荧光定量常见问题分析
荧光定量PCR常见问题解析
荧光定量PCR常见问题解析（一）1、普通PCR与荧光定量PCR技术区别？①荧光定量PCR能够实时监测PCR反应的全过程，对每一个循环进行定量或定性分析；而普通PCR只能对反应的终产物进行半定量或定性分析。
②荧光定量PCR的结果分析可以直接通过电脑读出，而普通PCR的结果必须通过下一步的电泳进行条带分析。
2、荧光定量PCR技术的特点①灵敏度高、特异性强。
② PCR实验过程全封闭，仪器自动分析和获取实验结果，无后续实验操作。
③实时监测反应过程，定量更准确。
④定量范围宽，可达到10个数量级。
⑤可以实现一次反应检测多个样本。
3、实时荧光定量PCR实验操作注意事项①应该带一次性乳胶手套并经常更换，在试剂准备室和样本处理室应该配备负压式生物安全柜，以防止对环境或对样品的污染。
②要严格防止气溶胶交叉污染。
采取的措施有：使用一次性带滤芯移液枪吸头；不使用吸头吹打液体进行混匀；在生物安全柜中进行离心操作；尽量减少在生物安全柜以外开启试剂或PCR管；禁止在荧光定量PCR结束后打开PCR管盖。
③实验中牵涉的有毒有害及有污染的样本及试剂应该严格按照生物安全相关规定操作和处理。
④荧光探针应该避光保存，加入反应液后应尽快上机，以防探针粹灭。
⑤在进行RNA相关操作时，必须使用无RNase的实验器具及耗材，并加样后立即上机操作，以防RNA的降解。
⑥所有试剂在开启之前都要瞬时离心；试剂配制完成后要瞬时离心以去除气泡。
⑦不要在荧光定量PCR管上做任何标记，不能用手接触PCR管盖上采光部位。
4、实时荧光定量PCR实验无CT值出现或无扩增信号的问题及解决方案①实验的循环数不够，设计的循环数应该在35以上，可增加至45个循环，但不可高于45个循环。
②通道选择不对，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求选择采光通道。
③荧光采集位置设计有误，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求设置荧光信号采集位置。
④引物或探针降解，要求厂家重新发货验证。
荧光定量PCR常见问题解析
荧光定量PCR常见问题解析（一）1、普通PCR与荧光定量PCR技术区别？①荧光定量PCR能够实时监测PCR反应的全过程，对每一个循环进行定量或定性分析；而普通PCR只能对反应的终产物进行半定量或定性分析。
②荧光定量PCR的结果分析可以直接通过电脑读出，而普通PCR的结果必须通过下一步的电泳进行条带分析。
2、荧光定量PCR技术的特点①灵敏度高、特异性强。
② PCR实验过程全封闭，仪器自动分析和获取实验结果，无后续实验操作。
③实时监测反应过程，定量更准确。
④定量范围宽，可达到10个数量级。
⑤可以实现一次反应检测多个样本。
3、实时荧光定量PCR实验操作注意事项①应该带一次性乳胶手套并经常更换，在试剂准备室和样本处理室应该配备负压式生物安全柜，以防止对环境或对样品的污染。
②要严格防止气溶胶交叉污染。
采取的措施有：使用一次性带滤芯移液枪吸头；不使用吸头吹打液体进行混匀；在生物安全柜中进行离心操作；尽量减少在生物安全柜以外开启试剂或PCR管；禁止在荧光定量PCR结束后打开PCR管盖。
③实验中牵涉的有毒有害及有污染的样本及试剂应该严格按照生物安全相关规定操作和处理。
④荧光探针应该避光保存，加入反应液后应尽快上机，以防探针粹灭。
⑤在进行RNA相关操作时，必须使用无RNase的实验器具及耗材，并加样后立即上机操作，以防RNA的降解。
⑥所有试剂在开启之前都要瞬时离心；试剂配制完成后要瞬时离心以去除气泡。
⑦不要在荧光定量PCR管上做任何标记，不能用手接触PCR管盖上采光部位。
4、实时荧光定量PCR实验无CT值出现或无扩增信号的问题及解决方案①实验的循环数不够，设计的循环数应该在35以上，可增加至45个循环，但不可高于45个循环。
②通道选择不对，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求选择采光通道。
③荧光采集位置设计有误，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求设置荧光信号采集位置。
④引物或探针降解，要求厂家重新发货验证。
荧光定量pcr实验常见问题梳理
荧光定量pcr实验常见问题梳理一、无Ct值或Ct值延迟出现:扩增曲线信号不佳，曲线不平滑:标准曲线线性差。
1.扩增产物大小不合适：实时荧光定量PCR扩增片段的长度通常在80-150 bp之间，如果调整反应的时间有可能扩增500bp的片段。
2.PCR反应过程中退火及延伸的时间过短或过长：应根据扩增片段的大小予与调整。
3.MgCl,浓度不合适：按0. 5mm的间距调整MgCI2的浓度。
4.循环数设置不足：最少设置35个循环，可以增加到45个循环。
超过45个循环以上背景信号会增加，对实验结果的分析造成干扰。
5.在错误的PCR反应步骤采集信号：应检查程序设置确保信号的采集是在退火的步骤进行的。
6.加样的误差及错误：注意每次加样的一致性及移液器的校正。
7.DNA模板的起始浓度过低，不能被检测出来：如果模板的浓度未知，最初的实验可以采用较高浓度的模板并进行梯度稀释。
最高的模板浓度不超过500ng基因组DNA。
8.模板DNA的降解：使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板是否降解，检查DNA模板的储存条件是否合适，如果确认降解应重新制备新鲜的DNA模板。
9.梯度稀释标准样品的方法不规范:应注意梯度稀释样品的操作规范，准确。
10.引物或探针设计有误，存在二级结构：通过琼脂糖凝胶电泳检测荧光定量PCR反应结果，是否有PCR产物存在。
如果没有PCR扩增产品，应使用引物设计软件检查引物的各种指标是否合适: Tm. 与模板的批配度、二级结构、扩增片段的长度、非特异型扩增的情况。
具体的数据请翻阅前面的相关原理说明11.引物之间的Tm值相差过多：上下游引物的Tm值差不应超过4C。
12.引物或探针的使用浓度不合适：应将浓度控制在50- 900 nM之间，探针的浓度低于引物的浓度。
