荧光定量PCR检测技术
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原理示意图
PCR扩增前
荧 光
完好探针
荧 光 淬
物
上游引物
质
灭 物
质
模板负链
PCR扩增时
DNA合成
探针水解，释放荧光
TaqMan® 探针
Donor dye (Reporter)
Acceptor dye (Quencher)
未结合的探针
Light Taq Light
Energy transfer
光发射或者以热量形式散失
前或向后）的序列，或重新选择一个探针， 再寻找合适的引物。
荧光定量PCR检测技术
（FQ-PCR, Fluorescence quantitative PCR）
实时荧光定量PCR技术
所谓real-time FQ-PCR技术，是指 在PCR反应体系中加入荧光基因，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进 程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。
是一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂 交技术相结合的定量PCR方法。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭 基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切 酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬 灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到 荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧 光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产 物形成完全同步。
TaqMan检测技术
探针、引物与目的片段结合，FRET
Light Emission
Taq
Taq 水解探针，报告荧光素与淬灭荧光素分离
TaqMan检测技术的设计
与普通PCR的设计基本相同，区别 在于引物与探针的设计一般需要特 定的软件，如美国ABI公司开发的 Primer Express软件。
（一）选择靶基因
TaqMan技术主要用于检测，所以其扩增 的基因必须是特异的，如：
实时荧光定量PCR原理
在PCR反应早期，产生荧光的水平不能 与背景明显地区别，而后荧光的产生进 入指数期、线性期和最终的平台期，因 此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量，并且由此来推 断模板最初的含量。
实时荧光定量PCR原理
为了便于对所检测样本进行比较，在real-time QPCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值 （threshold）。
Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号达到设定的域
值时所经历的循Βιβλιοθήκη 数。什么是C(t)值C(t)
Threshold（域值）
为什么要引入C(t)值
96 replicates of B7 gene molecular beacon
Ct
Endpoin
实时荧光定量PCR原理
研究表明，每个模板的Ct值与该模 板的起始拷贝数的对数存在线性关 系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
PCR的高效扩增特性 核酸探针的高特异性 光谱技术的高灵敏性和可计量性
实时荧光定量PCR
定义
利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控
目的
对起始模板进行定量
优点
灵敏，重复性，动态范围宽，高通量
原理
Ct 值与起始模板浓度的对数成比例
实时荧光定量PCR原理
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数 方式增加的，随着反应循环数的增加，最终 PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入 平台期。
实时荧光定量
Ct 18 and Ct 22, 2^(4 Ct shift) = 16 fold difference
实时荧光定量PCR原理
利用已知起始拷贝数的标准品可作出 标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝 数的对数，纵坐标代Ct值。因此只要 获得未知样品的Ct值，即可从标准曲 线上计算出该样品的起始拷贝数。
以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号 （baseline），荧光域值的缺省设置是3～15 个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
实时荧光定量PCR原理
如果检测到荧光信号超过域值被认为是 真正的信号，它可用于定义样本的域值 循环数（Ct）。
（三）选择引物
3、与靶基因其他区域配对较少； 4、G+C含量在40%以上； 5、相同碱基连续不超过4个；
6、Tm值比探针Tm值低10±1℃;
（三）选择引物
7、探针与两条引物之间的各种组合形成 的二聚体都较少，特别是引物3’端与探针 配对很少；
8、PCR扩增片断在70—250个碱基之间。 如果找不到合适的引物，可调整探针（向
标准曲线
如何定量
未知样品的C(t) 值
定量
荧光化学
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分 为两种：荧光探针和荧光染料。
荧光探针：TaqMan荧光探针 荧光染料：SYBR荧光染料
一、TaqMan检测技术原理
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入 一个特异性的荧光探针，该探针为一寡 核苷酸，与扩增片断内部某一段系列相 同或互补，两端分别标记一个报告荧光 基团和一个淬灭荧光基团。
某种病原微生物所共有的保守基因 （检测某种病原微生物）；
某个血清型所特有的基因序列 （区分检测某个血清型）；
选择决定毒力强弱的基因 （区分强毒和弱毒）等。
（二）选择探针
选择探针需要同时满足以下条件： 1、在靶基因的保守区域 2、G+C含量在40%以上； 3、相同碱基连续不超过4个；
4、Tm值在71±2℃;
（二）选择探针
5、内部自身配对较少； 6、5’端不为G； 7、G数目比C数目少；
如果6和7难以满足的时候，就要考 虑用互补序列作探针。
（三）选择引物
探针选好之后，在探针的上下游分别选 择合适的引物序列，引物应满足如下的 条件:
1、在靶基因保守和无二级结构的区域； 2、与探针所在区域不重叠；
在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧 光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此 用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。
利用电泳定量
11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference
实时荧光定量PCR原理
在real-time Q-PCR中，对整个PCR反 应扩增过程进行了实时的监测和连续地 分析扩增相关的荧光信号，随着反应时 间的进行，监测到的荧光信号的变化可 以绘制成一条曲线。
