分子医学实验方法
医学分子生物学pcr实验报告
医学分子生物学pcr实验报告医学分子生物学PCR实验报告一、实验目的•理解PCR原理及其在医学分子生物学中的应用•掌握PCR实验操作流程及技巧•学会分析实验结果并撰写实验报告二、实验原理•PCR是聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction) 的缩写•通过使用DNA聚合酶对特定DNA片段进行指数级扩增•用于诊断疾病、基因检测、基因表达分析等领域三、实验材料•被测样本DNA•引物 (Primer) 对•2x Taq Master Mix•无水乙醇•DNase/RNase-free deionized water•加热式PCR仪•凝胶电泳设备及相关试剂四、实验步骤1.设计并合成引物•根据目标序列选择特异性引物•检查引物的特异性和二聚体形成情况2.准备PCR反应混合液•按照实验设计，计算并配置各试剂的浓度和体积•将样本DNA、引物、2x Taq Master Mix和DNase/RNase-free水混合3.PCR扩增•设定PCR仪的温度和循环次数参数•将反应混合液放入PCR仪，开始扩增4.PCR产物检测•准备1%琼脂糖凝胶，加入适量甲醛•将扩增后的PCR产物进行凝胶电泳•观察电泳结果，分析PCR产物的分子量和条带强度5.结果分析及报告撰写•根据实验结果，分析样本中目标基因的存在与否•撰写实验报告，并对实验过程和结果进行讨论五、实验注意事项•避免引物二聚体的产生，以提高实验特异性•掌握PCR扩增的温度、时间和循环次数参数•减少实验中的污染，以提高实验准确性•正确分析实验结果，避免误判六、实验结果分析•经过PCR扩增后，观察到目标基因片段的明显条带•结果符合预期，证明实验成功•对异常结果进行讨论，分析可能的原因及改进措施七、结论•PCR实验在医学分子生物学中具有重要意义•通过本次实验，我们掌握了PCR实验的操作流程和技巧•实验结果可为疾病诊断、基因检测等提供有力依据Hello! How can I help you today? If you have any questions or need assistance, feel free to ask.。
分子医学实验：PBMCs的分离和计数
PBMCs的分离和计数
实验ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的和要求
• 掌握PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)分离的方法 • 掌握细胞计数的方法
实验原理
外周血中细胞种类
细胞密度
红细胞和多核白细胞
1.092-1.093
PBMC(淋巴细胞和单核细胞)
1.074
淋巴细胞分离液：Ficoll-Hypague 1.077
不着色）
活细胞数
活细胞百分率 =
细胞总数
× 100%
密度梯度离心法分离PBMCs：
纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上
注意事项
• 稀释的肝素抗凝血，沿管壁轻轻叠加于分离液上 ，使两者形成一个清晰地界面。
• 细胞经离心分层后，缓慢小心吸取，切勿打破形 成的细胞层。
数上不数下，数左不数右。
细胞计数板
细胞计数
用100ulHank’s液重悬细胞
取10ul细胞悬液+40ul Hanks'液 +50ul台盼兰, 混匀
取10ul于细胞计数板上
进行细胞计数
实验结果计算
细胞数量：
单个核细胞浓度（细胞数/ml)
= 2个大方格内细胞总数 ×104×稀释倍数
2
细胞活力检测：（台盼兰染色：死细胞被染成蓝色，活细胞
实验步骤
稀释后的 抗凝血
淋巴细胞 分离液
肝素抗凝静脉血1-1.5
ml 加等体积的Hank’s液稀释
置于2ml淋巴细胞分离液上
(交界液面：一定不要打乱)
离心（2000rpm， 25min）
血浆
分层液 红细胞 粒细胞
分子医学技能实验课件：分子医学技能-实验三
实验操作及注意事项
琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、1%倒胶 3mm、凝固后拔梳）
倒缓冲液，加样（样品中加入1/5体积的上样buffer） 电泳（方向、电压、时间）
染色与检测（EB10 min，紫外检测）
注意事项
• 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否则温度太高会 使制板变形
• 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要 弄坏点样孔
分子医学技能-实验三
琼脂糖凝胶电泳法
琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准 方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法 （如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当 用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出110ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的 位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA条带,用于以后的克隆操作。
• 离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时 (如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓 冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝 胶熔化或DNA变性。
实验材料及试剂
琼脂糖 电泳缓冲液：1TAE 6 加样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯 青、甘油 EB染色液； 溴化乙锭
影响凝胶电泳的因素
• 电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但电压增加，琼 脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最 大,所加电压不得超过5v/cm。
• 嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对 之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率 降低15％。
分子医学实验-DNA多态性
試寫出幾種檢測DNA多態性的基因技術1〃限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多態性，致使DNA 分子的限制酶切位元點及數目發生改變，用限制酶切割基因組時，所產生的片段數目和每個片段的長度就不同，即所謂的限制性片段長度多態性，導致限制片段長度發生改變的酶切位點，又稱為多態性位點。
最早是用Southern Blot/RFLP方法檢測，後來採用聚合酶鏈反應（PCR）與限制酶酶切相結合的方法。
現在多採用PCR-RFLP法進行研究基因的限制性片段長度多態性。
2〃單鏈構象多態性（SSCP）：是一種基於單鏈DNA構象差別的點突變檢測方法。
相同長度的單鏈DNA如果順序不同，甚至單個堿基不同，就會形成不同的構象。
在電泳時泳動的速度不同。
將PCR產物經變性後，進行單鏈DNA凝膠電泳時，靶DNA中若發生單個堿基替換等改變時，就會出現泳動變位（mobility shift），多用於鑒定是否存在突變及診斷未知突變。
3〃PCR-ASO探針法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特異性寡核苷酸探針法。
在PCR擴增DNA片段後，直接與相應的寡核苷酸探雜交，即可明確診斷是否有突變及突變是純合子還是雜合子。
其原理是：用PCR擴增後，產物進行斑點雜交或狹縫雜交，針對每種突變分別合成一對寡核苷酸片段作為探針，其中一個具有正常序列，另一個則具有突變堿基。
突變堿基及對應的正常堿基勻位於寡核苷酸片段的中央，嚴格控制雜交及洗脫條件，使只有與探針序列完全互補的等位元基因片段才顯示雜交信號，而與探針中央堿基不同的等位元基因片段不顯示雜交信號，如果正常和突變探針都可雜交，說明突變基因是雜合子，如只有突變探針可以雜交，說明突變基因為純合子，若不能與含有突變序列的寡核苷探針雜交，但能與相應的正常的寡核苷探針雜交，則表示受檢者不存在這種突變基因。
分子医学医学分子生物学
分子医学领域学术期刊
• Molecular Medicine • Journal of Cellular and Molecular
Medicine • International Journal of Molecular
Medicine • Trends in Molecular Medicine • Current Molecular Medicine • Methods in Molecular Medicine • ……
前沿技术： 1．生物技术
