乳酸脱氢酶LDH法操作说明
乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒说明书
乳酸脱氢酶（LDH ）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：BC0680规格：50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体30 mL×1瓶4℃保存试剂一液体25 mL×1瓶4℃保存试剂二粉剂×1支-20℃保存试剂三液体25 mL×1瓶4℃保存试剂四液体60 mL×1瓶4℃保存标准品液体1 mL×1支4℃保存溶液的配制：1、试剂二：临用时加入1.3 mL 双蒸水充分溶解备用，配好后可分装成小管-20℃保存，可保存两周，禁止反复冻融；2、标准品：2 μmol/mL 丙酮酸钠溶液。
产品说明：LDH （EC 1.1.1.27）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是糖酵解途径的末端酶，催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应，伴随着NAD +/NADH 之间互变。
LDH 催化NAD +氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸进一步与2,4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL ）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W ，超声3s ，间隔10s ，重复30次）；8000g 4℃离心10min ，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g ）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。
人乳酸脱氢酶(LDH)ELISA试剂盒应用方法人乳酸脱氢酶(LDH)ELISAKit
人乳酸脱氢酶（LDH）ELISA试剂盒应用方法人乳酸脱氢酶（LDH）ELISAKit人乳酸脱氢酶（LDH）ELISA试剂盒：（用于血清、血浆、细胞培养上清液和其它生物体液内）原理本试验采用双抗体夹心ABCELISA法。
用抗人LDH单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的LDH与单抗结合，加入生物素化的抗人LDH，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最终加停止液硫酸，在450nm处测OD值，LDH浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中LDH浓度。
试剂盒构成（28℃保管）酶标板（CoatedWells） 96孔酶标抗体工作液（EnzymeConjugate） 12ml 10×标本稀释液（SampleBuffer）12ml 20×浓缩洗涤液（WashBuffer）50ml标准品（Standards）：80U/瓶 2瓶底物工作液（TMBSolution） 12ml第一抗体工作液（BiotinylatedAntibody） 12ml 停止液（StopSolution）12ml准备试剂与收集血样1.收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，28℃保管48小时；更长时间须冷冻（20℃或70℃）保管，躲避反复冻融。
2.标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成80000U/L的溶液。
设标准管8管，第一管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。
在第一管中加入80000U/L的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。
如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。
第八管为空白对照。
3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液 9ml蒸馏水）。
4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）检测程序1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。
血清乳酸脱氢酶LDH测定
血清乳酸脱氢酶LDH测定1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。
2 实验原理LDH催化乳酸氧化为丙酮酸，同时将NAD+还原为NADH，LDHNADH的生成速率与标本中乳酸脱氢酶的活力成正比。
L-乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+3 标本：3.1 病人准备：无特殊。
3.2 类型：血清或EDTA血浆。
3.3 标本存放：3天内的活性损失：2～8℃保存：<8%；15～25℃保存：<2%。
3.4 标本运输：常温条件下保存运输。
3.5 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染的标本。
4 实验材料4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司LDH试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1 试剂组成氯化钾 190mmol/L 试剂1（R1）乳酸62.5mmol/LTris缓冲液 100mmol/L试剂2（R2）NAD+ 30mmol/L Tris缓冲液 100mmol/L 4.1.2试剂准备试剂为即用式。