PCR扩增前
荧 光
完好探针
荧 光 淬
物
上游引物
质
灭 物
质
模板负链
PCR扩增时
DNA合成
探针水解，释放荧光
TaqMan® 探针
Donor dye (Reporter)
Acceptor dye (Quencher)
未结合的探针
Light Taq Light
Energy transfer
光发射或者以热量形式散失
前或向后）的序列，或重新选择一个探针， 再寻找合适的引物。
荧光定量PCR检测技术
（FQ-PCR, Fluorescence quantitative PCR）
实时荧光定量PCR技术
所谓real-time FQ-PCR技术，是指 在PCR反应体系中加入荧光基因，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进 程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。
是一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂 交技术相结合的定量PCR方法。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭 基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切 酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬 灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到 荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧 光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产 物形成完全同步。
TaqMan检测技术
探针、引物与目的片段结合，FRET
Light Emission
Taq
Taq 水解探针，报告荧光素与淬灭荧光素分离
TaqMan检测技术的设计
与普通PCR的设计基本相同，区别 在于引物与探针的设计一般需要特 定的软件，如美国ABI公司开发的 Primer Express软件。
（一）选择靶基因
TaqMan技术主要用于检测，所以其扩增 的基因必须是特异的，如：
实时荧光定量PCR原理
在PCR反应早期，产生荧光的水平不能 与背景明显地区别，而后荧光的产生进 入指数期、线性期和最终的平台期，因 此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量，并且由此来推 断模板最初的含量。
实时荧光定量PCR原理
为了便于对所检测样本进行比较，在real-time QPCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值 （threshold）。
Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号达到设定的域
值时所经历的循Βιβλιοθήκη 数。什么是C(t)值C(t)
Threshold（域值）
为什么要引入C(t)值
96 replicates of B7 gene molecular beacon
Ct
Endpoin
实时荧光定量PCR原理
研究表明，每个模板的Ct值与该模 板的起始拷贝数的对数存在线性关 系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
PCR的高效扩增特性 核酸探针的高特异性 光谱技术的高灵敏性和可计量性
实时荧光定量PCR
定义
利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控
目的
对起始模板进行定量
优点
灵敏，重复性，动态范围宽，高通量
原理
Ct 值与起始模板浓度的对数成比例
实时荧光定量PCR原理
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数 方式增加的，随着反应循环数的增加，最终 PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入 平台期。
实时荧光定量
Ct 18 and Ct 22, 2^(4 Ct shift) = 16 fold difference
实时荧光定量PCR原理
利用已知起始拷贝数的标准品可作出 标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝 数的对数，纵坐标代Ct值。因此只要 获得未知样品的Ct值，即可从标准曲 线上计算出该样品的起始拷贝数。
以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号 （baseline），荧光域值的缺省设置是3～15 个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
实时荧光定量PCR原理
如果检测到荧光信号超过域值被认为是 真正的信号，它可用于定义样本的域值 循环数（Ct）。
（三）选择引物
3、与靶基因其他区域配对较少； 4、G+C含量在40%以上； 5、相同碱基连续不超过4个；
6、Tm值比探针Tm值低10±1℃;
（三）选择引物
7、探针与两条引物之间的各种组合形成 的二聚体都较少，特别是引物3’端与探针 配对很少；
8、PCR扩增片断在70—250个碱基之间。 如果找不到合适的引物，可调整探针（向
标准曲线
如何定量
未知样品的C(t) 值
定量
荧光化学
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分 为两种：荧光探针和荧光染料。
荧光探针：TaqMan荧光探针 荧光染料：SYBR荧光染料
一、TaqMan检测技术原理
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入 一个特异性的荧光探针，该探针为一寡 核苷酸，与扩增片断内部某一段系列相 同或互补，两端分别标记一个报告荧光 基团和一个淬灭荧光基团。
某种病原微生物所共有的保守基因 （检测某种病原微生物）；
某个血清型所特有的基因序列 （区分检测某个血清型）；
选择决定毒力强弱的基因 （区分强毒和弱毒）等。
（二）选择探针
选择探针需要同时满足以下条件： 1、在靶基因的保守区域 2、G+C含量在40%以上； 3、相同碱基连续不超过4个；
4、Tm值在71±2℃;
（二）选择探针
5、内部自身配对较少； 6、5’端不为G； 7、G数目比C数目少；
如果6和7难以满足的时候，就要考 虑用互补序列作探针。
（三）选择引物
探针选好之后，在探针的上下游分别选 择合适的引物序列，引物应满足如下的 条件:
1、在靶基因保守和无二级结构的区域； 2、与探针所在区域不重叠；
在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧 光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此 用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。
利用电泳定量
11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference
实时荧光定量PCR原理
在real-time Q-PCR中，对整个PCR反 应扩增过程进行了实时的监测和连续地 分析扩增相关的荧光信号，随着反应时 间的进行，监测到的荧光信号的变化可 以绘制成一条曲线。