〔1〕靶标发现技术 〔2〕动植物品种与药物分子设计技术 〔3〕基因操作和蛋白质工程技术 〔4〕基于干细胞的人体组织工程技术 〔5〕新一代工业生物技术
国家中长期科学和技术开展规划纲要
根底研究： 2．科学前沿问题 〔1〕生命过程的定量研究和系统整合 〔7〕脑科学与认知科学 3．面向国家重大战略需求的根底研究 〔1〕人类安康与疾病的生物学根底 4．重大科学研究方案 〔1〕蛋白质研究 〔2〕量子调控研究 〔3〕纳米研究 〔4〕发育与生殖研究 〔5〕干细胞研究
基因工程技术的建立
➢ 1985年Cetus公司Mullis等创造聚合酶链式反响〔PCR〕 ➢ 1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外 ➢ 重组成功，获得了新的重组DNA分子，并成功转化大肠杆 ➢ 菌，打破了种属界限。 ➢ 1973年，Cohen和Boyer获得美国首个DNA重组技术专利
约30Mb的测序任务。 重要事件：2000年6月28日人类基因组工作草图完成
2003年4月14日, 人类基因组序列图绘制成功 2004年10月，人类基因组完成图公布 2005年3月，人类X染色体测序工作根本完成
分子生物学的里程碑
人类基因组方案(human genome project, HGP)
医学分子生物学实验课件
121 ttttgtcgca ctctccttgtt tttgacaatg caatcatat gcttctgcta tgttaagcgt
目的基因片段长度：330bp 181 attcaacagc gatgattaca gtccagctgt gcaagagaat attcccgctc tccggagaag
分子生物学实验
一、人类基因组DNA提取 二、PCR技术 三、RFLP技术
1
实验流程图
采集血液样本
提取基因组DNA
基因位点的PCR扩增
琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物
PCR产物酶切
琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物
DNA凝胶成像系统判读基因型
统计分析各等位基因频率
2
一、人类基因组DNA提取 材料：生物组织、培养细胞、血液样品 常规提取基因组DNA主要步骤： 1.破碎细胞： （1）物理方法：超声波、匀浆、液氮研磨 法等（易导至DNA链的断裂 ） （2）化学等温和方法（获得大分子量DNA）
10
引物：能与模板DNA两条链上的各一 段序列互补的寡核苷酸（15～20bp）
SRY基因引物：
上游引物：5′GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG3′ 下游引物：5′CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTC 3' 扩增DNA片段长度：330bp
11
SRY基因部分序列
1 gttgaggggg tgttgagggc ggagaaatgc aagtttcatt acaaaagtta acgtaacaaa
1OD260单链DNA或RNA≈40μg/ml 样品纯度判定：OD260/ OD280 ≈ 1.8～2.0 DNA或RNA较纯
分子医学概论实验报告
一、实验名称分子医学概论实验二、实验目的1. 了解分子医学的基本概念和原理。
2. 掌握分子生物学实验技术的基本操作。
3. 学习如何分析实验数据，并撰写实验报告。
三、实验原理分子医学是一门研究疾病发生、发展及治疗机制的科学，涉及分子生物学、遗传学、生物化学等多个学科。
本实验旨在通过分子生物学实验技术，了解基因表达调控、蛋白质功能研究等基本原理。
四、实验材料1. 试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、电泳试剂等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。
3. 样本：细菌、细胞等。
五、实验步骤1. DNA提取：按照DNA提取试剂盒说明书操作，提取细菌或细胞的基因组DNA。
2. PCR扩增：根据目的基因设计引物，进行PCR扩增。
3. 电泳分析：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。
4. 数据分析：对电泳结果进行拍照，分析扩增产物的大小和纯度。
六、实验结果1. DNA提取：成功提取到基因组DNA，A260/A280值在1.8-2.0之间。
2. PCR扩增：成功扩增到目的基因片段，大小约为500bp。
3. 电泳分析：在凝胶上观察到清晰的目的基因条带。
