最新流式细胞术讲义
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流式细胞术课件
酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如 DCH, BCECF, BCECF-AM, SNAFLs, SNARFs等进行检测
Flow cytometry of apoptotic cell death
Phospholipid redistribution
第七节 细胞周期的检测
Flow cytometry of cell cycle
原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。 （n----2n）
以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。 首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞 （G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的 细胞又有 G1 期，S 期,G2 期和 M 期。
Flow cytometry of cell cycle
基本工作原理
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
现代流式细胞仪包括
液流系统 聚焦细胞以供检测
光学系统 激发和收集光信号
电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分 析
液流系统示意图
鞘液
Fluorescence signals
Focused laser beam
喷嘴
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
2. 光学系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
Flow cytometry of apoptotic cell death
Phospholipid redistribution
第七节 细胞周期的检测
Flow cytometry of cell cycle
原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。 （n----2n）
以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。 首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞 （G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的 细胞又有 G1 期，S 期,G2 期和 M 期。
Flow cytometry of cell cycle
基本工作原理
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
现代流式细胞仪包括
液流系统 聚焦细胞以供检测
光学系统 激发和收集光信号
电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分 析
液流系统示意图
鞘液
Fluorescence signals
Focused laser beam
喷嘴
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
2. 光学系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
流式细胞仪讲义2ppt课件
3
PMT
1
PMT
2
Bandpass Filters
Laser
完整版课件
5
流式细胞仪的液流系统
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
完整版课件
6
2、控制流式细胞仪可变性的具体步骤：
A、校正激发、发射光路 B、监控检测器的灵敏度(cv) C、监控仪器电子线路的稳定性
流式细胞术实验结果的质控
完整版课件
1
获得流式细胞术实验结果 必须经历以一下步骤：
1、检测样本的获得 2、抗体染色与洗涤 3、流式细胞仪对样本的采集、存取与分析
完整版课件
2
影响流式细胞术实验结果的
主要因数:
一、仪器的可变性。 二、标本的可变性。 三、操作过程的可变性。 四、数据分析的可变性
完整版课件
完整版课件
28
在DNA直方图中鉴别细胞增殖(SPF) 与DNA 异倍体G0/1细胞峰
完整版课件
29
在DNA直方图上，二倍体G0/1细胞出现右肩峰时，先对DNA直方图作二倍体周期 分析，若SPF比率与CD71+细胞检出率接近时，则该细胞峰为增殖细胞，若SPF 比率显著高于CD71+细胞检出率时，完整则版该课右件肩峰可能为DNA异倍体细G0/1峰。 30
完整版课件
19
荧光标记：FL1:CD3-FITC, FL2:CD(16-56-PE)
完整版课件
20
荧光标记：FL1:CD71.177
完整版课件
21
B、设联动门分析某些参数
完整版课件
22
4、二联体细胞对DNA含量分析的影响
PMT
1
PMT
2
Bandpass Filters
Laser
完整版课件
5
流式细胞仪的液流系统
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
完整版课件
6
2、控制流式细胞仪可变性的具体步骤：
A、校正激发、发射光路 B、监控检测器的灵敏度(cv) C、监控仪器电子线路的稳定性
流式细胞术实验结果的质控
完整版课件
1
获得流式细胞术实验结果 必须经历以一下步骤：
1、检测样本的获得 2、抗体染色与洗涤 3、流式细胞仪对样本的采集、存取与分析
完整版课件
2
影响流式细胞术实验结果的
主要因数:
一、仪器的可变性。 二、标本的可变性。 三、操作过程的可变性。 四、数据分析的可变性
完整版课件
完整版课件
28
在DNA直方图中鉴别细胞增殖(SPF) 与DNA 异倍体G0/1细胞峰