13.引物或探针降解：使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板是否降解，检查DNA模板的储存条件是否合适，如果确认降解应重新制备新鲜的DNA模板。
14.探针设计的位置在扩增片段的5’端：应将探针设计的位置靠近扩增片段的3”端15.探针被氧化：避免用酸性溶液溶解探针，否则会产生高背景荧光信号及低的扩增信号。
荧光定量PCR检测miRNA中遇到的常见问题
荧光定量PCR检测miRNA中遇到的常见问题
一、反转录引物(RT引物)设计
实时荧光定量PCR检测miRNA的难点在于如何识别只有22nt左右的miRNA并合成第一链，目前常用的方法主要有茎环法和加尾法。
茎环法：引物由可以自身呈茎环状的特异序列+6~8个miRNA3’端反向互补碱基组成。
该RT引物可以与成熟miRNA结合，形成反转录引物/成熟miRNA复合物，并在miRNA的5’末端延伸，这样就得到一个较长的反转录扩增子，为后续的荧光定量PCR提供了符合要求的模板。
原理示意图如下：
加尾法(Oligod(T)特异RT引物法)：RNA在反转录前需要进行末端Poly(A)加尾，所有miRNA可以公用一个Oligod(T)的引物(由特异序列+(T)20左右+兼并碱基V或VN组成)。
加尾法特异性稍低，但设计及操作简单。
原理示意图如下：
二、荧光定量PCR引物探针设计
反转录后得到的cDNA为复合片段(miRNA+引物)，上游引物为特异性引物，在miRNA上设计，若GC含量太低，可以在上游引物5’端加入GCGC等保护碱基，下游引物为通用引物，与RT引物的某一段相匹配。
荧光定量PCR检测方法主要有SYBR Green染料法和TaqMan探针法。
前者需调整引物浓度，提高引物扩增效率，尽量减少引物二聚体与非特异性扩增;探针法需设计荧光探针，探针设计位置可以有3种：完全与miRNA序列相同、在miRNA与RT引物的交叉位置、完全在RT引物上。
至于探针要设计在哪个位置，可根据自己的实验情况来定。
荧光定量PCR常见问题分析
荧光定量PCR常见问题分析荧光定量PCR常见问题分析Q1．CT值出现过晚1.扩增效率低，反应条件不够优化。
设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
3.PCR产物太长。
一般采用80-150bp的产物长度。
Q2．无CT值（信号）出现1.反应循环数不够。
一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。
2.检测荧光信号的步骤有误。
一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
3.引物或探针降解。
可通过PAGE电泳检测其完整性。
4.引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
5.模板量不足。
对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
6.模板降解。
避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
Q3．标准曲线的线性关系不佳1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
2.标准品出现降解。
应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3.引物或探针不佳。
重新设计更好的引物和探针4．模板中存在抑制物，或模板浓度过高Q4．阴性对照也出现明显的起飞1.应mix或水被污染。
2.引物二聚体的出现。
用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。
3.反应过程中探针的降解。
用PAGE电泳对探针进行检测。
4.如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。
Q5．在溶解曲线前是否插入一个同溶解程序初始温度相同的一个保温过程如果在熔解曲线前没有一个保温过程，则曲线会在前几个循环非常陡峭，使真正的熔解峰型几乎看不到。
Q6．熔解曲线不止一个主峰1．引物设计不够优化。
应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2.引物浓度不佳。
适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3.镁离子浓度过高。
适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析
使用高质量的试剂和仪器
高质量的试剂和仪器是实时荧光定量PCR实验的基础，包括 高质量的DNA聚合酶、高灵敏度的荧光探针、可靠的定量 PCR仪等。
选择经过认证的试剂和仪器，并按照说明书正确使用和维护 ，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
优化PCR反应条件
优化PCR反应条件可以显著提高实验 的重复性和准确性，包括调整模板浓 度、引物浓度、循环数等参数。
通过梯度PCR或条件优化实验，可以 找到最佳的反应条件，使扩增曲线更 符合标准曲线的要求。
严格控制实验操作规范
实验操作规范是保证实时荧光定量PCR数据质量的重要环节，包括实验前的准备 、样本处理、加样、扩增和检测等步骤。
基线漂移
01
总结词
基线漂移是指PCR扩增曲线在起始阶段出现非特异性扩增，导致背景信
号过高。
02
详细描述
基线漂移可能是由于模板污染、酶活性降低或反应条件不适等原因引起
的。高背景信号会掩盖特异性扩增信号，导致检测结果不准确。
03
解决方案
在实验过程中，要严格控制操作环境，避免交叉污染。同时，要定期检
查酶活性，确保其处于最佳状态。此外，可以通过软件对扩增曲线进行
03 实时荧光定量PCR常见问 题分析
扩增效率不一致
总结词
扩增效率不一致会导致数据无法准确反映样本中目标基因 的表达水平。
详细描述
扩增效率不一致通常是由于反应条件、引物设计或试剂质量等 问题导致的。这会导致不同样本间的相对表达量出现偏差，从 而影响实验结果的准确性。
解决方案