七、讨论分析1. DNA提取：DNA提取是后续实验的基础，本实验成功提取到基因组DNA，为后续实验提供了可靠的材料。
2. PCR扩增：PCR扩增是分子生物学实验中常用的技术，本实验成功扩增到目的基因片段，表明实验操作正确。
3. 电泳分析：电泳分析是检测PCR产物的重要手段，本实验观察到清晰的目的基因条带，说明实验结果可靠。
八、实验结论1. 成功提取到基因组DNA，为后续实验提供了可靠的材料。
2. 成功扩增到目的基因片段，表明实验操作正确。
3. 实验结果可靠，为分子医学研究提供了实验依据。
九、注意事项1. 操作过程中要严格遵守无菌操作规程，防止污染。
2. 实验试剂要新鲜配制，确保实验效果。
3. 电泳过程中要注意电压和电流的稳定，防止电泳失败。
通过本次实验，我们对分子医学的基本概念和原理有了更深入的了解，掌握了分子生物学实验技术的基本操作，为今后的研究工作打下了基础。
分子医学实验实验报告
一、实验名称分子生物学实验：基因表达调控研究二、实验日期2023年3月20日三、实验目的1. 了解基因表达调控的基本原理和方法；2. 掌握分子生物学实验操作技术；3. 研究特定基因在不同条件下的表达调控情况。
四、实验原理基因表达调控是指生物体内基因转录和翻译过程中，通过一系列分子机制对基因表达水平进行精确调控的过程。
本实验采用实时荧光定量PCR技术，检测特定基因在不同条件下的表达水平，以研究其表达调控机制。
五、主要仪器与试剂1. 仪器：实时荧光定量PCR仪、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等；2. 试剂：DNA模板、引物、PCR反应试剂、实时荧光定量PCR试剂、DNA提取试剂盒等。
六、实验步骤1. DNA提取：采用DNA提取试剂盒提取细胞总DNA；2. 引物设计：根据基因序列设计特异性引物；3. PCR扩增：以提取的DNA为模板，进行PCR扩增；4. 实时荧光定量PCR：将PCR产物进行实时荧光定量PCR，检测基因表达水平；5. 数据分析：分析实时荧光定量PCR结果，比较不同条件下基因表达水平的差异。
七、注意事项1. DNA提取过程中，应避免DNA降解；2. 引物设计应保证特异性，避免非特异性扩增；3. PCR扩增过程中，应控制好反应条件，避免假阳性结果；4. 实时荧光定量PCR过程中，应严格控制反应条件，保证数据准确性。
八、实验结果1. DNA提取：成功提取细胞总DNA；2. 引物设计：设计特异性引物；3. PCR扩增：成功扩增目的基因；4. 实时荧光定量PCR：检测到目的基因在不同条件下的表达水平差异。
九、讨论1. 实验结果表明，目的基因在不同条件下具有不同的表达水平，表明基因表达受到多种调控因素的影响；2. 通过实时荧光定量PCR技术，成功研究了目的基因的表达调控机制，为后续研究提供了实验依据；3. 本实验采用的技术手段较为成熟，为分子生物学实验提供了参考。
十、实验结论1. 成功提取细胞总DNA，设计特异性引物；2. 实时荧光定量PCR技术成功检测到目的基因在不同条件下的表达水平差异；3. 本研究为基因表达调控研究提供了实验依据，为进一步研究提供了参考。
分子诊断试验方法学验证
• CAP提出了明确的要求：“实验室必须进行分析验证各项检测的性能参数”， 还对验证试验覆盖的标本范围（如不同的基因型等）、标本类型（如血液、 尿液、新鲜/冷冻组织、石蜡包埋组织等）、验证的参数（如参考值、报告范 围、准确度、分析灵敏度、分析特异性和精确度等）做了相应的规定。
[5]Guzel O, Guner EI. ISO 15189 accreditation: Requirements for quality and competence of medical laboratories, experience of a laboratory I. Clin Biochem,2009,42: 274-278. [6]Yanikkaya-Demirel G. ISO 15189 accreditation: Requirements for quality and competence of medical laboratories, experience of a laboratory II. Clin Biochem,2009,42: 279-283. [7]Jennings L, Van DV, Gulley ML. Recommended principles and practices for validating clinical molecular pathology tests. Arch Pathol Lab Med,2009,133: 743755.