完整版课件
29
在DNA直方图上，二倍体G0/1细胞出现右肩峰时，先对DNA直方图作二倍体周期 分析，若SPF比率与CD71+细胞检出率接近时，则该细胞峰为增殖细胞，若SPF 比率显著高于CD71+细胞检出率时，完整则版该课右件肩峰可能为DNA异倍体细G0/1峰。 30
完整版课件
19
荧光标记：FL1:CD3-FITC, FL2:CD(16-56-PE)
完整版课件
20
荧光标记：FL1:CD71.177
完整版课件
21
B、设联动门分析某些参数
完整版课件
22
4、二联体细胞对DNA含量分析的影响
流式细胞术讲义
髓系细胞和单核细胞
7
CD20 FITC/CD22 PE/ CD45 PerCP
B淋巴系细胞及其分化程度
8
CD8 FITC/CD4 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞及其分化程度
9
CD3 FITC/CD16+56 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞、NK细胞
10
CD36 FITC/GP-A PE/ CD45 PerCP
❖ T细胞相关标志：
CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8
常用白血病免疫分型荧光素标记单克隆抗体组合及其意义
管号 1
三色标记McAb
MouseIgG1/ MouseIgG1/CD45 PerCP
染色细胞及目的
阴性对照及设门
2
CD5 FITC/CD7 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞、部分早期髓系细胞
样本要求：
➢ 肝素抗凝骨髓3ml(或外周血) ➢ 每天上午送检 ➢ 收费：
➢ 70元/每个单抗(临床常规检测12个单抗)
❖ 干/祖细胞标志：
CD34、CA133
❖ 髓系标志：
CD33、CD13、CD11b、CD15、MPO
❖ B细胞相关标志：
CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD79a、 CyIg、SmIg
3
CD10 FITC/CD19 PE/ CD45 PerCP
B淋巴系细胞
4
Anti-HLA-DA FITC / CD13 PE/ CD45 PerCP 髓系细胞、 B淋巴系细胞、部分T淋
巴系细胞
5
CD34 FITC/CD38 PE/ CD45 PerCP
反映细胞分化程度
流式细胞术(免疫学检验课件)
Region设置 Gate设置
第四节 FCM的临床应用
一、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群， 是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞， 主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。
不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性， 在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的CD抗原进 行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫 相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。
最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法 和表面活性剂处理法等。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围， 有利于进行临床回顾性研究和利用。
常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和 甲氧-双氧水处理法。
石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底， 获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过 长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可 获得单细胞悬液。
三、三参数直方图
三维坐标均为参数 （散射光或荧光）而 非细胞数
对复杂的细胞亚群观 察更为直观、准确， 但对其数据的统计分 析较难
四、多参数组合分析
FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术 能够无法显示四维空间结构。
随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧 光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以 获得所需的信息。
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
前向散射光示意图 细胞大小
结构复杂程度
侧向散射光示意图
血
液
白
细
胞
粒细胞
散
点
单核细胞
图
淋巴细胞
荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料 受激光激发后产生。
流式细胞术原理及应用课件
• DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上的 A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定 量染料。
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式 与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量 分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
实验步骤： •细胞处理（全血，培养的细胞） •染色（室温，20min） •离心洗涤（全血裂红） •上机检测
PPT学习交流
22
1)荧光素的选择：
• A、根据机器配置选择荧光素 • 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的
荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
PPT学习交流
16
PPT学习交流
17
二、荧光素
•荧光的概念：
＜
激发波长 Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
PPT学习交流
18
•激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光 •发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光
PPT学习交流
8
光学系统
透镜、滤光片、小孔； LP：long-pass filter BP：band-pass filter
460 500 540
SP：short-pass filter
LP 500
SP 500
BP500/50
PPT学习交流
9
信号检测与分析系统
物理参数 •FSC：前向角散色光， 代表细胞大小 •SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式 与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量 分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
实验步骤： •细胞处理（全血，培养的细胞） •染色（室温，20min） •离心洗涤（全血裂红） •上机检测
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22
1)荧光素的选择：
• A、根据机器配置选择荧光素 • 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的
荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
PPT学习交流
16
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17
二、荧光素
•荧光的概念：
＜
激发波长 Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
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18
•激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光 •发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光
PPT学习交流
8
光学系统
透镜、滤光片、小孔； LP：long-pass filter BP：band-pass filter
460 500 540
SP：short-pass filter
LP 500
SP 500
BP500/50
PPT学习交流
9
信号检测与分析系统
物理参数 •FSC：前向角散色光， 代表细胞大小 •SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度
流式细胞术的原理及应用ppt课件
➢可把感兴趣细胞分 选到特定培养孔或板 上（4路和24孔板）
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
流式细胞术ppt课件
可区分高FL细胞与低FL细胞。 一般的流式细胞仪装有一个激光光源（488nm），可
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
流式细胞术应用概述分析解析ppt课件
抑制免疫反应/杀伤异源细胞
CD3+CD8+CD28CD3+CD4+CD29-
CD3+CD4+CD8+
抑制性T细胞(Ts) 杀伤性T细胞(Tc)
活化的T细胞
抑制细胞和体液免疫 细胞毒性T细胞 在T细胞恶性增生时升高
CD3+CD4-CD8CD4+/CD8+比值 CD45RA+CD45RO-
表达 / T细胞受体(TCR / )
设定阴性、阳性范围
-
12
第二部分
流式细胞术在临床检测和科研中的应用
一、免疫学检测和科研应用
-
13
1、细胞表面分子标记
（以淋巴细胞亚群检测为例）
-
14
原理
人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可 分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤 细胞。
T淋巴细胞特异性标志为CD3，包括CD4＋和CD8＋T细胞 两个亚群；
幼稚的/静止的T淋巴细胞
当免疫系统没有能力更新辅助性或抑 制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此 细胞亚群较低
CD45RA-CD45RO+
记忆性T淋巴细胞
病菌感染时升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低
CD45RA+CD45RO+
活化的T细胞, 感染时升高 感染时升高
CD4+CD25+CD127- 调节性T细胞（Treg-)
T淋巴细胞
-
16
淋巴细胞亚群及功能
T淋巴细胞(CD3+) CD3+CD4+
名称
功能
辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti) 辅助和诱导细胞免疫和体液免疫
CD3+CD8+CD28CD3+CD4+CD29-
CD3+CD4+CD8+
抑制性T细胞(Ts) 杀伤性T细胞(Tc)
活化的T细胞
抑制细胞和体液免疫 细胞毒性T细胞 在T细胞恶性增生时升高
CD3+CD4-CD8CD4+/CD8+比值 CD45RA+CD45RO-
表达 / T细胞受体(TCR / )
设定阴性、阳性范围
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12
第二部分
流式细胞术在临床检测和科研中的应用
一、免疫学检测和科研应用
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13
1、细胞表面分子标记
（以淋巴细胞亚群检测为例）
-
14
原理
人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可 分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤 细胞。
T淋巴细胞特异性标志为CD3，包括CD4＋和CD8＋T细胞 两个亚群；
幼稚的/静止的T淋巴细胞
当免疫系统没有能力更新辅助性或抑 制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此 细胞亚群较低
CD45RA-CD45RO+
记忆性T淋巴细胞
病菌感染时升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低
CD45RA+CD45RO+
活化的T细胞, 感染时升高 感染时升高
CD4+CD25+CD127- 调节性T细胞（Treg-)
T淋巴细胞
-
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淋巴细胞亚群及功能
T淋巴细胞(CD3+) CD3+CD4+
名称
功能
辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti) 辅助和诱导细胞免疫和体液免疫
流式细胞术及其临床应用课件(1)
光源与光学系统
➢ 激发光源 ➢ 光学系统
信号收集与光电转 换系统
计算机与分析系统
细胞分选与浓缩系统
激发光源 滤光片
流动室、鞘 液和样本流
信号检测器
计算机分析
（二）激光光源与光学系统
（一）激发光源 ：激光器
气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
（四）计算机和分析系统
十字门
线性门
流式细胞仪特点
流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微 粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的 协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER
淋巴细胞亚群分析
试剂：BD Multitest IMK Kit 标本：外周血（常用） 配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC
（三）荧光信号
目前常用FCM配置（BD Calibar） 488nm激光管常用染料有 第一通道（FL1）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 第二通道（FL2）：PE (Phycorey- thrin) 第三通道（FL3）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5 633nm激光管常用染料有
1
10
2 700
3 720
4
15
……
Counts
0…………101…………102…………103
➢ 激发光源 ➢ 光学系统
信号收集与光电转 换系统
计算机与分析系统
细胞分选与浓缩系统
激发光源 滤光片
流动室、鞘 液和样本流
信号检测器
计算机分析
（二）激光光源与光学系统
（一）激发光源 ：激光器
气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
（四）计算机和分析系统
十字门
线性门
流式细胞仪特点
流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微 粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的 协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER
淋巴细胞亚群分析
试剂：BD Multitest IMK Kit 标本：外周血（常用） 配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC
（三）荧光信号
目前常用FCM配置（BD Calibar） 488nm激光管常用染料有 第一通道（FL1）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 第二通道（FL2）：PE (Phycorey- thrin) 第三通道（FL3）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5 633nm激光管常用染料有
1
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2 700
3 720
4
15
……
Counts
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GP-A
M7 ± ＋ ＋ － － ± － CD41
CD61
T-ALL免疫分型
CD2 CD3 CD5 CD7 CD4 CD8 TdT
早期
++±
+
－－
+
T-ALL
前
++
+
+
+
+
+
T－ALL
T-ALL
++
+
+
±±
+
B-ALL免疫分型
HLA- CD19 CD10 CD20 CD22 cIgM mIgM TdT
3
CD10 FITC/CD19 PE/ CD45 PerCP
B淋巴系细胞
4
Anti-HLA-DA FITC / CD13 PE/ CD45 PerCP 髓系细胞、 B淋巴系细胞、部分T淋
巴系细胞
5
CD34 FITC/CD38 PE/ CD45 PerCP
反映细胞分化程度
6
CD14 FITC/CD33 PE/ CD45 PerCP
❖ T细胞相关标志：
CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8
常用白血病免疫分型荧光素标记单克隆抗体组合及其意义
管号 1
三色标记McAb
MouseIgG1/ MouseIgG1/CD45 PerCP
染色细胞及目的
阴性对照及设门
2
CD5 FITC/CD7 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞、部分早期髓系细胞
➢ 对于临床原/幼细胞群定量应以原/幼细胞 群的细胞数为分母。
➢ 对于临床原/幼细胞群定性比定量更重要。
白血病免疫分型病例分析
病例1 梁丽琴 女性 24岁 异常表型中:
CD10+. CD34+. CD22+. CD38+. CD19+. HLA-DR+
结论：表型符合 Pre-B-ALL
设门方案
采用CD45/SSC设门法 （优于FSC/SSC设门法）
CD45其表达程度在不 同细胞各异。淋巴细胞 >单核细胞>成熟粒细胞 >原/幼细胞，而红细胞 不表达。
SSC在成熟粒细胞>单 核细胞>原/幼细胞>淋 巴细胞>红细胞。
临床原/幼细胞群定量
➢ 按照新的WHO分型标准，对初发病者， 原/幼细胞占总细胞数20%以上即可判为 白血病。
AML 免疫分型
FAB/ CD34
M1 ＋
CD33
＋
HLA- CD13 DR
＋＋
CD14 CD15 CD11b 其它
－± －
M2 ± ＋ ＋ ＋ － ± －
M3 － ＋ － ＋ － ± － CD38
CD9
M4 － ＋ ＋ ± ＋ ＋ ±
M5 － ＋ ＋ ± ＋ ＋ ±
M6 ± ± ± ± － ± － CD71
髓系细胞和单核细胞
7
CD20 FITC/CD22 PE/ CD45 PerCP
B淋巴系细胞及其分化程度
8
CD8 FITC/CD4 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞及其分化程度
9
CD3 FITC/CD16+56 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞、NK细胞
10
CD36 FITC/GP-A PE/ CD45 PerCP
流式细胞术讲义
流式细胞术的概念
流式细胞术（Flow cytometry；FCM）是集计算 机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化 学、细胞免疫学等多门高新技术与方法为一体的现 代细胞分析技术，它以流式细胞仪（Flow cytometer）为工具，在单细胞水平上对大量细胞 进行高速（每秒计数可达1000~10000个细胞）、准 确、多参数的定量分析或分选（纯度可达99%以 上），已成为现代骨髓血细胞学研究中最先进的分 析技术。
需考虑到抗原/单抗的多向性： CD4、CD7、CD10、CD38、CD56
正常血细胞随分化成熟，各系列血细胞的免疫标志特性逐 步规律化：
白血病细胞的分化发育却丧失严格的规律性（lineage infidelity）与免疫表型的阶段性（differentiation asynchrony），因而出现异常抗原表达，或过高或过低或 不表达或交叉系列表达。
CD33+. CD13+. CD15+. HLA-DR+
结论：表型符合双 表型白血病
流式细胞术与 造血干/祖细胞计数
原理
造血干/祖细胞存在于骨髓和外周血中， 形态与淋巴细胞相似，用普通形态学方法 难于识别。但根据造血干/祖细胞的特征， 可用FCM多参数分析血液、骨髓和浓缩白 细胞悬液中造血干/祖细胞的数量，对血液 病、恶性肿瘤、基因异常等疾患的造血干/ 祖细胞移植治疗有十分重要的意义。
流式细胞术其它应用
血小板疾病的诊断 DNA倍体与细胞周期分析 应用流式细胞术检测微小残留病变 网织红细胞分析 细胞免疫功能分析
11
CD61 FITC/CD41 PE/ CD45 PerCP
幼红细胞 巨核细胞
CD10 CD19 CD22c/m CD3c/m CD5 CD7 CD13 CD33 MPO
B-ALL + + + － － － － － －
T-ALL － － － + + + － － －
AML － － － － － － + + +
白血病免疫分型病例分析
病例2 王丙午 男性 68岁 异常表型中:
CD33+. CD13+. CD15+.CD11b+. HLA-DR+. CD34+.CD19+
结论：表型符合 AML-M2
白血病免疫分型病例分析
病例3 冯亮 男性 33岁 异常表型中:
CD34+. CD10+. CD22+. CD19+.
DR
早B前体 + + － － － － － ＋
ALL
普通型 + + + － － － － +
前
+ +± + －＋ － －
B-ALL
B-ALL + + － + ＋ ± ＋ －Байду номын сангаас
FCM-IM诊断混合型白血病
流式细胞术测定发现的双系列或多系列表达的结果较多， 但双表型白血病不一定就是混合型，理由如下：
混合型白血病诊断：应根据形态、免疫、遗传、分子生物 学等综合判断，属双系列（双克隆）？双表型（单克隆）？ 系列转换型？
样本要求：
➢ 肝素抗凝骨髓3ml(或外周血) ➢ 每天上午送检 ➢ 收费：
➢ 70元/每个单抗(临床常规检测12个单抗)
❖ 干/祖细胞标志：
CD34、CA133
❖ 髓系标志：
CD33、CD13、CD11b、CD15、MPO
❖ B细胞相关标志：
CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD79a、 CyIg、SmIg
M7 ± ＋ ＋ － － ± － CD41
CD61
T-ALL免疫分型
CD2 CD3 CD5 CD7 CD4 CD8 TdT
早期
++±
+
－－
+
T-ALL
前
++
+
+
+
+
+
T－ALL
T-ALL
++
+
+
±±
+
B-ALL免疫分型
HLA- CD19 CD10 CD20 CD22 cIgM mIgM TdT
3
CD10 FITC/CD19 PE/ CD45 PerCP
B淋巴系细胞
4
Anti-HLA-DA FITC / CD13 PE/ CD45 PerCP 髓系细胞、 B淋巴系细胞、部分T淋
巴系细胞
5
CD34 FITC/CD38 PE/ CD45 PerCP
反映细胞分化程度
6
CD14 FITC/CD33 PE/ CD45 PerCP
❖ T细胞相关标志：
CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8
常用白血病免疫分型荧光素标记单克隆抗体组合及其意义
管号 1
三色标记McAb
MouseIgG1/ MouseIgG1/CD45 PerCP
染色细胞及目的
阴性对照及设门
2
CD5 FITC/CD7 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞、部分早期髓系细胞
➢ 对于临床原/幼细胞群定量应以原/幼细胞 群的细胞数为分母。
➢ 对于临床原/幼细胞群定性比定量更重要。
白血病免疫分型病例分析
病例1 梁丽琴 女性 24岁 异常表型中:
CD10+. CD34+. CD22+. CD38+. CD19+. HLA-DR+
结论：表型符合 Pre-B-ALL
设门方案
采用CD45/SSC设门法 （优于FSC/SSC设门法）
CD45其表达程度在不 同细胞各异。淋巴细胞 >单核细胞>成熟粒细胞 >原/幼细胞，而红细胞 不表达。
SSC在成熟粒细胞>单 核细胞>原/幼细胞>淋 巴细胞>红细胞。
临床原/幼细胞群定量
➢ 按照新的WHO分型标准，对初发病者， 原/幼细胞占总细胞数20%以上即可判为 白血病。
AML 免疫分型
FAB/ CD34
M1 ＋
CD33
＋
HLA- CD13 DR
＋＋
CD14 CD15 CD11b 其它
－± －
M2 ± ＋ ＋ ＋ － ± －
M3 － ＋ － ＋ － ± － CD38
CD9
M4 － ＋ ＋ ± ＋ ＋ ±
M5 － ＋ ＋ ± ＋ ＋ ±
M6 ± ± ± ± － ± － CD71
髓系细胞和单核细胞
7
CD20 FITC/CD22 PE/ CD45 PerCP
B淋巴系细胞及其分化程度
8
CD8 FITC/CD4 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞及其分化程度
9
CD3 FITC/CD16+56 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞、NK细胞
10
CD36 FITC/GP-A PE/ CD45 PerCP
流式细胞术讲义
流式细胞术的概念
流式细胞术（Flow cytometry；FCM）是集计算 机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化 学、细胞免疫学等多门高新技术与方法为一体的现 代细胞分析技术，它以流式细胞仪（Flow cytometer）为工具，在单细胞水平上对大量细胞 进行高速（每秒计数可达1000~10000个细胞）、准 确、多参数的定量分析或分选（纯度可达99%以 上），已成为现代骨髓血细胞学研究中最先进的分 析技术。
需考虑到抗原/单抗的多向性： CD4、CD7、CD10、CD38、CD56
正常血细胞随分化成熟，各系列血细胞的免疫标志特性逐 步规律化：
白血病细胞的分化发育却丧失严格的规律性（lineage infidelity）与免疫表型的阶段性（differentiation asynchrony），因而出现异常抗原表达，或过高或过低或 不表达或交叉系列表达。
CD33+. CD13+. CD15+. HLA-DR+
结论：表型符合双 表型白血病
流式细胞术与 造血干/祖细胞计数
原理
造血干/祖细胞存在于骨髓和外周血中， 形态与淋巴细胞相似，用普通形态学方法 难于识别。但根据造血干/祖细胞的特征， 可用FCM多参数分析血液、骨髓和浓缩白 细胞悬液中造血干/祖细胞的数量，对血液 病、恶性肿瘤、基因异常等疾患的造血干/ 祖细胞移植治疗有十分重要的意义。
流式细胞术其它应用
血小板疾病的诊断 DNA倍体与细胞周期分析 应用流式细胞术检测微小残留病变 网织红细胞分析 细胞免疫功能分析
11
CD61 FITC/CD41 PE/ CD45 PerCP
幼红细胞 巨核细胞
CD10 CD19 CD22c/m CD3c/m CD5 CD7 CD13 CD33 MPO
B-ALL + + + － － － － － －
T-ALL － － － + + + － － －
AML － － － － － － + + +
白血病免疫分型病例分析
病例2 王丙午 男性 68岁 异常表型中:
CD33+. CD13+. CD15+.CD11b+. HLA-DR+. CD34+.CD19+
结论：表型符合 AML-M2
白血病免疫分型病例分析
病例3 冯亮 男性 33岁 异常表型中:
CD34+. CD10+. CD22+. CD19+.
DR
早B前体 + + － － － － － ＋
ALL
普通型 + + + － － － － +
前
+ +± + －＋ － －
B-ALL
B-ALL + + － + ＋ ± ＋ －Байду номын сангаас
FCM-IM诊断混合型白血病
流式细胞术测定发现的双系列或多系列表达的结果较多， 但双表型白血病不一定就是混合型，理由如下：
混合型白血病诊断：应根据形态、免疫、遗传、分子生物 学等综合判断，属双系列（双克隆）？双表型（单克隆）？ 系列转换型？
样本要求：
➢ 肝素抗凝骨髓3ml(或外周血) ➢ 每天上午送检 ➢ 收费：
➢ 70元/每个单抗(临床常规检测12个单抗)
❖ 干/祖细胞标志：
CD34、CA133
❖ 髓系标志：
CD33、CD13、CD11b、CD15、MPO
❖ B细胞相关标志：
CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD79a、 CyIg、SmIg