应液的组成混合样本DNA、反应体系和酶、正反引物，溶解喷雾器并均匀混合。
7.PCR反应：PCR反应使用扩展设备进行，根据试验板的特定程序扩增PCR产物。
四、实验结果本次实验结果表明，PCR技术在扩增DNA序列方面具有很大的优势，并且可以应用于许多领域，如疾病诊断、基因检测等方面。
分子医学概论课件
生物信息学分析
05
分子医学前沿领域
精准医学
是一种根据患者的基因、环境和生活方式等因素，量身定制最佳治疗方案的方法。它利用了基因组学、蛋白质组学和其它系统生物学技术，以及临床信息，来更精确地诊断、预防和治疗疾病。
基因组学
研究生物体基因组的科学，包括基因的识别、测序和功能研究。基因组学在精准医学中用于识别与特定疾病相关的基因变异，从而为患者提供个性化的治疗建议。
定义
分子医学具有跨学科性、微观性和精准性的特点。它涉及到生物学、化学、物理学等多个学科的知识，从微观的分子层面揭示生命现象的本质。同时，分子医学强调精准和个性化的治疗，为疾病的精准治疗提供了可能。
特点
定义与特点
分子医学的重要性
推动医学进步
分子医学的发展推动了医学的进步，为疾病的预防、诊断和治疗提供了新的思路和方法，提高了医疗水平和治疗效果。
分子医学概论课件
目录
分子医学概述 分子生物学基础 分子诊断与治疗 分子医学研究方法 分子医学前沿领域 分子医学应用案例
01
分子医学概述
分子医学是一门以分子生物学为基础，研究人体在正常和疾病状态下的生命活动及其规律的科学。它旨在从分子水平上揭示疾病的本质，为疾病的预防、诊断和治疗提供新的策略和方法。
1
2
3
通过分子生物学技术，将特定基因从生物体细胞中分离出来，并在体外进行复制和扩增的过程。
基因克隆
将克隆的基因导入到宿主细胞中，使其在细胞内表达并产生相应的蛋白质或酶的过程。
基因表达
基因克隆是分子生物学研究的重要手段，可用于基因功能研究、基因治疗、药物研发等领域。
克隆技术应用
基因克隆与表达
03
敲除与敲入技术的应用
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实验操作及注意事项
琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、1%倒胶 3mm、凝固后拔梳）
倒缓冲液，加样（样品中加入1/5体积的上样buffer） 电泳（方向、电压、时间）
染色与检测（EB10 min，紫外检测）
注意事项
• 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否则温度太高会 使制板变形
• 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要 弄坏点样孔
分子医学技能-实验三
琼脂糖凝胶电泳法
琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准 方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法 （如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当 用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出110ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的 位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA条带,用于以后的克隆操作。
• 离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时 (如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓 冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝 胶熔化或DNA变性。
实验材料及试剂
琼脂糖 电泳缓冲液：1TAE 6 加样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯 青、甘油 EB染色液； 溴化乙锭
影响凝胶电泳的因素
• 电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但电压增加，琼 脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最 大,所加电压不得超过5v/cm。
• 嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对 之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率 降低15％。
电泳指示剂
核酸电泳常用的指示剂有两 种，溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）呈蓝紫色；二甲 苯晴（ xylene cyanol, Xc ） 呈蓝色，它携带的电荷量比溴 酚蓝少，在凝胶中的迁移率比 溴酚蓝慢。
胶浓 （%）
0.6
1
1.4
2
溴酚蓝 1kb 0.6kb 0.2kb
0.15kb
DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在波长 为254nm~365nm的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的 荧光。
琼脂糖电泳分离DNA的范围
• 琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼脂糖凝 胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可 分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常 用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。
原理：
• 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解 离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向 正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持 物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的 核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核 酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染 料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所 在的位置。
• 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多 • EB有毒（现在用低毒的染料，好一点），切勿用手接触，
更不要污染环境，胶勿乱扔 • 紫外线照射不要太久
M
S1
S2
二甲苯 青
2kb 1.6kb
影响凝胶电泳的因素
• DNA的分子大小、构象 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与
DNA分子量对数成反比。 超螺旋DNA移动最快,开环其次、线状双链DNA移动最慢。 • 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度 琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓 度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。