正分子医学实验报告
正分子医学对氧化应激干预实验二、实验日期2023年11月15日三、实验目的本研究旨在探讨正分子医学在氧化应激干预中的作用，通过实验验证特定营养素对细胞内抗氧化水平的影响，从而为慢性疾病的治疗提供理论依据。
四、实验原理正分子医学是利用营养来源的前体来调整分子的生理水平，以促进最佳健康。
本实验中，我们选取谷胱甘肽（GSH）、L-谷氨酰胺、甘氨酸、N-乙酰半胱氨酸等抗氧化剂作为研究对象，通过体外细胞实验，观察这些物质对氧化应激的影响。
五、主要仪器与试剂1. 仪器：- CO2培养箱- 光学显微镜- 流式细胞仪- 分光光度计- 高速离心机2. 试剂：- 人肝癌细胞系HepG2- 氧化应激诱导剂H2O2- 谷胱甘肽、L-谷氨酰胺、甘氨酸、N-乙酰半胱氨酸等抗氧化剂- 细胞培养试剂- 其他实验室常用试剂1. 细胞培养：将HepG2细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，待细胞生长至对数生长期时，用于实验。
2. 氧化应激诱导：将细胞分为对照组、氧化应激组、谷胱甘肽组、L-谷氨酰胺组、甘氨酸组和N-乙酰半胱氨酸组。
氧化应激组加入一定浓度的H2O2，其余各组分别加入相应的抗氧化剂。
3. 细胞观察：观察各组细胞形态、活力等变化。
4. 氧化应激指标检测：- 通过流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）水平；- 通过分光光度计检测细胞内谷胱甘肽（GSH）水平；- 通过蛋白质印迹法检测细胞内抗氧化酶活性。
5. 数据分析：对实验数据进行统计分析，比较各组之间的差异。
七、注意事项1. 实验操作过程中应严格遵守无菌操作规程，防止污染。
2. 实验试剂和细胞培养过程中，应注意温度、pH值等条件，保持细胞活性。
3. 实验数据应真实、准确，避免人为误差。
八、实验结果1. 细胞形态观察：氧化应激组细胞出现明显损伤，细胞膜破裂、细胞核变形；抗氧化剂处理组细胞形态基本正常。
2. 氧化应激指标检测：- 氧化应激组细胞内ROS水平显著升高，抗氧化剂处理组细胞内ROS水平明显降低；- 氧化应激组细胞内GSH水平显著降低，抗氧化剂处理组细胞内GSH水平明显升高；- 氧化应激组细胞内抗氧化酶活性显著降低，抗氧化剂处理组细胞内抗氧化酶活性明显升高。
分子医学检测方法的研究进展
分子医学检测方法的研究进展摘要：分子医学是一门快速发展的新兴领域，在疾病的早期诊断和治疗中起到了重要作用。
本文将重点介绍分子医学检测方法的研究进展，包括PCR技术、基因芯片技术和单细胞测序技术等。
引言：分子医学是通过研究和应用细胞和分子水平的生物学原理和技术来诊断、治疗和预防疾病的一门学科。
近年来，随着基因组学和生物技术的迅速发展，分子医学检测方法逐渐成为疾病诊断和治疗的重要手段。
本文将对分子医学检测方法的研究进展进行综述。
一、PCR技术的研究进展PCR（聚合酶链式反应）技术是一种基于DNA复制的技术，通过复制和扩增DNA片段，使其达到可检测的水平。
近年来，PCR技术在分子医学中的应用得到了广泛开展。
例如，在病原体检测方面，PCR技术可以快速、准确地检测出微生物感染，如病毒、细菌或寄生虫。
此外，PCR技术还可以应用于肿瘤诊断，通过检测肿瘤细胞中特定基因的突变情况，实现早期肿瘤的诊断和治疗。
二、基因芯片技术的研究进展基因芯片技术是一种基于DNA序列的高通量分析技术，可以快速检测上万个基因的表达水平。
目前，基因芯片技术在分子医学领域有广泛的应用。
例如，在肿瘤研究中，基因芯片技术可以帮助鉴定肿瘤的亚型、分析预后预测因子以及筛选靶向治疗的药物。
此外，基因芯片技术还可以用于个体化医学和药物研发等方面的研究。
三、单细胞测序技术的研究进展单细胞测序技术是一种能够在单个细胞水平上进行基因组学和转录组学分析的技术。
随着技术的不断发展，单细胞测序技术越来越成为分子医学检测的研究热点。
通过单细胞测序技术，研究者可以深入了解单个细胞的功能状态、基因表达以及细胞类型和组织结构等信息，进而揭示疾病的发生机制和治疗靶点。
特别是在癌症研究中，单细胞测序技术有助于发现肿瘤内部的异质性，为个体化治疗提供依据。
结论：分子医学检测方法的研究进展为疾病的诊断和治疗提供了重要的工具和理论基础。
PCR技术、基因芯片技术和单细胞测序技术等新兴技术的应用，不仅提高了疾病的早期诊断率和准确性，还为个体化医学和精准治疗奠定了基础。
分子医学技能实验报告
分子医学技能实验报告一、实验目的本实验旨在探究分子生物学中的PCR（聚合酶链反应）技术在疾病诊断和基因检测等方面的应用，并通过实验操作熟悉PCR实验的各项操作，掌握PCR技术的具体操作流程。