4.1.3 试剂稳定性与贮存：2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂（盒）自生产之日起有效期为12个月。
试剂1 与试剂2 启用后，在2～10℃避光的条件下可稳定14天。
4.1.4 变质指示当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。
4.1.5 注意事项试剂中含叠氮钠为防腐剂。
不可入口！避免接触皮肤及粘膜。
应采取必要的预防措施使用试剂。
4.2 校准品：使用上海复星长征医学科学有限公司提供的LDH校准品对自动分析仪进行校准。
4.3 质控品：使用正常值、病理值复合控制品。
5 仪器AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪6 操作步骤6.1 样品的准备：将标好号的样品离心后放到仪器规定的位置。
6.2 试剂的检测：仪器开机后，检查各种试剂的位置，体积等确认无误后方可进行测定。
小鼠乳酸脱氢酶(LDH)ELISA试剂盒操作说明操作说明
小鼠乳酸脱氢酶(LDH）ELISA试剂盒操作说明操作说明小鼠乳酸脱氢酶(LDH）ELISA试剂盒操作说明小鼠乳酸脱氢酶(LDH）ELISA试剂盒实验原理小鼠乳酸脱氢酶(LDH）ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被小鼠乳酸脱氢酶(LDH）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻di洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的小鼠乳酸脱氢酶(LDH）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
样本处理及要求1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。
将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。
推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。
为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。
最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
第四章实验五乳酸脱氢酶_LDH_同工酶的分离纯化
NAD+：10 mL NBT：10 mL PMS：2 mL 0.5 M PH7.6 Tris-HCl: 15 mL 0.5 M乳酸钠：15 mL 0.1NaCl：5 mL 去离子水：43 mL
共计100 mL
四、实验操作
1.样品处理：1 g 组织切碎，加 pH 7.4 Tris-HCl缓 冲液10 mL，匀浆，10,000 g ，4℃，离心10 min，上
离子交换剂结构：以Sephadex-QAE A-50为例
葡聚糖 -N+(CH3)3 –Cl基质 功能基团 平衡离子
电荷基团 反离子
离子交换剂的种类
1 按基质种类不同： 离子交换树脂，离子交换纤维素，离子交换凝胶等
2 按功能基团不同： 强酸型 含磺酸基团 (R-SO3H)， 中等酸型 含磷酸基团 (-O-PO2H4) 弱酸型 含酚基、羧基 强碱型 含季胺基团 [-N+(CH3)3]，弱碱型 含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2] 3 按平衡离子的性质不同：
ABC
D
E
A280
5 10 15 20 25 30 35 40 50
洗脱体积
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定：活性电泳 只做分离胶，胶倒好直接插上试样梳，进行聚合
编号 1 2 3 4 5
总体积
溶液名称 30% Acr –0.8% Bis pH 8.9 Tris -HCl TEMED 10% AP H2O
三、实验试剂
1、20 mM Tris-HCl，pH 7.4缓冲液； 2、A液: 20 mM Tris-HCl，pH 6.3缓冲液 3、B液: A液含60 mM NaCl 4、C液: A液含100 mM NaCl 5、D液: A液含150 mM NaCl 6、E液: A液含240 mM NaCl 7、QAE-Sephadex A-50准备：取1克QAE-Sephadex A-50于烧杯中加入100 mL A
乳酸脱氢酶(LDH)法操作说明
乳酸脱氢酶(LDH)法操作说明乳酸脱氢酶（LDH）法操作说明操作简介：乳酸脱氢酶（LDH）法是一种常用的生物化学分析方法。
本文将详细介绍使用乳酸脱氢酶法进行实验操作的步骤。
材料准备：1. 乳酸脱氢酶试剂盒2. 样品溶液3. 乳酸标准品4. 实验用试管和显微管操作步骤：1. 样品制备- 将待测样品装入实验用试管中。
每个样品应分别装入不同的试管，以避免交叉污染。
- 若样品过浓稀，需要进行适当的稀释，确保样品浓度在测试范围内。
2. 标准曲线制备- 准备不同浓度的乳酸标准品溶液，浓度范围可根据实验要求而定。
- 将不同浓度的标准品溶液分别装入实验用试管中。
3. 试剂添加- 分别向样品管和标准品管中加入相同体积的乳酸脱氢酶试剂，充分混匀。
4. 反应温育- 将所有试管置于恒温水浴中，温度设定为适合乳酸脱氢酶反应的温度（一般为37°C）。
- 在设定的反应温度下，将试管保持在水浴中反应一段时间（时间根据实验要求而定）。
5. 反应终止- 在反应时间结束后，以适当的方法终止反应。
常见的终止方式是添加酸性试剂或采用其他合适的方法。
