实时荧光定量PCR技术的原理及应用

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(图)

一、实时荧光定量PCR原理

（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

（二）实时原理

1、常规PCR技术：

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。

2、实时定量PCR技术：

利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析

3、如何对起始模板定量？

通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.

4、几个概念：

（1）扩增曲线：

（2）荧光阈值：

（3）Ct值：

CT值的重现性：

5、定量原理：

理想的PCR反应：X=X0*2n

非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)n

n：扩增反应的循环次数

X：第n次循环后的产物量

X0：初始模板量

Ex：扩增效率

5、标准曲线

6、绝对定量

1）确定未知样品的C(t)值

2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量

7、DNA的荧光标记：

二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍

方法一：SYBR Green法

（一）工作原理

1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位

2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光

3、变性时，DNA双链分开，无荧光

4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。

PCR反应体系的建立及优化:

1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测

2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准

3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物

4、反应Buffer 体系的优化

5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定

6、其他与常规PCR相同

（二）应用范围

1、起始模板的测定；

2、基因型的分析；

3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。

（三）优点及缺点

优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。

缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。

方法二：TaqMan---水解型杂交探针

**5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等

**3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)

** 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光**Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针

（一）工作原理

注意：每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光PCR反应的建立：

1、引物、探针的设计：

探针Tm为68-70℃，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，

引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃

2、反应参数的确定：

一般为：94 ℃，10-20S

60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）

也可通过温度梯度优化退火温度72 ℃，45 S，

3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值

引物浓度：50-900nM

探针浓度：50-250nM

4、其他与常规PCR相同

（二）优缺点

优点：

对目标序列的高特异性

------阴性结果确定

设计相对简单

------与目标序列某一区域互补重复性比较好

缺点：

只适合一个特定的目标;

委托公司标记，价格较高;

不易找到本底低的探针