二、实验原理PCR是一种用于扩增DNA序列的技术，其核心原理是DNA 双链变性后，通过两个寡核苷酸引物为模板引导DNA聚合酶对DNA进行扩增反应，产生数百万倍的DNA复制品。
PCR 有以下三个步骤：1.变性：将DNA双链变性为单链。
2.退火：引物结合到DNA序列上并延伸DNA链。
3.延伸：DNA聚合酶在引物及基因组DNA之间的空隙中延伸新的DNA链。
PCR是分子生物学中处理DNA分子的重要工具，它可以扩增任何DNA片段，也可以检测从单个细胞中获取的微量样本，具有快速、灵敏度高的特点。
PCR技术的应用包括人类基因诊断、遗传学研究、人类免疫缺陷病毒（HIV）病毒负载的测定、药品产生菌落的检测等等。
三、实验步骤1.提取DNA样本：将待检测的物种组织取出并切碎均匀，加入适量的甲醇和EB溶液，振荡混合均匀，静置15分钟。
2.离心和上清取DNA：加入异丙醇，密闭试管，震动混合后放浸泡于50-55°C水浴中，30分钟离心去上清液。
3.洗脱和质控：加入洗脱缓冲液，离心去上清液，将硅胶柱放入洗脱管中并涂满无菌去离子水，样品加入柱中，静置1分钟离心。
4.洗脱：加入洗脱缓冲液，静置1分钟后离心去除。
5.实验板钲嵌合物制备：将PCR反应液中的DNA对每个样品的量吸取1微升到钲嵌合物上，拉上钲盖，翻转钲嵌合物，轻轻地把液滴附着的最上面几个气泡压掉，放到真空拼板中。
6.PCR反应液制备：按照PCR反应液的组成混合样本DNA、反应体系和酶、正反引物，溶解喷雾器并均匀混合。
7.PCR反应：PCR反应使用扩展设备进行，根据试验板的特定程序扩增PCR产物。
四、实验结果本次实验结果表明，PCR技术在扩增DNA序列方面具有很大的优势，并且可以应用于许多领域，如疾病诊断、基因检测等方面。
分子生物学检测
生态系统的监测与评估
检测方法：DNA条形码技术、 宏基因组学等
应用领域：生物多样性评估、 生态系统健康评估等
监测内容：物种多样性、生态 系统功能、生态系统稳定性等
评估指标：物种丰富度、物种 均匀度、生态系统生产力等
生物多样性的研究
生物多样性的定 义：生物种类的 多样性、基因的 多样性和生态系 统的多样性
控制措施：制定生物入侵防控策略，如生物防治、化学防治等 案例分析：介绍一些成功的生物入侵检测与控制案例，如澳大利亚的兔子 入侵等
06
分子生物学检测的未来 发展
高通量测序技术的进一步发展
技术进步：高通量测序技术的不断发展，提高了检测速度和准确性
应用领域：高通量测序技术在医学、农业、环境等领域的应用越来越广泛
遗传性疾病的检测
遗传性疾病：由基 因突变引起的疾病
检测方法：基因测 序、基因芯片、 PCR等
应用领域：癌症、 遗传病、罕见病等
检测意义：早期发 现、早期治疗、预 防遗传性疾病
肿瘤的检测与诊断
基因突变检测：通过检测肿瘤细胞中的基因突变，判断肿瘤类型和分期
生物标志物检测：通过检测肿瘤细胞中的生物标志物，判断肿瘤的恶性 程度和预后
分子生物学检测的原理
利用DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的特性进行检测 通过PCR、基因测序、蛋白质分析等技术进行检测 检测结果可用于疾病诊断、遗传病筛查、药物研发等领域 检测过程需要严格的实验操作和精确的数据分析
分子生物学检测的应用
基因诊断：检测基因突变、基因表达异常等，用于疾病诊 断和预后评估
注意事项：探 针设计、杂交 条件、荧光显
微镜操作等
基因芯片法
原理：利用基因芯片技术，将大量基因片段固定在芯片上，通过检测基因片段的表达情况， 实现对基因的检测。
医学分子生物学实验技术 第4版
医学分子生物学实验技术第4版医学分子生物学实验技术在现代医学研究中扮演着至关重要的角色。
它为我们提供了研究分子水平上生物学过程的强大工具，帮助我们深入了解疾病的发生机制、诊断方法的改进以及药物研发的突破。
首先，分子生物学实验技术的重要性体现在其广泛的应用范围上。
无论是从基础研究到临床应用，这些技术都发挥着重要的作用。
比如，PCR技术可以快速扩增DNA片段，为基因测序和突变检测提供支持；蛋白质表达和纯化技术可以帮助研究人员获取足够数量的蛋白质，以进行结构分析和功能研究；基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）使得我们能够精确地改变细胞和生物体的基因组，对疾病相关基因进行研究和修复。
其次，这些实验技术在医学研究中的应用具有重要的指导意义。
通过研究细胞和分子水平上的生物学过程，我们可以更好地理解疾病的发生机制，并寻找新的诊断和治疗方法。
例如，利用实时定量PCR技术，研究人员可以检测疾病相关基因的表达水平，并据此判断疾病的严重程度和治疗效果。