在实验过程中，要确保反应条件的一致性，包括温度、时间、 循环数等。同时，要选择质量可靠、设计合理的引物和试剂， 并进行预实验以确定最佳的反应条件。
荧光定量PCR问题疑难解答
荧光定量PCR问题疑难解答荧光定量PCR问题疑难解答（一）Q：1. 这两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。
但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。
2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。
A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。
1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。
做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。
可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。
2. PCR中混入影响反应的物质：模板提取方法需要改进3. 样品稀释不准确：这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。
Q：荧光定量PCR的灵敏度A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。
Q：标准曲线要重复两三次吗?A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。
Q：关于荧光定量标准曲线的制作A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了，这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你做出来，认可度也不会太高。
Q：溶解曲线高矮A：Tm值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同，同样的扩增产物也会出现Tm值有微小差异，一般差异在1度以内都可以接受。
融解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。
Q：定量PCR没有扩增A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，说明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。
荧光定量PCR问题疑难解答
荧光定量PCR问题疑难解答（一）两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。
但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。
2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。
A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。
1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。
做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。
可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。
2. PCR中混入影响反应的物质：模板提取方法需要改进3. 样品稀释不准确：这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。
Q：荧光定量PCR的灵敏度A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。
Q：标准曲线要重复两三次吗?A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。
Q：关于荧光定量标准曲线的制作A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了，这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你做出来，认可度也不会太高。
Q：溶解曲线高矮A：Tm值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同，同样的扩增产物也会出现Tm值有微小差异，一般差异在1度以内都可以接受。
融解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。
Q：定量PCR没有扩增A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，说明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。
荧光定量PCR常见问题
荧光定量PCR常见问题1.定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。
开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。
关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。
2.哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml 光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。
ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：3.为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。
当硬盘驱动器上文件以分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。
碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。
碎片整理的方法如下：∙在Windows桌面上，选择开始(start),我的电脑(My computer)。
∙在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。
∙在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragment now)。
∙单击碎片整理(Defragment)。
∙当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）。
∙在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）。
为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。
4.何时执行windows service pack更新？不要执行该操作。
除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR 仪的计算机的操作系统。
荧光定量PCR技术的使用中常见问题
荧光定量PCR技术的使用中常见问题引言：荧光定量PCR技术作为一种高效、灵敏和准确的基因定量方法，广泛应用于分子生物学、医学诊断、环境监测等领域。
然而，在使用荧光定量PCR技术的过程中，常常会遇到一些问题和挑战。
本文将就荧光定量PCR技术的使用中常见问题进行探讨和解答，旨在帮助读者更好地应对和解决实验中的困惑。
一、引物设计问题1. 引物设计原则荧光定量PCR实验的关键是引物的设计。
引物应具备特异性、高度选择性以及适当的配对特性，以确保PCR反应的准确性和灵敏度。
引物设计建议遵循以下原则：- 引物长度：一般选择长度在18-30个碱基对之间。
- 碱基组成：应尽量避免引物末端含有连续的鸟嘌呤（G）或鸟嘧啶（C）。
- 碱基序列：引物两端应该尽量避免含有重复的碱基序列，以防止不特异扩增。
- 温度计算：引物的Tm（解离温度）应该在50-60摄氏度之间，同时引物间的Tm差异应不大于5摄氏度。
2. 引物设计工具引物设计可以利用一些在线引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST 等。
这些工具能够根据用户提供的序列信息，自动生成符合上述引物设计原则的引物。
二、荧光探针选择和优化1. 探针选择荧光定量PCR常用的探针有TaqMan探针、Molecular beacon探针等。
选择合适的探针取决于实验需要和目标基因的特点。
TaqMan探针适用于高度特异性检测，而Molecular beacon探针则适用于检测低浓度的目标序列。
2. 探针的优化为了提高PCR反应的灵敏度和特异性，有时需要对探针进行优化。
以下是一些优化探针的建议：- 探针浓度优化：需根据实验条件和目标基因的特性进行探针浓度的优化。
- 探针长度：一般探针的长度限制在15-30个碱基对之间。
三、荧光定量PCR反应体系问题1. 反应体系的组成荧光定量PCR反应体系基本组成包括：模板DNA、引物、荧光探针、聚合酶、缓冲液和核苷酸等。
其中，重要的是要根据实验需要和试剂盒的要求确定各组分的浓度。
荧光定量PCR常见问题及解答
荧光定量PCR常见问题及解答更新時間：2010-12-10 10:43:37一、无 Ct 值（信号）出现：1.反应循环数不够：一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号；2.检测荧光信号的步骤有误：一般采用 72℃延伸时采集荧光，Taqman 方法则一般在退火结束或延伸结束采集信号；3.引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；4.探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸；5.模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起；6.模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生。
二、如何确认模板中是否含有 PCR 反应阻害物质：有时RNA或cDNA模板中存在对反转录和荧光PCR 反应的阻害物质。
为了确认这样的阻害物质的有无，我们可以使用高浓度的模板按 3－4 个梯度稀释，并使用其进行荧光定量 PCR 反应。
如果无阻害物质存在，得到的 Ct 值就会依模板浓度的变化而变化；而如果模板中有阻害物质的存在，实验过程中我们就会发现高浓度的模板有反应性能下降的现象。
三、Ct值出现过晚：1.反应条件不佳：未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；2.PCR各种反应成分的降解或加样量不够；3.扩增产物片段过长：一般采用 100－200bp 的扩增长度。
四、标准曲线的线性关系不佳：1.加样存在误差，标准品稀释不呈梯度；2.标准品降解：标准品尽量避免反复冻融；3.引物或探针不佳：重新设计；4.模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
五、阴性对照液出现明显的扩增：1.荧光 PCR mix 或水被污染；2.引物二聚体的出现：在 35 循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合溶解曲线进行分析；3.反应过程中探针降解：用PAGE电泳对探针进行检测。
六、溶解曲线不止一个主峰：1.引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现；2.引物浓度不佳：适当调整引物浓度；3.退火温度低：提高退火温度；4.镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度；5.模板中有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组 DNA 的污染，或通过引物设计避免非特异扩增。
荧光定量系列常见问题及解决方法
荧光定量系列常见问题及解决方法1)、扩增曲线形状异常a)、扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。
提高模板浓度重复实验。
b)、扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值。
减小基线终点(Ct值- 4)，重新分析数据。
c)、个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。
进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
2)、反应结束无扩增曲线出现a)、反应循环数不够：一般设置循环数为40，但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。
b)、确认程序中是否设置了信号采集步骤：两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
c)、确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除引物降解的可能性。
d)、模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
e)、模板降解：重新制备模板，重复实验。
3)、Ct值出现太晚a)、扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物。
b)、模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
c)、模板降解：重新制备模板，重复实验。
d)、PCR产物太长：一般将PCR产物长度设计为100 bp-150 bp之内。
e)、反应体系中存在PCR反应抑制剂：一般为加入模板时带入，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
4)、阴性对照也出现明显扩增a)、反应体系或者水被污染：更换新的Mix或者水重复实验。
反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
b)、引物二聚体的出现：一般在35循环以后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合融解曲线进行分析。
5)、绝对定量时标准曲线线性关系不佳a)、加样误差：加大模板稀释倍数，提高加样体积。
b)、标准品降解：重新制备标准品，重复实验。
c)、模板浓度太高：增加模板稀释倍数。
荧光定量pcr仪常见故障
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【定量数据分析】荧光定量PCR技术_常见问题与解答
螺旋课堂第一课－－荧光定量PCR 技术PCR 技术的发明极大地推动了分子生物学的发展，而且迅速被推广和应用到生命科学的各个领域，可以说它是目前核酸分子水平的基础及应用研究中使用最广泛的一项技术。
常规PCR 中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对PCR 扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA 的精确copy 数等，如此，荧光定量PCR 技术便应运而生。
本文将分为三大部分向大家介绍，首先是理论篇：首先了解荧光定量PCR 的理论知识，如荧光定量PCR 技术的原理、方法等；随后为实践篇：如实验的操作流程、注意事项、方法选择、结果分析与处理等；第三部分为问题分析与解答篇：荧光定量PCR 过程中有哪些常见问题，我们如何避免和解决。
荧光基团第一章理论篇一、荧光定量PCR 技术发展史1993 年，日本Higuchi 等人首次采用动态PCR 方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量PCR 技术的概念。
当时他使用了EB（溴乙锭）作为荧光标记染料，采用一台经过改良的热循环仪，用UV射线照射样品然后通过CCD 相机检测产生的荧光值，利用了PCR 反应中的数学函数关系，再结合加入标准品的方法，达到了对检测样品进行准确定量的目的，但由于这种方法由于有着在实验仪器资金上巨大的耗费，一些非特异的PCR 产物同样能被检测到并包含在被测的荧光信号值总量之中而导致定量不准确等因素，最终使这种实验技术在当时没能成为主流的实验技术。
1995 年美国PE 公司成功研制了TaqMan 技术，1996 年又推出了首台荧光定量PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct 值进行分析，荧光定量PCR 才很快得到大家的接受，并广为应用。
近年来，荧光定量PCR 技术不断完善，取得了突飞猛进的发展。
荧光定量pcr曲线混乱
荧光定量pcr曲线混乱
荧光定量PCR曲线混乱可能是由于以下几个因素造成的：
1. 引物选择不合适：荧光定量PCR需要使用适当的引物对目
标序列进行扩增，如果引物选择不当，可能会导致非特异性扩增或者扩增效率不高，从而影响PCR曲线的形状。
2. 模板或引物的质量问题：如果模板DNA或引物存在杂质，
或者质量不良，可能会导致PCR扩增效果不稳定，从而产生
混乱的PCR曲线。
3. 扩增条件不合适：PCR扩增过程中的温度和时间参数设置
不合适也会导致PCR曲线混乱。
比如，反应温度过高，扩增
效率可能过低或引起非特异扩增，反应温度过低，扩增效果可能不稳定。
4. 统计误差：PCR曲线的混乱也可能是由于实验中的统计误
差引起的。
在实验过程中，可能存在一些不可控的因素，比如抽取的样本量变化、荧光探针探测效率不稳定等，这些因素都可能导致PCR曲线的混乱。
为了解决这个问题，可以尝试以下措施：
1. 重新选择引物和荧光探针：确保引物和探针的选择是合适的，可以使用一些在线工具或专业软件来辅助设计及验证。
2. 清理DNA模板和引物：使用高质量的DNA模板和引物，
并确保它们没有受到污染或降解。
3. 优化扩增条件：调整PCR反应体系、扩增温度和时间等参数，通过实验优化来提高PCR扩增效率和稳定性。
4. 增加重复实验：进行更多的重复实验，以减小统计误差对PCR曲线的影响。
确保实验结果的可重复性和稳定性。
如果问题仍然存在，建议咨询专业技术人员，他们可能会给出更具体的建议和解决方案。
实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析
• YES。 • 低引物浓度会导致高Ct值（灵敏度低）。 • 所以对于低浓度的样本，反应体系中引物的浓度却不能太
低。
二、常见问题分析
如何判断他们是否存在扩增？
• 首先看对数图谱，和同一反应中的其它曲线相比，这些曲 线的形状不相同。
二、常见问题分析
如何判断他们是否存在扩增？
二、常见问题分析
3、重复性
1个样本4个复孔重复性好
二、常见问题分析
3、重复性
1个样本4个复孔重复性差
二、常见问题分析
造成重复性差的原因
• 基线、阈值的设置 • 加样误差（操作？移液器？） • 没有将试剂和样本充分混匀 • 低拷贝的样本→泊松分布 • 没有使用ROX校准（ABI7500）
二、常见问题分析
3）NaOH处理。
含干有扰铁DN，A合释成放。铁离子至PCR混合物，同上
与单链DNA相互作用
同上
与DNA、RNA结合，后续的提取过
程中不能被去除；
加BSA，结合亚铁血红素
抑制聚合酶活性。
二、常见问题分析
检查样本质量
• 用分光光度计测量样本260/280比值 • DNA纯度：OD260/OD280=1.8 • RNA纯度：OD260/OD280=2.0
比荧光，或者ROX添加浓度不适合，请将ROX校准关闭 （None）。
二、常见问题分析
4、“可疑的” 扩增曲线（以ABI7500为例）
• 由于PCR扩增形成的真正的扩增曲线通常很容易确认。 • 有特征的形状：首先有背景信号（基线期），然后是三个
增长阶段（指数增长期、线性增长期线性图谱，可以看到曲线有一定的上升。
• 同时这些曲线没有明显的指数增长期。
荧光定量常见问题分析
荧光定量 PCR 常见问题分析荧光定量 PCR 常见问题分析 Q1．CT 值出现过晚．1.扩增效率低，反应条件不够优化。
设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
2.PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。
3.PCR 产物太长。
一般采用 80-150bp 的产物长度。
Q2．无 CT 值（信号）出现．信号） 1.反应循环数不够。
一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至 45cycles），但高于 45 个循环会增加过多的背景信号。
2.检测荧光信号的步骤有误。
一般 SG 法采用72℃延伸时采集，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
3.引物或探针降解。
可通过 PAGE 电泳检测其完整性。
4.引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
5.模板量不足。
对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
6.模板降解。
避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
Q3．标准曲线的线性关系不佳． 1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
2.标准品出现降解。
应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3.引物或探针不佳。
重新设计更好的引物和探针 4．模板中存在抑制物，或模板浓度过高 Q4．阴性对照也出现明显的起飞． 1.应 mix 或水被污染。
2.引物二聚体的出现。
用 SG 法在 35cycles 以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。
3.反应过程中探针的降解。
用 PAGE 电泳对探针进行检测。
4.如果使用了 ROX 校正，则可能是 ROX 的降解所造成。
Q5．在溶解曲线前是否插入一个同溶解程序初始温度相同的一个保温过程．如果在熔解曲线前没有一个保温过程，则曲线会在前几个循环非常陡峭，使真正的熔解峰型几乎看不到。
Q6．熔解曲线不止一个主峰．1．引物设计不够优化。
应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
荧光定量PCR常见问题
荧光定量PCR常见问题1.定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。
开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。
关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。
2.哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml 光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。
ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：3.为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。
当硬盘驱动器上文件以分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。
碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。
碎片整理的方法如下：∙在Windows桌面上，选择开始(start),我的电脑(My computer)。
∙在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。
∙在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragment now)。
∙单击碎片整理(Defragment)。
∙当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）。
∙在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）。
为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。
4.何时执行windows service pack更新？不要执行该操作。
除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR 仪的计算机的操作系统。
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荧光定量 PCR 常见问题分析荧光定量 PCR 常见问题分析 Q1．CT 值出现过晚．1.扩增效率低，反应条件不够优化。
设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
2.PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。
3.PCR 产物太长。
一般采用 80-150bp 的产物长度。
Q2．无 CT 值（信号）出现．信号） 1.反应循环数不够。
一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至 45cycles），但高于 45 个循环会增加过多的背景信号。
2.检测荧光信号的步骤有误。
一般 SG 法采用72℃延伸时采集，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
3.引物或探针降解。
可通过 PAGE 电泳检测其完整性。
4.引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
5.模板量不足。
对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
6.模板降解。
避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
Q3．标准曲线的线性关系不佳． 1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
2.标准品出现降解。
应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3.引物或探针不佳。
重新设计更好的引物和探针 4．模板中存在抑制物，或模板浓度过高 Q4．阴性对照也出现明显的起飞． 1.应 mix 或水被污染。
2.引物二聚体的出现。
用 SG 法在 35cycles 以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。
3.反应过程中探针的降解。
用 PAGE 电泳对探针进行检测。
4.如果使用了 ROX 校正，则可能是 ROX 的降解所造成。
Q5．在溶解曲线前是否插入一个同溶解程序初始温度相
同的一个保温过程．如果在熔解曲线前没有一个保温过程，则曲线会在前几个循环非常陡峭，使真正的熔解峰型几乎看不到。
Q6．熔解曲线不止一个主峰．1．引物设计不够优化。
应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2.引物浓度不佳。
适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3.镁离子浓度过高。
适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。
4.模板有基因组的污染。
RNA 提取过程中避免 DNA 的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
Q7．扩增效率低．1.反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
2.反应条件不够优化，可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
3.反应体系中有 PCR 反应抑制物。
一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
Q8．实验重复性不好． 1.加样不准确。
2.仪器在样品上温度条件有差异，即温度均一性不好。
3.模板浓度低。
样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。
Q9．变性温度是否合适．大部分的双链 DNA 在 95°就开始解链了，在有些情况下在 90 至94°都不能很好地变性 DNA。
由于部 C C 分变性，参加反应的探针和引物相应的减少了，因此反应效率会下降。
Q10．变性时间是否合适． 15 到 20 秒对于变性扩增子是足够了，然而，长一点的产物，可能会需要 30 秒，60 秒的变性时间通常是不需要的。
Q11．退火温度和时间是否合适．检查引物和探针的 Tm 值，SYBRGreenI 的退火时间大约 20 到 35 秒，双标记探针通常是两步法，退火和延伸合并为一步，时间大约是 45 到 60 秒，温度通
常在 60°， C 对于 FRET 探针退火步骤大约 20 到 30 秒。
Q12．在哪一步骤采集信号． SYBRGreenI 应当在 72°，此时绝大部分的 DNA 是双链状态，如上所述，双标记探针通常是两步检测， C 因此信号采集应该在退火延伸的整合步骤。
对于 FRET 检测，数据应该在退火步骤检测。
如果对于信号采集点不确定，可以多点采集作对比。
如果监控屏幕检测不到信号，检查程序设定是否存在至少一个的信号采集点。