2-4叶绿素a测定

实验题目: 湖塘水体叶绿素a测定

姓名：学号：

班级：组别：第一组

指导教师：

1.实验概述

1.1实验目的及要求

(1)初步了解叶绿素a测定的原理和常规测定方法;

(2)通过实验，掌握叶绿素。的测定方法及富营养化水样的前处理方法;

(3)熟练掌握抽滤装置及分光光度计的使用。

1.2实验原理

浮游植物的主要光合色素是叶绿素((Chlorophyll)，常见的有叶绿素a、b和c。叶绿素a (chl-a >存在于所有的浮游植物中，大约占有机物干重的1-2%，是估算浮游植物生物量的重要指标，因此浮游植物叶绿素a含量的测定成为浮游植物生物量的重要指标而被广泛应用。

浮游植物叶绿素a的测定方法有许多种，根据所使用的仪器可以分为高效液相色谱法

在所有分光光度计法中，根据所用的色素萃取液分为了丙酮法、甲醇法和乙醇等，再根据比色所用的，又分为单色法和多色法(例如单色丙酮法和四色丙酮法)等。主要的细胞破碎法有研磨、低温冻融、超声破碎等。尽管丙酮现在仍厂泛用于实际分析中，但由于丙酮的萃取效率比较差，特别是对蓝藻的叶绿素a的

萃取效率比较低，使得甲醇和乙醇成为替代丙酮的色素萃取剂。不过，甲醇对人体毒害性大，且在酸化过程中容易产生误差，于是，乙醇成为现在广泛应用的叶绿素a的萃取剂。超声破碎法因快速、提取效率高等特点也被研究者所青睐。

本实验介绍一种以热乙醇为萃取溶剂，结合超声细胞破碎法为基础的叶绿素a含量侧定方法。

2.实验内容

2.1实验方案设计

每组选择一个池塘，实地取水样，测定水样的叶绿素a含量。

2.2实验条件

2.2.1实验仪器:

1) 幼分光光度计1台;

2)抽滤装置(砂芯过滤器、负压表、真空泵等)1台;

3)4000r/min离心机1台;

4) 15mL带刻度及螺旋盖的离心分离试管6个;

5)恒温水浴锅1台;

6)直径47 mm的醋酸纤维滤膜;

8)超声细胞破碎仪

9 ) icm玻璃比色皿2个

10)表面皿若干

11)10mL比色管7个;

2.2.2实验材料

1）90%乙醇

2）1mol/L盐酸

2.3实验过程（实验步骤、记录、数据、分析）

2.3.1实验步骤

(1) 水样预处理：实验水样由实验室培养的铜绿微囊藻稀释而得，分别取三组浓度水样各50ml，每组两个平行样。将水样通过醋酸纤维滤膜抽滤，抽滤时负压不应大于0.5大气压（50kPa）。抽滤完毕后，用镊子小心的取下滤膜，将其对着(有浮游植物样品的一面向里）再用普通滤纸吸压，尽量去除滤膜上的水分;滤膜放置表面皿上冷冻12h以上。

（2）Chl-a的提取:将滤膜剪碎，放入具塞离心管，加入6 mL热乙醇(75℃恒温提取2 min 后用细胞破碎仪破碎，超声时间3S，间隔2S，破碎5 min后，用少量上清液清洗细胞破破碎仪探头（小于1ml）。将装有提取液的离心管放入离心机，转速4000r/min下离心10min，将上清液移入10 mL比色管中，再用2 mL 热乙醇提取液清洗、离心二次取得上清液清洗、离心两次取得上清液。最后将提取液定容到10 ml。

（3）Chl-a含量的侧定:用含90%的乙醇溶液座位空白对分光光度计调零。分别记录在750 nm与665 nm处各自的吸光度(分别记为750a和665妒，750 nm 处的测定是用来进行浊度校正的，吸光度应很低。665 nm处的吸光)如拉在0.1-0.8单位之间。在比色皿内加入1滴1mol/l 盐酸使酸化，混匀1 min。再记录750nm 和665 nm处的吸光度(记为750b和665b)

2.3.2数据记录和处理

两种波长下叶绿素吸光度测定原始数据：

编号665a 665b 750a 750b

1 0.090 0.081 0.026 0.031

Ⅰ 2 0.090 0.081 0.026 0.031

3 0.090 0.081 0.026 0.031

平均值0.090 0.081 0.026 0.031

1 0.259 0.195 0.033 0.040

Ⅲ 2 0.259 0.194 0.033 0.041

3 0.259 0.195 0.033 0.041

平均值0.259 0.195 0.033 0.041

1 0.248 0.190 0.030 0.036

Ⅳ 2 0.248 0.190 0.030 0.036

3 0.248 0.190 0.030 0.036

平均值0.248 0.190 0.030 0.036 通过吸光度的差值来计算对浊度的校正：

665a-750a=校正后的665a的吸光度

665b-750b=校正后的665b的吸光度

数据处理：

一号样：校正后的665a的吸光度=665a-750a=0.090-0.026=0.064

校正后的665b的吸光度=665b-750b=0.081-0.031=0.050

三号样：校正后的665a的吸光度=665a-750a=0.259-0.033=0.226

校正后的665b的吸光度=665b-750b=0.195-0.041=0.154

四号样：校正后的665a的吸光度=665a-750a=0.248-0.030=0.218

校正后的665b的吸光度=665b-750b=0.190-0.036=0.154

用校正后的665a与665b的吸光度值进行如下计算：

叶绿素a=29.62×(665a-665b)×Ve÷(V E×l) mg/m³

式中：Ve———乙醇的准确体积ml;

V E———水样的体积L;

l———比色皿的长度cm.

一号样：叶绿素a=29.62×(665a-665b)×Ve÷(V E×l) mg/m³

=29.62×（0.064-0.050）×10÷(2×1) mg/m³

=2.073mg/m³

三号样：叶绿素a=29.62×(665a-665b)×Ve÷(V E×l) mg/m³

=29.62×（0.226-0.154）×10÷(0.05×1) mg/m³

=426.5mg/m³

四号样：叶绿素a=29.62×(665a-665b)×Ve÷(V E×l) mg/m³

=29.62×（0.218-0.154）×10÷（0.05×1）mg/m³

=379.1mg/m³

2.4结论

从计算结果对比来看，采样点水样的叶绿素含量较低，取样点水面虽有部分绿色藻类，但是可能由于雨水或取水样时人为等因素的影响使其冲散，也可能是水体中适合生长的优势藻类本身含有较少的叶绿素a。还有，2、3组为平行实验，但结果却有出入，其原因可能是由操作过程引起的，如萃取过程、定容过程、超声破碎完冲洗过程、转移过程和测量吸光度的过程等均有可能带来误差。

2.5思考题。