6. 测定乳酸脱氢酶活性- 使用光度计、分光光度计或其他合适的仪器，测定样品和标准品反应后产生的光吸收值。
吸收值与乳酸脱氢酶活性成正比。
- 通过标准曲线，将样品的吸收值转化为对应的乳酸脱氢酶活性。
注意事项：1. 本实验操作需要严格按照实验室安全操作规范进行，避免任何可能导致个人受伤或污染的行为。
2. 实验过程中的试剂、标样和废液等应按照实验室规定的方法处理，不得随意丢弃。
3. 在操作过程中，保持实验器材和试剂的洁净，尽量避免外界因素对实验结果的影响。
4. 操作时需注意避免交叉污染，尤其是样品的装管和试剂的配比过程。
5. 样品和标准品的选择要合适，浓度范围应覆盖实验要求。
6. 温育过程中，确保试管能均匀受热，并避免发生温度不稳定的情况。
总结：乳酸脱氢酶（LDH）法是一种可靠的生物化学分析方法，适用于乳酸脱氢酶活性的测定。
乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程(SOP)
乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程（SOP）一、用途本产品用于体外定量测定血清、血浆样品中乳酸脱氢酶（LDH）的活性。
二、临床意义（一）概述乳酸脱氢酶（LDH），又称L－乳酸－NAD+氧化还原酶，酶编号为EC 1.1.1.27，分子量约为34000道尔顿。
LDH是一种细胞质酶，存在于所有组织细胞中。
由于组织中的LDH 浓度比血浆高约500倍，即使组织的轻微损伤也将导致血清中活性的明显增高，在肝、心肌、骨骼肌和肾中发现高度组织特异性活性的酶。
（二）临床意义乳酸脱氢酶增高主要见于心肌梗死、肝炎、肺梗死、某些恶性肿瘤、白血病等。
某些肿瘤转移所致的胸腹水中乳酸脱氢酶活力往往升高。
目前，常用于心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。
（三）医学决定水平170U／L:此值在参考范围以内，等于或低于此值可排除许多与LDH升高有关的疾病，而考虑其他的诊断。
此值还可作为病人自身的对照，用来与以前或将来的测定值作比较。
300U／L：高于此水平时，应考虑到可能引起LDH升高的各种疾病，如心肌梗塞、肝病变、传染性单核细胞增多症、进行性肌营养不良等。
因此，应作其他各种试验，以作出明确诊断。
血清溶血可使测定值增高，应予以注意。
500U／L：高于此值，常见于巨幼细胞性溶血，急性白血病、慢性粒细胞性白血病、转移癌和肝昏迷等，此时应作其他多种检测来作出正确诊断。
三、检验原理L-乳酸＋NAD+−−LDH丙酮酸＋NADH＋H+−→NADH的生成速率与样品中LDH活性成正比，在340nm波长处，通过连续监测吸光度的上升速率(△A／min)，即可计算出样品中LDH的活性。
四、样品血液样品原则上采集晨起空腹血（禁食12小时）；患者处于平静、休息状态，减少患者由于运动、饮食带来的影响；静脉采血时患者应取坐位或卧位；止血带使用后1分钟内采血，回血后立即松开；正确使用抗凝剂；防止溶血；防止过失性采样。
样品运送过程中应防止过度振荡、防止样品容器的破损、防止样品被污染、防止样品及唯一性标志的丢失和混淆，防止样品对环境的污染、水分蒸发。
乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒说明书
乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒说明书（乳酸→丙酮酸连续监测法）【产品名称】中文名称：乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒（乳酸→丙酮酸连续监测法）英文名称：LACTATE DEHYDROGENASE REAGENT KIT（L→P method）【包装规格】50ml/盒（R-1：40ml×1，R-2：10ml×1），240ml/盒（R-1：64ml×3，R-2：48ml×1），250ml/盒（R-1：40ml×5，R-2：10ml×5），375ml/盒（R-1：100ml×3，R-2：75ml×1），2500ml/盒（R-1：500ml×4，R-2：500ml×1）。
【预期用途】本试剂盒用以测定人血清乳酸脱氢酶(LDH)的活力。
【检验原理】乳酸脱氢酶在催化乳酸生成丙酮酸的同时将NAD+还原成NADH。
通过测定NADH在340nm处吸光度增加的速度可求得乳酸脱氢酶的活力。
LDHL-乳酸+ NAD+─────→丙酮酸+ NADH + H+【主要组成成份】试剂成份含量R-1 L-乳酸锂76mmol/LR-2 NAD ≥31mmol/l *不同批号试剂盒中的各组份，经检验符合产品性能指标的，可以互换。
【储存条件及有效期】本试剂盒在2-8℃下避光保存可稳定一年；试剂R-1、R-2开启后在2-8℃避光保存可稳定一个月。
【适用仪器】本试剂适用于日立7020型、日立7060型、日立7080型、日立7150型、日立7170型、日立7180型、日立7600（D）型、日立7600（P）型自动分析仪以及奥林巴斯AU600、AU2700、东芝-雅培、BECKMAN CX系列、BECKMAN LX-20型等自动分析仪。
本试剂在日立7020自动分析仪上已通过第三方验证，并备有以上各种自动分析仪的参数可供参考。
【样本要求】空腹血清，保存于室温可稳定3小时，保存于0℃以下可稳定1周。
组织ldh检测方法
组织ldh检测方法
乳酸脱氢酶同工酶（LDH）检测方法包括电泳法、离子交换柱层析法、免疫法、抑制法和酶切法等，但迄今最好的和用得最多的是电泳法。
具体操作如下：
1. 将适量细胞接种到96孔细胞培养板中，使待检测时细胞密度不超过80-90%满。
2. 吸去培养液，用PBS液洗涤一次。
换新鲜培养液（推荐使用含1%血清的低血清培养液或适当的无血清培养液），将各培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔（背景空白对照孔），未经药物处理的对照细胞孔（样品对照孔），未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔（样品最大酶活性对照孔），以及药物处理的细胞孔（药物处理样品孔），并做好标记。
按照实验需要给予适当药物处理（如加入0-10μl左右特定的药物刺激，可设置不同浓度，
不同处理时间，对照孔中需加入适当的药物溶剂对照），继续按常规培养。
到预定的检测时间点前1小时，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培
养液体积的10%。
加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。
3. 到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。
分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。
4. 各孔分别加入60μl LDH检测工作液。
混匀，室温（约25℃）避光孵育30min（可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动）。
然后在490nm处测定吸光度。
使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。
以上信息仅供参考，具体操作建议咨询专业人士。
乳酸脱氢酶LDH乳酸法作业指导书
乳酸脱氢酶LDH乳酸法作业指导书
1、前言
试验名称：乳酸脱氢酶测定，英文名称：LDH，
本文件适用于安阳鼎城糖尿病医院检验科生化实验室，目的是指导工作人员正确的在全自动生化分析仪上测定血清、血浆样本中的乳酸脱氢酶活力，以保证测定结果的准确可靠。
本试验用体外定量测定人血清或血浆样本中乳酸脱氢酶的活力。
LDH广泛存在于人各组织，以肝、心肌、肾、骨骼肌、胰腺和肺最多，组织中酶活力约比血清中高1000倍，所以少量组织损伤即可引起血清LDH升高。
但其特异差，在心肌梗塞的诊断中LDH出现较CK晚，阳性率也较低，但维持时间长。
因此仍将此酶与CK、CK－MB、AST、α-HBDH同时测定做为心肌梗塞的诊断和监控的指标。
2、测定原理
本试验测定原理以IFCC推荐的方法为基础，实验分两步进行测定原理如下：
L-乳酸+ NAD+LDH丙酮酸+ NADH
在上述反应中NADH生成的速率与LDH的活性相关，监测340nm波长处吸光度的变化，即可计算出样本中LDH的活性。
LDH文档,乳酸脱氢酶测定试剂盒(LDH)检测标准操作规程
1、方法依据：深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒（IFCC法）测定方法2、适用范围：适用于人血清或血浆乳酸脱氢酶(LDH)的测定。
3、试剂仪器：3.1 试剂：深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司原装试剂盒。
3.2未开启的试剂盒避光保存于2℃～8℃有效期为一年。
试剂开瓶后应避光保存，在2℃～8℃可稳定30天。
试剂不可冰冻。
3.3 仪器：迈瑞BS-2000M全自动生化分析仪.4、操作程序4.1方法原理LDH 催化乳酸氧化为丙酮酸，同时将NAD+还原为NADH，NADH 的生成速率与标本中乳酸脱氢酶的活性成正比。
LDH乳酸+ NAD+ + H2O 丙酮酸+ NADH + H+4.2样本要求新鲜血清、肝素抗凝或EDTA抗凝血浆样本，采集后及时测定，应避免溶血和污染。
4.3上机操作4.3.1试剂装载、校准、样品和质控血清分析操作详见“《迈瑞BS-2000M全自动生化分析仪标准操作、维护、保养规程》”。
4.3.2 校准：4.3.2.1 标准液的准备：校准品使用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司配套冻干品，按说明书要求稀释后分装，-20℃冷冻保存，用前提前15分钟从冰箱中取出，复溶到室温后上机检测。
4.3.2.2 校准程序：首次使用校准。
当有以下情况时需重新校准：1）换试剂批号或出现质控漂移时；2）当仪器做完保养后；3）仪器进行零件更换时。
每次试验前用准备好的校准品进行校准，校准通过后进行检测。
4.3.2.3 质控：在标本开始之前做质控，质控通过后方能进行标本的检测。
4.3.3 测试基本参数4.4参考范围115～220 U/L （注：各实验室应有自己的参考范围。
）4.5 方法评价线性范围：4～1000U/L内。
当样本测定值超过上限时，应将样本用生理盐水稀释，重新测定，结果乘以稀释倍数。
精密度：批内变异系数：≤ 3.0%；批间变异系数：≤5.0%。
分析灵敏度：本试剂盒的检测低限不高于4 U/L。
血清乳酸脱氢酶LDH速率法测定-检验科生化室作业书
血清乳酸脱氢酶LDH速率法测定1.实验原理VITROSLDH试剂是一种干燥，多涂层的，在聚合物支撑基片上涂有分析成份的化学干片。
本法测LDH采用丙酮酸和NADH作底物以产生乳酸和NAD+。
将一滴10ul的患者样品滴于干片上，样品就被分布层均匀地分布并渗透到下面的试剂层。
乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+。
用反射强度变化测出NADH的氧化率，再将其转化成乳酸脱氢酶的活力。
测定方式：速率法波长：340nm测试时间和温度：37℃约5分钟反应过程：LDH丙酮酸+NADH+H+———————→乳酸+NAD2.标本：2.1病人准备：无特殊。
2.2样品类型：血清；肝素锂/钠抗凝血浆。
2.3标本采集与处理：Vitros测试血清和血浆的结果是一致的。
而其它一些方法由于在低速离心时血浆中血小板造成的污染，会使血清和血浆的测试结果有明显差异。
由于VitrosLDH干片对完整血小板内的LDH不敏感，因此对比方法的LDH结果会与Vitros肝素抗凝血浆的测试结果不一致。
