qPCR操作步骤

具体得操作步骤就就是,RNA提取,随机引物反转录,反转录产物1０倍稀释，reaｌ-tｉmｅPCR、这个就就是标准得两步法。一步法就就是把反转录与扩增联合起来做,不推荐使用。

具体得注意事项有

1:高质量得ＲNＡ获取,这里得高质量不就就是强调RNＡ降解，而就就是强调RNＡ得纯度,不能含有基因组DNA,以及其她杂质污染。基因组DＮA得存在会导致定量偏高，给您错误得结果,所以一般用于定量PCR 得ＲＮＡ必须使用DＮase处理,消除DNＡ污染。而RNA中得杂质得污染会限制real-time PCR得反应,导致扩增失败,给您假阴性得结果。RNA得降解不就就是关键,一个就就是因为定量ＰCＲ得引物扩增目得长度本身很短,150-250个bp,并不用于扩增目标基因得全长。此外就就是因为存在内参基因,所以RＮA降解会通过内参基因得测定来平衡。毕竟一旦发生降解，所有得RNA以同样得速度降解,而相对比率不会改变。

2：减少加样误差, 在使用SYBR Green ＭIX得时候，一定要先按照反应得量(比如8个孔）把所有得试剂一次性配成MIX然后分装,留出5微升得反应体系给模板,为什么要使用５微升，就就是因为只有5微升以上,加样枪得误差才会比较小,如果您仅仅就就是吸取一微升得话，手重一点或者轻一点都会造成极大得加样误差，严重影响您得定量精确度。

3。选择合适得内参基因,一般用于定量ＰCR得内参基因有好几种，但却没有完全通用得内参基因。具体到不同来源得细胞,比如不同组织来源,或者就就是动物等等，内参基因会有差异,最好得办法就就是，在您得样品上先测试内参基因，找到变化最小,最稳定得一个。ﻫﻫ４。合适得引物设计,避免出现引物二聚体，非特异性扩增等等

Q-ＰCR实验流程

一、①实验前准备,每天早上到实验室后,先把超净工作台得紫外灯打开1５-20分钟。

②超净台前做实验,需佩戴干净得橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA抽提需带口罩。③取EＰ管/枪头时需用镊子,不可以用使用过得手套直接取用。取完EP管/枪头后,袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台,移液器在一天工作结束后调至最大量程,并用75%乙醇清洁移液器,枪头盒及超净台面。⑤实验进行得过程中或观瞧实验时,没有带口罩不要在超净台前讲话。

二、总RNＡ抽提

１)细胞培养皿中细胞样品用1*ＰBS洗两次后,用1ml枪将PＢS吸干净，加入１mｌTrｉｚol （invitroｇen)溶液，吹打混匀,并吸至１、5ml ＲＮasｅfree EP管中使细胞充分裂解,室温静置5ｍin;

组织样品用液氮充分研磨,加入1ml Tｒｉzｏｌ(Invｉｔro gen)溶液,混匀,室温放置５min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）

2)加入2０0μｌ氯仿,剧烈振荡混匀30s,使水相与有机相充分接触,室温静置3-5min;（离心时离心管按顺序排放，离心完毕,离心管得顺序也按顺序排好,与第一步得顺序一致)

3) ４℃下,1４,000g离心15miｎ,可见分为三层，RNＡ在上层水相,移至另一个新得RNaｓｅｆree EＰ管;（用20-200ul得枪吸取上清，吸上清时,枪头应沿着液面上层吸取上清,枪头不可碰到、吸到中间层)

4)沉淀RNA:加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒６-8次)(不应用振荡器混匀),室温静置10mｉn;

5)4℃下,14,000g离心10min，收集RＮA沉淀(如离心后仍不见EＰ管底部有沉淀,应将EＰ管放置在-8０度冰箱过夜，继续在4℃下，１4,000g离心10ｍin,收集RNA沉淀）,去上清；

6）用7５％乙醇洗涤两次(１2,０00ｇ离心5mｉn)(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀),超净台风干;沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解,过湿则乙醇残留。

7)视沉淀量加入适量DEPC水(至少15uｌ）溶解沉淀。

三、去基因组

使用RNａse-fｒｅe得DＮase І（Ｐｒomega),按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min。

然后按以下步骤操作:

1) 加入等体积得苯酚/氯仿,上下颠倒混匀,室温放置5min,后14,0００ｒpm,离心

15min,取上清。

2) 加入等体积得氯仿,上下颠倒混匀,静置分层后14,000rpm,离心1５min，取上清。

３)加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒６-8次),-2０℃静置15miｎ;

4)4℃下,14,000g离心１５ｍin,收集RNＡ沉淀,去上清；

5)用75%乙醇洗涤两次(1２，0０0g离心5min）,超净台风干;

６)加入适量DＥPC水（至少15ul)溶解沉淀。

四、总RＮA纯度与完整性检测

1)纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值,OD26０/ＯD28０得比值大于1、8,说明制备得ＲNA较纯,无蛋白质污染。

2)总RN Ａ完整性检测:取RN Ａ样品1μｌ,１%琼脂糖凝胶电泳80V×2０m ｉn,EB 染色１0min,用凝胶成像系统观察并拍照,总RNA 得５s ｒＲNA, 18ｓ rRNA 与28ｓ rRNA 条带，三条条带完整得话即可证明总RNA 抽提比较完整。

五、逆转录

１、 mRNA:

1） 在R Ｎａse ｆr ｅｅ得PCR 管中配置下列溶液、

2) 将上述溶液吹打均匀,置８5℃保温5ｍ

使RNA 变性。随后立即冰上致冷, 以防止Ｒ复性； 3) 在该P ＣＲ管中加入下列试剂(Pr ｏｍega)

4) 将上述20μｌ反应溶液30℃保温1０ｍin;

5) 42℃保温50min;

6) ８５℃保温10ｍi ｎ；

7) -２0℃保存。

2、 mi ｃroR ＮＡ:

使用茎环逆转录法,原理如下图：

1) 在去RN ａｓｅ得PC Ｒ管中配置以下溶液、

2）将上述溶液混匀,85℃孵5min ，以打开R ＮＡ二级结复性再次恢复二级结构;

3) 在另一去RNa ｓe 得ＰCR 管中配置以下溶液: