荧光定量PCR技术原理与应用
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TaqMan 方法 Molecular Beacon法 (分子信标) 重复性好 高特异性 荧光 背景低
价格高
只适合特定目标 只适合特定目标 设计困难 价格高
病原体检测，疾病耐药 基因研究,药物疗效考核 遗传疾病的诊断
特定基因分析 SNP分析
四、荧光定量PCR实验前知识体系
1 2 3 4 5 6 7 8 目标样品准备 目的生物靶基因生物信息分析—引物 选什么荧光素 目的基因 看家基因 针对性定量试剂盒 PCR误差控制 预期用哪种分析方法 定量PCR板的设置 PCR组分体系及上机
Forward primer Reverse primer
双色荧光
F Q V Q
C
T
F
G
F
C
Q
F
Allele-specific probe Allele-specific probe
R
A
V
T
Q
R
实验结果
(A/A)
VIC
FAM
(G/A)
F
FAM
VIC
C
Q
V
T
Q
(G/G)
VIC FAM
3
分子信标—水解型探针
5 PCR误差控制
防止人为污染
wk.baidu.com
使用Master mix
配置预混体系
设置生物学重复（不同个体----3-8个）
技术性重复 阳性及阴性对照 （复孔----3次）
6 预期用哪种分析方法
单标准曲线法 双标准曲线法 2 -△△Ct法
预期用哪种分析方法直接涉及到PCR板上的孔设置
试剂及耗材 扩增曲线
3 常用名词概念
荧光阈值 Ct值
溶解曲线
扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件
荧光阈值
平台期 Rn（荧光强度）
前15个循环信号作为荧光 本底信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是3～ 15个循环的荧光信号的标准偏 差的10倍 手动设置：大于荧光背景 值和阴性对照的荧光最高值； 进入指数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过 阈值
mRNA 逆转录的选择
逆转录引物选择
引物 特异性 反应效率
Oligo dT
Random hexmer Specific primer
中
低 高
低
中 高
下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
逆转录酶
SuperRT 逆转录酶（RNase H-） HiFi-MMLV逆转录酶（RNase H-）
2 引物
生物信息分析 NCBI
总原则与普通PCR相同：
避免引物二聚体，避免二级结构 扩增片段长度（80 – 300 bp) 推荐做跨intron设计
INTRON 2 EXON 2 EXON 2
EXON 1 EXON 1
DNA
RNA
荧 光 定 量 引 物 设 计 PCR
Taqman 探 针 设 计 原 则
标识管理
食物种转基因成分规定：欧盟出台转基因产品的标识制度(1990)
，规定0.9%阈值标准（2003)
食物中不同程度的混有转基因成分
转基因大豆 转基因大米 转基因棉花 转基因番茄 抗杀草剂 草甘膦 BT蛋白 苏云金杆菌基因 抗虫 抗冻蛋白 抗冻
通过内标基因（转基因与非转基因植物都等量表达）来对每个样品DNA进行定量 定量外源基因（只有转基因植物表达）的比例来进行GMO含量检测
Molecular Beacon、Amplisensor技术是基于探针技术发展起来的， 原理与TaqMan法相似
1
SYBR Green法
SYBR Green 染料能结合到双链DNA的小沟部位，形成双链DNA后发 出荧光。变性时，DNA双链分开，无荧光。
SYBR Green
优点： 对DNA模板没有选择性－适用于任何DNA，使用方便－不必 设计复杂探针, 非常灵敏， 价格低廉 缺点： 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性，对引物特异性要 求较高
SYBGreen法溶解曲线
特异性
荧光定量PCR反应性的确认
线性关系、扩增效率确认
PCR扩增效率（E）:0.9-1.2
相关系数（R2）：大于0.98 标准曲线斜率: -3 － -3.5
检测灵敏度确认
35 Cycles内可得到好的定量结果 如果采用SYBR检测方法，30 Cycles内无非特异性产物扩增
核酸变异
Taqman探针分析法 复合探针法 高分辨率熔解(High-resolution melting，简称HRM)分析法
应用在突变扫描、序列配对、基因分型、甲基化分析等
如：SNP分析
SNP（单核苷酸多态性）
人类基因组中的单碱基突变 大约93%的基因至少含有一个SNP
缺点：仪器受限
可检测已知和未知SNP；
<400bp扩增产物内SNP，灵敏度和精确度100%。
几种方法的比较
方法
SYBR Green I 方法
优点
适用性广 灵敏 方便 便宜
缺点
引物要求高 易出现非特异性带
适用范围
适合科研中对各种目的 基因定量分析，基因表 达量的研究，转基因重 组动植物的研究
特异性高
研究方面
植物学方面：
转基因植物中基因拷贝数与性状的关系 监测转基因植物中基因拷贝数的变化 转基因植株早期的筛选 监测农作物病虫害抗药性变化 研究新的药物及方法
动物学方面：
动物疫情监测 新的防止疫情发生及控制的药物及方法的研究 转基因动物中目的基因拷贝数与品质的关系研究 及早期筛选
相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值极具重现性
Ct值特性 2 与模板量的对应性
模板DNA量越多，荧光 达到阈值的循环数越少，即 Ct值越小。
Log模板起始浓度与Ct 值呈线性关系。
Ck
Sample
104 Ck 102
Cycle number
Lg of DNA concentration
样本处理与RNA提取
外界刺激 – 10分钟 – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 – 2分钟内 –固定、裂解细胞 RNA样本保存液 Trizol 超纯RNA提取试剂盒 RNA的评价与鉴定 - 完整性 - 纯度 小心DNA污染！ - 使用DNaseⅠ - 引物设计 - 以RNA作PCR阴性对照
Lg－liner phase Threshold
Baselin e Cycle（循环 数）
Ct值
Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增 产物的荧光信号达到设定 的阈值时所经过的扩增循 环次数
Rn（荧光强度）
Ct value
Cycle（循环数）
Ct值特性 1 重现性
纵 轴 ： 荧 光 信 号 量
横轴：PCR反映循环数
融解曲线
融解温度TM
非特异扩增产物 目的基因产物
2
TaqMan法---水解型杂交探针
探针结构
利用Taq酶有 3 ′→ 5′外切核酸酶活性，可水解探针
优点：
缺点
探针Tm为68-70℃ ；引物Tm为59-60℃
双Taqman探针法 基因型分析
(G/G)（正常） (G/A)（正常） (A/A)（异常）
标准曲线样品——标准品
标准品梯度稀释方法
从标准曲线入手，分析内参基因 – 目的基因扩增效果
-- 融解曲线：单一特异性产物 -- 扩增曲线：Ct值 -- 标准曲线： 扩增效率尽量高，目的基因 尽可能接近内参基因
7 定量PCR板的设置
单标法
96孔板设置举例
SNP分型的意义
可能引起疾病或疾病的易感性 作为基因缺陷型疾病的标志物 SNP的漂变可作为进化研究手段 药物的抗药性研究
方法： HRM分析
如：甲基化
HRM分析
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的 甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作 用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。 DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活 化和表达。这种DNA修饰方在不改变基因序列前提下实现对基因 表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相 关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基 化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基 因表达的下降。阅微基因通过以下方法提供甲基化检测服务：
二、基本原理
1 实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环 扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板 进行定量分析 与常规 PCR技术比较： 终点产物 定量和定性分析 无法对起始模板准确定量 无法对扩增反应实时检测
定量PCR仪
2 系统组成
电脑
分析软件
1 目标样品准备 mRNA （mRNA或cDNA）
cDNA
DNA
质粒
●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 -2.0之间 ●DNA用量：0.05 ng –100 ng ●RNA纯度：OD260/OD280=2.0 ●cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL
常 用 引 物 设 计 软 件
引物分析——溶解曲线，特异性
融解曲线分析
-- 单一特异性产物
将温度对荧光强度的变化求导
3 选什么荧光素
SYBR Green
和试验目的相关
Taqman
表达差异分析 SNP分析 甲基化分析
饱和荧光素
…………
4 针对性荧光定量试剂盒
ABI Takara Bio-rad LightScanner
环 茎
标记荧光的发夹探针
环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成
荧光素
淬灭剂
工作原理
FRET
分子信标优缺点 优点
高特异性：对目标序列
缺点
板结合
只能用于一个特定目标
设计困难 稳定性差杂交时探针不能肯定完全与模 价格比较高
检测SNP最灵敏的试剂之一
荧光背景低
4
饱和染料
HRM(高分辨率溶解曲线分析技术)
表达差异
各种核酸染料 Taqman探针 分子信标 复合探针等
如：用SYBR Green I进行GMO定量
转基因生物又称遗传修饰生物(Genetically Modified Organisms，GMO)
，经基因工程技术改变基因组构成的生物，包括转基因植物、转基
因微生物和转基因动物。
目前为止，包括欧盟国家在内的40余个国家
原理：每一段DNA都有其独特的序列，也就有了独特的熔解曲线形状，应用 饱和荧光染料和高分辨率的熔解曲线分析技术可精确对样品的基因型进行分
析，精度可达单碱基差异。 不饱和染料
饱和染料
溶解曲线
1 突变扫描和基因分型的遗传分析方法
2 在PCR结束后直接运行高分辨熔解
3 需要特殊荧光定量PCR仪
饱和染料种类：
医疗方面
临床检测
疾病的临床早期诊断 疗效的考评
遗传病的诊断
等位基因的检测 多基因遗传病的突变检测 基因表达异常所导致的疾病的检测
肿瘤的诊断
肿瘤相关基因的表达检测 肿瘤标志物检测
研究方面
药物及医疗相关
新药研发 药物疗效研究
分子生物学方面
研究各种处理对细胞中基因表达变化的影响 比较染病组织与正常组织中各种mRNA含量差异 DNA或RNA的转染量与实验结果关系的研究 基因整合拷贝数的研究
EvaGreen®、LCGreen、SYBR® GreenER™和SYTO 9 染料
HRM分析仪器：
美国Idaho公司：LightScanner96 美国：Rapid Cycler； Bio-Rad：Precision melt supermix（EvaGreen染料）
优点：高通量、简单、快速、高灵敏度、成本低廉 避免污染造成的假阳性；
No template control 确认
35 Cycles内无引物二聚体产生
三、荧光定量PCR标记方法
1 非特异性荧光标记： 2 SYBR Green 特异性荧光标记： TaqMan法
分子信标法－Molecular Beacon
复合探针法－Amplisensor 高分辨率熔解(High-resolution melting，简称HRM)
荧光定量PCR技术原理与应用
研究生现代分子实验基础 李文娟 水产与生命学院 上海海洋大学
Outline
应用
基本原理
方法
定量PCR实验设计
数据处理
一、实时荧光定量PCR的应用
核酸的定量（RNA、DNA的定量） 核酸定性分析如SNP分析
基因型分析
RNA变异分析 溶解曲线分析 （HRM）
价格高
只适合特定目标 只适合特定目标 设计困难 价格高
病原体检测，疾病耐药 基因研究,药物疗效考核 遗传疾病的诊断
特定基因分析 SNP分析
四、荧光定量PCR实验前知识体系
1 2 3 4 5 6 7 8 目标样品准备 目的生物靶基因生物信息分析—引物 选什么荧光素 目的基因 看家基因 针对性定量试剂盒 PCR误差控制 预期用哪种分析方法 定量PCR板的设置 PCR组分体系及上机
Forward primer Reverse primer
双色荧光
F Q V Q
C
T
F
G
F
C
Q
F
Allele-specific probe Allele-specific probe
R
A
V
T
Q
R
实验结果
(A/A)
VIC
FAM
(G/A)
F
FAM
VIC
C
Q
V
T
Q
(G/G)
VIC FAM
3
分子信标—水解型探针
5 PCR误差控制
防止人为污染
wk.baidu.com
使用Master mix
配置预混体系
设置生物学重复（不同个体----3-8个）
技术性重复 阳性及阴性对照 （复孔----3次）
6 预期用哪种分析方法
单标准曲线法 双标准曲线法 2 -△△Ct法
预期用哪种分析方法直接涉及到PCR板上的孔设置
试剂及耗材 扩增曲线
3 常用名词概念
荧光阈值 Ct值
溶解曲线
扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件
荧光阈值
平台期 Rn（荧光强度）
前15个循环信号作为荧光 本底信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是3～ 15个循环的荧光信号的标准偏 差的10倍 手动设置：大于荧光背景 值和阴性对照的荧光最高值； 进入指数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过 阈值
mRNA 逆转录的选择
逆转录引物选择
引物 特异性 反应效率
Oligo dT
Random hexmer Specific primer
中
低 高
低
中 高
下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
逆转录酶
SuperRT 逆转录酶（RNase H-） HiFi-MMLV逆转录酶（RNase H-）
2 引物
生物信息分析 NCBI
总原则与普通PCR相同：
避免引物二聚体，避免二级结构 扩增片段长度（80 – 300 bp) 推荐做跨intron设计
INTRON 2 EXON 2 EXON 2
EXON 1 EXON 1
DNA
RNA
荧 光 定 量 引 物 设 计 PCR
Taqman 探 针 设 计 原 则
标识管理
食物种转基因成分规定：欧盟出台转基因产品的标识制度(1990)
，规定0.9%阈值标准（2003)
食物中不同程度的混有转基因成分
转基因大豆 转基因大米 转基因棉花 转基因番茄 抗杀草剂 草甘膦 BT蛋白 苏云金杆菌基因 抗虫 抗冻蛋白 抗冻
通过内标基因（转基因与非转基因植物都等量表达）来对每个样品DNA进行定量 定量外源基因（只有转基因植物表达）的比例来进行GMO含量检测
Molecular Beacon、Amplisensor技术是基于探针技术发展起来的， 原理与TaqMan法相似
1
SYBR Green法
SYBR Green 染料能结合到双链DNA的小沟部位，形成双链DNA后发 出荧光。变性时，DNA双链分开，无荧光。
SYBR Green
优点： 对DNA模板没有选择性－适用于任何DNA，使用方便－不必 设计复杂探针, 非常灵敏， 价格低廉 缺点： 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性，对引物特异性要 求较高
SYBGreen法溶解曲线
特异性
荧光定量PCR反应性的确认
线性关系、扩增效率确认
PCR扩增效率（E）:0.9-1.2
相关系数（R2）：大于0.98 标准曲线斜率: -3 － -3.5
检测灵敏度确认
35 Cycles内可得到好的定量结果 如果采用SYBR检测方法，30 Cycles内无非特异性产物扩增
核酸变异
Taqman探针分析法 复合探针法 高分辨率熔解(High-resolution melting，简称HRM)分析法
应用在突变扫描、序列配对、基因分型、甲基化分析等
如：SNP分析
SNP（单核苷酸多态性）
人类基因组中的单碱基突变 大约93%的基因至少含有一个SNP
缺点：仪器受限
可检测已知和未知SNP；
<400bp扩增产物内SNP，灵敏度和精确度100%。
几种方法的比较
方法
SYBR Green I 方法
优点
适用性广 灵敏 方便 便宜
缺点
引物要求高 易出现非特异性带
适用范围
适合科研中对各种目的 基因定量分析，基因表 达量的研究，转基因重 组动植物的研究
特异性高
研究方面
植物学方面：
转基因植物中基因拷贝数与性状的关系 监测转基因植物中基因拷贝数的变化 转基因植株早期的筛选 监测农作物病虫害抗药性变化 研究新的药物及方法
动物学方面：
动物疫情监测 新的防止疫情发生及控制的药物及方法的研究 转基因动物中目的基因拷贝数与品质的关系研究 及早期筛选
相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值极具重现性
Ct值特性 2 与模板量的对应性
模板DNA量越多，荧光 达到阈值的循环数越少，即 Ct值越小。
Log模板起始浓度与Ct 值呈线性关系。
Ck
Sample
104 Ck 102
Cycle number
Lg of DNA concentration
样本处理与RNA提取
外界刺激 – 10分钟 – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 – 2分钟内 –固定、裂解细胞 RNA样本保存液 Trizol 超纯RNA提取试剂盒 RNA的评价与鉴定 - 完整性 - 纯度 小心DNA污染！ - 使用DNaseⅠ - 引物设计 - 以RNA作PCR阴性对照
Lg－liner phase Threshold
Baselin e Cycle（循环 数）
Ct值
Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增 产物的荧光信号达到设定 的阈值时所经过的扩增循 环次数
Rn（荧光强度）
Ct value
Cycle（循环数）
Ct值特性 1 重现性
纵 轴 ： 荧 光 信 号 量
横轴：PCR反映循环数
融解曲线
融解温度TM
非特异扩增产物 目的基因产物
2
TaqMan法---水解型杂交探针
探针结构
利用Taq酶有 3 ′→ 5′外切核酸酶活性，可水解探针
优点：
缺点
探针Tm为68-70℃ ；引物Tm为59-60℃
双Taqman探针法 基因型分析
(G/G)（正常） (G/A)（正常） (A/A)（异常）
标准曲线样品——标准品
标准品梯度稀释方法
从标准曲线入手，分析内参基因 – 目的基因扩增效果
-- 融解曲线：单一特异性产物 -- 扩增曲线：Ct值 -- 标准曲线： 扩增效率尽量高，目的基因 尽可能接近内参基因
7 定量PCR板的设置
单标法
96孔板设置举例
SNP分型的意义
可能引起疾病或疾病的易感性 作为基因缺陷型疾病的标志物 SNP的漂变可作为进化研究手段 药物的抗药性研究
方法： HRM分析
如：甲基化
HRM分析
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的 甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作 用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。 DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活 化和表达。这种DNA修饰方在不改变基因序列前提下实现对基因 表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相 关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基 化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基 因表达的下降。阅微基因通过以下方法提供甲基化检测服务：
二、基本原理
1 实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环 扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板 进行定量分析 与常规 PCR技术比较： 终点产物 定量和定性分析 无法对起始模板准确定量 无法对扩增反应实时检测
定量PCR仪
2 系统组成
电脑
分析软件
1 目标样品准备 mRNA （mRNA或cDNA）
cDNA
DNA
质粒
●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 -2.0之间 ●DNA用量：0.05 ng –100 ng ●RNA纯度：OD260/OD280=2.0 ●cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL
常 用 引 物 设 计 软 件
引物分析——溶解曲线，特异性
融解曲线分析
-- 单一特异性产物
将温度对荧光强度的变化求导
3 选什么荧光素
SYBR Green
和试验目的相关
Taqman
表达差异分析 SNP分析 甲基化分析
饱和荧光素
…………
4 针对性荧光定量试剂盒
ABI Takara Bio-rad LightScanner
环 茎
标记荧光的发夹探针
环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成
荧光素
淬灭剂
工作原理
FRET
分子信标优缺点 优点
高特异性：对目标序列
缺点
板结合
只能用于一个特定目标
设计困难 稳定性差杂交时探针不能肯定完全与模 价格比较高
检测SNP最灵敏的试剂之一
荧光背景低
4
饱和染料
HRM(高分辨率溶解曲线分析技术)
表达差异
各种核酸染料 Taqman探针 分子信标 复合探针等
如：用SYBR Green I进行GMO定量
转基因生物又称遗传修饰生物(Genetically Modified Organisms，GMO)
，经基因工程技术改变基因组构成的生物，包括转基因植物、转基
因微生物和转基因动物。
目前为止，包括欧盟国家在内的40余个国家
原理：每一段DNA都有其独特的序列，也就有了独特的熔解曲线形状，应用 饱和荧光染料和高分辨率的熔解曲线分析技术可精确对样品的基因型进行分
析，精度可达单碱基差异。 不饱和染料
饱和染料
溶解曲线
1 突变扫描和基因分型的遗传分析方法
2 在PCR结束后直接运行高分辨熔解
3 需要特殊荧光定量PCR仪
饱和染料种类：
医疗方面
临床检测
疾病的临床早期诊断 疗效的考评
遗传病的诊断
等位基因的检测 多基因遗传病的突变检测 基因表达异常所导致的疾病的检测
肿瘤的诊断
肿瘤相关基因的表达检测 肿瘤标志物检测
研究方面
药物及医疗相关
新药研发 药物疗效研究
分子生物学方面
研究各种处理对细胞中基因表达变化的影响 比较染病组织与正常组织中各种mRNA含量差异 DNA或RNA的转染量与实验结果关系的研究 基因整合拷贝数的研究
EvaGreen®、LCGreen、SYBR® GreenER™和SYTO 9 染料
HRM分析仪器：
美国Idaho公司：LightScanner96 美国：Rapid Cycler； Bio-Rad：Precision melt supermix（EvaGreen染料）
优点：高通量、简单、快速、高灵敏度、成本低廉 避免污染造成的假阳性；
No template control 确认
35 Cycles内无引物二聚体产生
三、荧光定量PCR标记方法
1 非特异性荧光标记： 2 SYBR Green 特异性荧光标记： TaqMan法
分子信标法－Molecular Beacon
复合探针法－Amplisensor 高分辨率熔解(High-resolution melting，简称HRM)
荧光定量PCR技术原理与应用
研究生现代分子实验基础 李文娟 水产与生命学院 上海海洋大学
Outline
应用
基本原理
方法
定量PCR实验设计
数据处理
一、实时荧光定量PCR的应用
核酸的定量（RNA、DNA的定量） 核酸定性分析如SNP分析
基因型分析
RNA变异分析 溶解曲线分析 （HRM）