样品采集后1小时内离心，然后吸出血清。
处理样品时要将其当成生物污染品。
3.标本的存放：血清、血浆室温下最多2天；不可冷冻保存。
4.标本的运输：样品要放在带盖的容器内以防污染和蒸发。
5.标本拒收的标准：污染、溶血标本不能使用。
6.试验材料：6.1测试AST所需的物品包括：Vitros化学定标物Kit3；Vitros特制质控液；Vitros7%BSA稀释液。
强生厂家提供原装进口，试剂盒外包装上标明了测试项目名称，试剂标签代码，有效期限和储藏温度。
6.1.1试剂组成：干片成分：反应成份是NADH和丙酮酸钠。
其它成份有聚合物颗粒，粘合剂，缓冲剂，表面活性剂，聚合物交叉连接剂和稳定剂。
干片标记：试剂盒外包装上标明了测试项目名称，试剂标签代码，有效期限和储藏温度。
6.1.2试剂准备从冰箱中取出干片盒，在将干片盒打开封装并装入仪器内的干片储藏器之前必须使其达到室温状态18～28℃。
血清乳酸脱氢酶LDH速率法测定
血清乳酸脱氢酶（LDH）速率法测定1. 实验原理VITROS LDH试剂是一种干燥，多涂层的，在聚合物支撑基片上涂有分析成份的化学干片。
本法测LDH采用丙酮酸和NADH作底物以产生乳酸和NAD+。
将一滴10ul的患者样品滴于干片上，样品就被分布层均匀地分布并渗透到下面的试剂层。
乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+。
用反射强度变化测出NADH的氧化率，再将其转化成乳酸脱氢酶的活力。
测定方式：速率法波长：340nm测试时间和温度：37℃约5分钟反应过程：LDH丙酮酸+ NADH + H+———————→乳酸+ NAD2. 标本：2.1 病人准备：无特殊。
2.2 样品类型：血清；肝素锂/钠抗凝血浆。
2.3 标本采集与处理：Vitros测试血清和血浆的结果是一致的。
而其它一些方法由于在低速离心时血浆中血小板造成的污染，会使血清和血浆的测试结果有明显差异。
由于Vitros LDH干片对完整血小板内的LDH不敏感，因此对比方法的LDH结果会与Vitros肝素抗凝血浆的测试结果不一致。
样品采集后1小时内离心，然后吸出血清。
处理样品时要将其当成生物污染品。
3. 标本的存放：血清、血浆室温下最多2天；不可冷冻保存。
4. 标本的运输：样品要放在带盖的容器内以防污染和蒸发。
5. 标本拒收的标准：污染、溶血标本不能使用。
6. 试验材料：6.1 测试AST所需的物品包括：Vitros化学定标物Kit3；Vitros特制质控液；Vitros 7%BSA稀释液。
强生厂家提供原装进口，试剂盒外包装上标明了测试项目名称，试剂标签代码，有效期限和储藏温度。
6.1.1 试剂组成：干片成分：反应成份是NADH和丙酮酸钠。
其它成份有聚合物颗粒，粘合剂，缓冲剂，表面活性剂，聚合物交叉连接剂和稳定剂。
干片标记：试剂盒外包装上标明了测试项目名称，试剂标签代码，有效期限和储藏温度。
6.1.2 试剂准备从冰箱中取出干片盒，在将干片盒打开封装并装入仪器内的干片储藏器之前必须使其达到室温状态18～28℃。
乳酸脱氢酶测定方法操作规程
乳酸脱氢酶（LDH）测定方法操作规程【产品名称】通用名称：乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒（IFCC 法）使用说明书【预期用途】该试剂盒采用IFCC法，用于体外定量测定人血清或血浆中乳酸脱氢酶的活力。
【检验原理】LDH催化乳酸氧化为丙酮酸，同时将NAD+还原为NADH。
NADH的生成速率与标本中乳酸脱氢酶的活性成正比。
乳酸+ 2O LDH丙酮酸+NADH+H+【主要组成成份】R1：Good’s缓冲液50 mmol/LL-乳酸 5.0 mmol/LR2：NAD+7.0 mmol/L*不同批号试剂盒各组分请勿混用。
【储存条件与有效期】未开启的试剂盒在2~8℃保存有效期为18个月。
试剂开瓶后应避光保存，在2℃~8℃可稳定30天。
试剂不可冰冻。
【适用仪器】迈瑞BS系列全自动生化分析仪、日立7180型全自动生化分析仪、日立7060型全自动生化分析仪、日立7600P自动生化分析仪、奥林巴斯AU400型全自动生化分析仪、奥林巴斯AU2700型全自动生化分析仪、贝克曼库尔特AU680型全自动生化分析仪。
若需自动生化分析仪应用参数，请随时和公司联系。
建议用户在不同仪器上使用本产品时，根据实验室情况进行验证。
【样本要求】新鲜血清或血浆，采集后及时测定，应避免溶血和污染。
【检验方法】试剂准备R1：即用液体试剂R2：即用液体试剂测定条件波长340nm温度37℃分析类型动力学法反应方向上升反应操作步骤* ΔA/min=ΔA/min样本管—ΔA/min空白管* 试剂和样本量可根据不同生化分析仪要求按比例适当增减。
校准校准品类型S1：生理盐水S2：迈瑞配套校准品推荐进行2点线性校准校准周期和要求（包括但不限于以下情况）更换试剂批号时仪器关键零部件更换时室内质控失效时质控每批样品检测时，建议使用迈瑞公司提供的配套质控品进行内部质量控制。
质控品测定值应该在规定的范围内。
若超出规定范围，有必要采取相应的措施或联系生产厂家。
【参考范围】男性：135~225U/L 女性：135~214U/L（注：各实验室应有自己的参考范围。
乳酸脱氢酶释放法
乳酸脱氢酶释放法
乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）是一种常见
的酶，它可以将乳酸转化为乙酰胆碱和氢氧化物。
LDH是一
种重要的酶，它可以用来诊断疾病，检测肝脏疾病，心脏疾病，肺部疾病，血液疾病等。
乳酸脱氢酶释放法（LDH Release Assay）是一种通过检测释放的乳酸脱氢酶来诊断疾病的方法。
乳酸脱氢酶释放法的原理是，当细胞受到损伤或病毒感染时，它们会释放大量的乳酸脱氢酶到血液中。
因此，测定血液中乳酸脱氢酶的含量可以检测细胞损伤或病毒感染的程度。
使用乳酸脱氢酶释放法诊断疾病时，首先要收集患者的血液样本，然后将样本放置在恒温条件下，用乳酸脱氢酶试剂盒测定血液中乳酸脱氢酶的含量。