另一方面，蛋白质组学技术可以帮助鉴定和定量蛋白质，从而找出疾病标志物，并发展出更准确的诊断方法。
除了研究和诊断方面的应用，医学分子生物学实验技术还在药物研发中发挥着重要作用。
例如，在药物筛选过程中，研究人员可以利用高通量测序技术对药物对基因组的影响进行全面的评估，以寻找潜在的药物靶点和副作用。
此外，CRISPR技术的发展也为精准医学和个体化治疗提供了新的方向，因为它可以帮助我们修复患者体内的病理基因，并开发出具有针对性的治疗方法。
综上所述，医学分子生物学实验技术在现代医学研究中具有重要的地位和作用。
它们不仅丰富了我们对生物学过程的理解，而且为疾病的诊断和治疗提供了强大的工具。
随着技术的不断发展和创新，相信它们将继续为医学领域带来新的突破和进步。
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不宜表达真核基因组DNA；
不能加工表达的真核蛋白质；
表达的蛋白质常形成不溶性包涵体； 很难表达大量可溶性蛋白。
2.真表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、费钱、产量低 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程
限制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因组PCR10PCR扩增目的基因
引物
5’ 3’ 5’ 5’
基因组
引物
引物设计：
（1) 序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。
（2）引物长度以15-40 bp为宜。
（3）碱基尽可能随机分布。
（4）引物内部避免形成二级结构。
（5）两引物间避免有互补序列。
K
L
FIXnull
获取基因的序列
在获取基因之前如果能知道基因的序列将使
这一过程变得非常方便。
人类基因组数据库提供了所有已知基因的序
列。
地址为/
化学合成法
较短的基因（<100 base）
用途：PCR引物
测序引物
定mRNA的定量检测——实时定量PCR 蛋白质的定性与定量——western
blot和
ELISA 细胞内mRNA的定位检测——原位杂交 细胞内蛋白质的定位检测——免疫组化 细胞内蛋白质的定位检测——荧光显微分析 细胞内蛋白质的定量检测——流式细胞技术
核酸分子杂交
序列互补的单链DNA与DNA、DNA与RNA及
如何在体外表达一个基因？
如何检测一个基因的表达？
如何在体外表达一个基因？
如何在体外表达一个基因
基因的获取 基因的克隆——重组DNA技术 基因的表达 基因产物的鉴定 表达产物的纯化
基因的获取
获取目标基因常常是基因操作具体的研究目的和 实验条件选用合适的方法。
分析细胞生长、分化、发育过程中有关基因的表达。
/v_show/id_XMTQ1NDg1NDcy.html
RT-PCR
MRNA的定量检测——实时定量RT-
PCR（REAL TIME RT-PCR）
Real
time PCR是一种定量PCR技术，用于定
量测定特定基因的起始模板数。
RNA与RNA间可按照碱基互补配对原则形成杂 交分子
如果将杂交分子中的一条单链连上标记物就成了
核酸探针
标记可以是同位素标记或非同位素标记
MRNA的检测——RNA印迹 （NORTHERN BLOT）
用DNA探针来检测特异基因的mRNA，以分析该
基因的表达情况及mRNA分子的大小，特别用于
(3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
( )
α 互 补
利用α互补原理筛选重组体pUC18
重组DNA技术
基因的表达
1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常
用)
优点：简单、经济、产量高
不足：
探针可以是同位素标记或非同位素标记的。
In situ hybridization of TRPM8 mRNA to a prostate adenocarcinoma. 4 µm sections were hybridized with the TRPM8 probe used in Northern and dot blot experiments. A) and B) hybridization of the antisense TRPM8 probe to an adenocarcinoma of the prostate. C) sense probe of TRPM8 and D) Haematoxilin and Elaun staining of the same patient.