测定结果显示，如果乳酸脱氢酶含量较高，则可能表明患者患有某种疾病。
乳酸脱氢酶释放法是一种简单、快速、有效的诊断方法，可以有效检测肝脏疾病、心脏疾病、肺部疾病、血液疾病等疾病。
它可以更快更准确地诊断疾病，从而更好地控制病情，改善患者的生活质量。
乳酸脱氢酶释放法是一种有效的诊断方法，但也有一些缺点。
首先，乳酸脱氢酶释放法需要较多的实验操作，容易出错。
其次，乳酸脱氢酶释放法检测准确性受到实验室条件和技术水平的影响，容易出现误差。
总之，乳酸脱氢酶释放法是一种有效的诊断疾病的方法，它可以更快更准确地诊断疾病，改善患者的生活质量。
但是，也有一些缺点，所以在使用这种方法时，需要注意操作步骤，提高实验室条件和技术水平，以保证检测结果的准确性。
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验方法
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测之阳早格格创做LDH释搁检测要领：a. 根据细胞的大小战死少速度将适量细胞交种到96孔细胞培植板中，使待检测时细胞稀度没有超出80-90%谦.b. 吸来培植液，用PBS液洗涤一次.换新陈培植液(推荐使用含1%血浑的矮血浑培植液或者适合的无血浑培植液)，将各培植孔分成如下几组：包罗无细胞的培植液孔(背景空黑对于照孔)，已经药物处理的对于照细胞孔(样品对于照孔)，已经药物处理的用于后绝裂解的细胞孔(样品最大酶活性对于照孔)，以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔)，并干佳标记表记标帜.依照真验需要赋予适合药物处理(如加进0-10μl安排特定的药物刺激，可树立分歧浓度，分歧处理时间，对于照孔中需加进适合的药物溶剂对于照)，继承按惯例培植.到预约的检测时间面前1小时，从细胞培植箱里与出细胞培植板，正在“样品最大酶活性对于照孔”中加进试剂盒提供的LDH释搁试剂，加进量为本有培植液体积的10%.加进LDH释搁试剂后，反复吹挨数次混匀，而后继承正在细胞培植箱中孵育.c. 到达预约时间后，将细胞培植板用多孔板离心机400g离心5min.分别与各孔的上浑液120μl，加进到一新的96孔板相映孔中，随即举止样品测定.准备处事：a. INT溶液(1X)的晃设：根据所需的INT溶液(1X)的量，与适量INT溶液(10X)用INT稀释液稀释至1X.比圆，与20μl INT溶液(10X)，加进180μl INT稀释液，混匀后即晃设为200μl INT溶液(1X).INT溶液(1X)宜现配现用，晃设后4℃保存可于当天使用，没有宜晃设后冻存.b. LDH检测处事液的配造: 根据待测定的样品数(含对于照)，参照下表正在临检测前新陈配造适量的检测处事液.注意：LDH检测处事液必须现配现用，配造战使用历程中均要注意适合躲光.样品测定:a. 各孔分别加进60μl LDH检测处事液.b. 混匀，室温(约25℃) 躲光孵育30min(可用铝箔包裹后置于火仄摇床或者侧晃摇床上缓缓摇动).而后正在490nm处测定吸光度.使用600nm或者大于600nm的任一波少动做参照波少举止单波少测定.c. 估计(测得的各组吸光度均应减来背景空黑对于照孔吸光度)细胞毒性或者牺牲率(%)=(处理样品吸光度－样品对于照孔吸光度) / (细胞最大酶活性的吸光度－样品对于照孔吸光度)×100d. 可画造细胞毒性直线：纵座标为本质吸光度，横坐标为药物浓度；据此可估计该药物效率特定时间的半致死剂量LD50.。
乳酸脱氢酶法操作说明
乳酸脱氢酶法操作说明装备与准备：1.安全镜、手套和实验室衣物。
2.LDH酶标仪和试剂盒。
3. 乳酸标准品（浓度待测，如1, 2, 4,和8mmol/L）。
4.甲酸钠和碳酸氢钠缓冲液（pH10）。
5.NADH。
6.甲酸钠酶混合物。
操作步骤：1.将LDH试剂盒中的所有试剂室温恢复到室温（20-25°C）。
2.使用甲酸钠和碳酸氢钠缓冲液，配制pH为10的缓冲液。
3.将试剂盒中的稀释液瓶放在LDH酶标仪中的样品槽中预热。
4. 在一个试管中加入10µl的标准品（1，2，4或8mmol/L），然后加入200µl的缓冲液和40µl的NADH。
5.加入10µl的甲酸钠酶混合物。
6.快速旋转混合试管中的液体。
7.立即将试管放在LDH酶标仪中的样品槽中，然后记录开始的时间。
8.观察反应液的吸光度变化。
该试剂盒中的酶会催化LDH的反应，并使NADH氧化为NAD。
NADH氧化产生的吸光度变化可以与待测标品中的乳酸浓度正相关。
9. 在约1至2分钟内，观察吸光度的稳定，并记录最大吸光度（Amax）的值。
10.用同样的步骤重复测量三个标准品。
11. 使用Amax值的三个测量结果，制作标准曲线。
将Amax值作为y 轴，标准品浓度（mmol/L）作为x轴绘制图表。
12.分析待测样本。
将待测样本用缓冲液稀释1:2或1:5的比例，在酶标板上重复三次。
13.将吸光度读数记录下来，并使用标准曲线，将吸光度转换为乳酸浓度。
14.使用样本的三个测量结果计算样本的均值。
注意事项：1.在操作之前，确保所有试剂和设备达到室温。
如果试剂需要特殊条件，按照说明书操作。
2.注意使用安全措施，如戴手套、安全镜和实验室衣物，以防止化学物质接触皮肤或眼睛。
3.按照说明书中的比例准确配制试剂和标准品。
4.必须在开始试验后立即将试管放入酶标仪中，以确保吸光度测量的准确性。
5.注意观察试剂盒中的反应液的颜色变化，并在愈合后的最大吸光度值时记录时间。
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验方法
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测之南宫帮珍创作LDH释放检测方法：a. 根据细胞的年夜小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养板中, 使待检测时细胞密度不超越80-90%满.b. 吸去培养液, 用PBS液洗涤一次.换新鲜培养液(推荐使用含1%血清的低血清培养液或适当的无血清培养液), 将各培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔(布景空白对比孔), 未经药物处置的对比细胞孔(样品对比孔), 未经药物处置的用于后续裂解的细胞孔(样品最年夜酶活性对比孔), 以及药物处置的细胞孔(药物处置样品孔), 并做好标识表记标帜.依照实验需要给予适当药物处置(如加入0-10μl左右特定的药物安慰, 可设置分歧浓度, 分歧处置时间, 对比孔中需加入适当的药物溶剂对比), 继续按惯例培养.到预定的检测时间点前1小时, 从细胞培养箱里取出细胞培养板, 在“样品最年夜酶活性对比孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂, 加入量为原有培养液体积的10%.加入LDH释放试剂后, 反复奏乐数次混匀, 然后继续在细胞培养箱中孵育.c. 达到预按时间后, 将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min.分别取各孔的上清液120μl, 加入到一新的96孔板相应孔中, 随即进行样品测定.准备工作：a. INT溶液(1X)的配置：根据所需的INT溶液(1X)的量, 取适量INT溶液(10X)用INT稀释液稀释至1X.例如, 取20μl INT溶液(10X), 加入180μl INT稀释液, 混匀后即配置为200μl INT溶液(1X).INT溶液(1X)宜现配现用, 配置后4℃保管可于当天使用, 不宜配置后冻存.b. LDH检测工作液的配制: 根据待测定的样品数(含对比), 参考下表在临检测前新鲜配制适量的检测工作液.注意：LDH检测工作液必需现配现用, 配制和使用过程中均要注意适当避光.样品测定:a. 各孔分别加入60μl LDH检测工作液.b. 混匀, 室温(约25℃) 避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动).然后在490nm处测定吸光度.使用600nm或年夜于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定.c. 计算(测得的各组吸光度均应减去布景空白对比孔吸光度)细胞毒性或死亡率(%)=(处置样品吸光度－样品对比孔吸光度) / (细胞最年夜酶活性的吸光度－样品对比孔吸光度)×100d. 可绘制细胞毒性曲线：纵座标为实际吸光度, 横坐标为药物浓度；据此可计算该药物作用特按时间的半致死剂量LD50.。
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LDH法细胞毒性检测：
原理：乳酸脱氢酶在胞浆内含量丰富,正常时不能通过细胞膜,当细胞受损或死亡时可释放到细胞外,所以细胞死亡数目与细胞培养上清中LDH活性成正比,用比色法测定实验孔LDH 活性,并与靶细胞对照孔进行比较,可计算效应细胞对靶细胞的杀伤百分率
LDH（乳酸脱氢酶）是一种极为稳定的细胞质酶，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH 即被释放到细胞外；LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应转化成红色甲臢化合物，可通过酶标仪进行检测。
颜色形成的量与裂解细胞的数目成正比。
应用一个96-孔平板读数计收集可见光波长的吸收值数据。
这个分析可用于测量在细胞介导的细胞毒性分析中细胞膜的完整性，这种情况下目标细胞被效应细胞裂解，可判断细胞受损的程度。
乳酸脱氢酶（LDH）在胞质内含量非常丰富，细胞处于正常状态下其不能通过细胞膜，但当细胞受到损伤或死亡时便可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH 的活性与细胞的死亡数目呈正比，通过用比色法测定并与靶细胞对照孔的LDH 活性进行比较，可计算出效应细胞对靶细胞的杀伤百分数。
该实验方法操作简便、快速，可应用于CTL 和NK 细胞活性测定及药物、化学物质或放射所引起的细胞毒性，目前已有LDH 法测定CTL 活性的试剂盒。
同时设4个对照:靶细胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组
按5∶1、10∶1、20∶1（效应细胞∶靶细胞）
细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大等因素会造成细胞自然释放乳酸脱氢酶
操作流程：
设立效应细胞孔（不同浓度的效应细胞设立效应细胞自发释放组）：50μl效应细胞+50μl培养基
实验组：靶细胞不变，改变效应细胞：50μl效应细胞+50μl靶细胞
设立靶细胞自发释放组：50μl靶细胞+50μl培养基
设立靶细胞最大释放组：50μl靶细胞+50μl培养基+10μl裂解液（10×）
设立体积校正对照组：100μl培养基+10μl裂解液（10×）
设立背景对照组：100μl培养基
250g离心4分钟
37℃孵育4小时
离心前45分钟添加裂解液（10×）至靶细胞最大释放组
250g离心4分钟
取上清50μl转移至另一孔板
（可选）于独立的孔中加50μl LDH阳性对照（1：5000）
于每孔中添加50μl再次稀释的底物混合物
室温避光孵育30分钟
添加50μl终止溶液
490nm测吸收值
1.靶细胞接种数目的优化
1.1.设立检测板
1.1.1.准备靶细胞：调整细胞浓度0, 5,000, 10,000, 20,000/100μl，使用与细胞毒分析相同的培养
基及孔板终体积。
例如，若以50μl/孔的靶细胞及50μl/孔的效应细胞接种，则以100μl/孔梯
度稀释。
1.1.
2.设置不含细胞的背景对照组
1.1.3.可选:验证LDH阳性对照。
使用涡旋混匀器轻轻混匀LDH阳性对照液，以1：5000稀释（稀
释方法：取2μl原液至10ml的PBS+1%BSA）。
使用与实验孔相同的体积。
1.2.细胞裂解及收获上清
1.2.1.裂解细胞每100μl培养基加10μl裂解溶液（10×）
1.2.2.37℃，5%CO2孵育45分钟
1.2.3. 250g离心4分钟
1.3. LDH检测
1.3.1. 转移50μl上清至另一孔板
1.3.
2. 解冻检测缓冲液，取12ml（避光），将剩余的迅速冻存（可以使用37℃水浴解冻，但不可放置过长时间）。
将12ml检测缓冲液添加到一瓶底物混合液（可用于两个96孔板）中，倒置混匀。
稀释后，避光、迅速添加。
1.3.3. 50μl/孔添加稀释的底物混合液，室温避光孵育30分钟（未使用的稀释后底物混合物液放于-20℃保存6-8周）
1.3.4. 添加50μl终止溶液
1.3.5. 将孔中含有的气泡去除，一小时内检测吸收值（490或492nm）
1.3.6. 至少检测两次吸收值
接种靶细胞（100μl/孔）至96孔板
加入裂解液（或冻存-解冻）
250g离心4分钟
取上清50μl转移至另一孔板
用检测缓冲液稀释底物混合物
添加底物混合物50μl/孔
室温避光孵育30分钟
添加50μl终止溶液
490nm测吸收值
2.细胞毒分析检测
2.1. 设立检测板
2.1.1. 效应细胞自发释放组设立不同浓度的效应细胞自发释放组，终体积与实验孔一致
2.1.2. 实验组加入相同数目的靶细胞，按照不同效靶比加入效应细胞，补足培养基（最小体积：100μl/孔）。
2.1.
3. 靶细胞自发释放组加入最优化的靶细胞数，补足终体积
2.1.4. 靶细胞最大释放组加入最优化的靶细胞数，补足终体积。
2.1.5. 体积校正对照组100μl培养基中加入10μl的裂解液，用于校正由于加入裂解液而引起的体积变化（体积改变影响酚红及血清的含量）。
2.1.6. 背景对照组用于校正培养基中由酚红及血清引起的LDH影响。
2.1.7. LDH阳性对照（可选）使用涡旋混匀器轻轻混匀LDH阳性对照液，以1：5000稀释（稀释方法：取2μl原液至10ml的PBS+1%BSA）。
使用与实验孔相同的体积
2.1.8. 250g离心4分钟，以使效应细胞与靶细胞充分接触
2.2. 细胞培养、收获上清
2.2.1. 37℃，5%CO2孵育检测板（效靶细胞接触的最短时间为4小时）
2.2.2. 靶细胞最大释放组中加入裂解液每100μl培养基加10μl裂解溶液（10×）。
该体系中Triton X-100的浓度为0.8%，可使靶细胞完全裂解（收获上清前45分钟加入裂解溶液）。
显微镜下观察细胞状态，若靶细胞未完全裂解，再补5μl 的裂解液。
2.2.
3. 250g离心4分钟
2.3. LDH检测
2.3.1. 转移50μl上清至另一孔板
2.3.2. 解冻检测缓冲液，取12ml（避光），将剩余的迅速冻存（可以使用37℃水浴解冻，但不可放置过长时间）。
将12ml检测缓冲液添加到一瓶底物混合液（可用于两个96孔板）中，倒置混匀。
稀释后，避光、迅速添加。
2.3.3. 50μl/孔添加稀释的底物混合液，室温避光孵育30分钟（未使用的稀释后底物混合物液放于-20℃保存6-8周）
2.3.4. 添加50μl终止溶液
2.3.5. 将孔中含有的气泡去除，一小时内检测吸收值（490或492nm）
2.4. 结果统计
2.4.1. 所有的实验组、效应细胞自发释放组、靶细胞自发释放组的吸收值应减去背景平均吸收值2.4.2. 靶细胞最大释放组的吸收值应减去体积校正对照组的平均吸收值
2.4.
3. 校正后的值用于杀伤率的统计：
细胞杀伤率(%)= ［（实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放）/（靶细胞最大释放-靶细胞自发释放）］×100%。