（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制
TaqDNA聚合酶
模板DNA
dNTP
引物 Buffer
预变性
94oC5’
模板DNA
dNTP
引物 Buffer
循 环 仪
94℃
55 ℃
72 ℃
PCR技术的基本过程
加样孔
PCR产物
DNA Marker
琼脂糖凝胶电泳图谱
以基因组DNA为模板，得到的
PCR产物是含有内含子的基因
基因重组技术需要：
一个载体：
质粒、噬菌体、病毒、cosmid、BAC和YAC 等
二个酶：
限制性内切酶 连接酶
质粒是最常用的载体
复制起点ori
筛选基因 多克隆位点（Multiple
cloning site ，MCS）
ori
限制性内切酶——“分子剪刀”
限制性内切酶和连接酶共同作用可将不同的 DNA分子连接形成重组DNA分子
抗体标记可以是同位素标记或非同位素标记
常用的非同位素标记物为辣根过氧化酶
http://Western-blot
蛋白质的定量——ELISA
酶联免疫吸附法（ELISA）是利用了抗原抗
体特异识别与结合的特性而设计的蛋白质定
量测定方法，可用于测定蛋白质混合液中特
定蛋白质的浓度，是常用的蛋白质测定方法。
逆转录酶PCR（RT-PCR）
RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合 成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增 （达ng～ug水平）
ses/genomics/RTPCR/RT_PCR.html
方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射
表达载体的选择
表达载体必需具备转录和翻译必需的元件：启动子、
起始密码子、终止密码子等
原核表达载体：S-D序列
真核表达载体：增强子、Poly
A元件
cDNA是首选对象，既可在原核细胞又可在真核细胞
中表达
基因组DNA只能在真核细胞中表达
基因的克隆——重组 DNA技术
重组 DNA 技术作为分子医学中最重要、 最基本的技术之一，是许多分子医学实验 实施的基础，在基因诊断、治疗和预防中 具有举足轻重的意义。
人体基因克隆
Restriction enzyme EcoRI
–Bacterial enzyme that stops viral reproduction by cleaving viral DNA –Act as molecular scisssors (cut plasmids and foreign human DNA) –Produce short single stranded “sticky ends” where insertions of foreign DNA can be made 20
当模板为来自mRNA反转录的产物cDNA时，可
用于定量测定mRNA的模板数，从而确定特定基 因的表达水平
蛋白质的检测——WESTERN BLOT
这是一种利用特异抗体来鉴定相应蛋白质的
技术
蛋白质首先经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分
离后，转移到硝酸纤维素薄膜上，用带标记
的抗体进行结合鉴定
免疫组化技术
应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过标记抗
体与组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的结合， 可对蛋白进行定位、定性及定量的研究。
FACTOR IX 在巨核细胞中的表达
荧光显微技术
FACTOR IX 的荧光检测
hFIX G H Bright field I Overlay
2bF9-H J
/video/280/Enzyme-Linked-ImmunoabSorbant-Assay-reveald
原位杂交
一种用单链RNA或DNA探针通过分子杂交
对细胞或组织中的基因或mRNA分子在染色 体、细胞、组织或整个生物体上进行定位的 方法。可用于分析基因表达的组织特异性和 基因表达水平。
表达产物的鉴定
蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
对照 样品 分子量 Marker
表达蛋白生物学功能检测
淀粉酶基因表达
表达产物的纯化
分子筛 亲和柱 离子交换
抗原抗体
目的蛋白
安玛西亚快速蛋白纯化仪（FPLC）
如何检测一个基因的表达
mRNA的检测——northern RT-PCR
切 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
接
转
筛
转
• 质粒转入细菌——转化 (transformation) • 质粒转入真核细胞——转染 (transfection) • 病毒转入细胞——感染 (infection)
筛：重组体的筛选
1. 直接选择法
(1) 抗药性标记选择
(2) 标志补救(marker rescue)