荧光定量PCR仪技术原理(罗氏)
荧光定量PCR原理及实验步骤精选全文
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荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。
计算好所有引物和SYBgreen
的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。
上机。
荧光定量pcr仪原理
荧光定量pcr仪原理
荧光定量PCR仪是一种用于测量PCR反应过程中荧光信号的仪器。
其原理基于PCR反应中的DNA扩增过程以及荧光染料的发射和检测。
PCR是一种通过使用DNA聚合酶酶和特定引物，在适当的温度下连续进行反复的DNA复制过程。
PCR反应通常包含三个基本步骤：变性（解旋DNA双链），退火（引物结合到模板DNA上），和延伸（DNA聚合酶沿引物扩增目标序列）。
此过程会导致目标DNA序列数量的指数性增加。
荧光定量PCR仪中，DNA的扩增过程通常伴随着一种荧光染料的加入。
这种荧光染料会在扩增过程中与新合成的DNA结合，产生荧光信号。
荧光定量PCR仪通过在PCR反应过程中记录荧光信号的强度来测量PCR反应的进程。
仪器中的光学系统会周期性地激发荧光信号，并通过检测器检测信号的强度。
荧光定量PCR仪可以记录每一个PCR循环的荧光信号，然后使用计算机软件分析这些信号的特征，例如峰值高度或面积。
通过与已知浓度的标准样品进行比较，可以利用荧光信号的强度来定量PCR反应中的目标DNA的初始浓度。
罗氏荧光定量pcr仪器
罗氏荧光定量PCR仪器简介罗氏荧光定量PCR仪器（Roche Real-Time PCR System）是一种用于荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）的仪器。
PCR技术是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，可以在体外大量复制DNA序列。
荧光定量PCR通过荧光信号的强度来定量PCR反应产物的数量，具有高灵敏度、高准确性和高通量的特点，被广泛应用于生命科学研究、疾病诊断和药物研发等领域。
罗氏是一家全球领先的医药和诊断解决方案提供商，旗下的荧光定量PCR仪器采用先进的技术和设计，为用户提供可靠和精确的PCR分析结果。
主要特点1.高灵敏度：罗氏荧光定量PCR仪器采用先进的光学系统，能够检测和定量非常低浓度的荧光信号，提高了实验的灵敏度。
2.高准确性：仪器内置的精确温度控制系统和优化的PCR反应条件，保证了实验结果的准确性和可重复性。
3.高通量：罗氏荧光定量PCR仪器支持多样品同时进行PCR反应，大大提高了实验的通量，节省了时间和成本。
4.灵活性：仪器配备了多样的PCR试剂和芯片，可以适应不同实验需求的扩增反应。
5.友好的用户界面：仪器具有直观的用户界面和易于操作的软件，用户可以轻松设置实验参数、监控实时反应和分析数据结果。
主要应用罗氏荧光定量PCR仪器在各种领域都有广泛的应用，包括但不限于以下几个方面：1.基因表达分析：通过定量PCR技术，可以准确测量基因在不同组织、细胞或疾病状态下的表达水平，帮助科研人员了解基因的功能和调控机制。
2.微生物检测：罗氏荧光定量PCR仪器可以用于检测和定量微生物如细菌、病毒、真菌等的核酸序列，广泛应用于食品安全、临床微生物学和环境监测等领域。
3.病毒载量检测：病毒载量是评估病毒感染严重程度的重要指标，罗氏荧光定量PCR仪器可以定量分析病毒的核酸含量，用于临床病毒学研究和病毒感染诊断。
4.药物研发：罗氏荧光定量PCR仪器可以用于药物研发过程中的基因表达分析、药物代谢相关基因的筛选和药物安全性评估等方面，为药物研发提供有力支持。
罗氏rochelc96原理
罗氏rochelc96原理
罗氏基因扩增仪是一种用于进行聚合酶链式反应（PCR）的仪器，其原理与常规PCR仪相似，但可能具有更高的精度、灵敏度和自动化程度。
以下是其基本原理：
一、热循环：罗氏基因扩增仪通过热循环的方式控制温度，使得PCR反应中的不同步骤（变性、退火、延伸）可以在不同的温度下进行。
热循环通常由Peltier热电堆控制，可以快速准确地升降温度。
二、样品定位：罗氏基因扩增仪通常配备有多个样品位，每个样品位可以放置一个反应管或板。
样品定位系统可以确保每个反应管或板被准确放置在相应的温度区域中，以保证PCR反应的准确性和可靠性。
三、自动化控制：罗氏基因扩增仪通常具有自动化控制系统，可以通过预设程序自动执行PCR反应的温度循环、时间控制、温度梯度等参数。
这样可以提高操作的便捷性和重复性，减少操作者的操作失误。
四、检测和分析：一些罗氏基因扩增仪还配备有检测和分析系统，可以实时监测PCR反应的进程，并对反应产物进行定量或定性分析。
这样可以及时评估PCR反应的质量和结果。
总的来说，罗氏基因扩增仪的原理是基于PCR技术，通过精确控制温度、样品定位和自动化控制等功能，实现对PCR反应的快速、准确和可靠的执行，从而满足科研、临床和其他领域对PCR技术的需求。
荧光定量PCR的原理方法及结果分析
荧光定量PCR的原理方法及结果分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的检测DNA或RNA含量的方法，通过测定荧光信号的强度来确定起始模板数量的多少。
其原理主要包括引物的选择、PCR反应的进行、荧光信号的测定以及数据分析等步骤。
首先，荧光定量PCR需要选择适当的引物。
引物的设计要求首先能够特异性地与目标序列结合，这样才能保证只有起始模板被扩增。
引物的长度通常在18-24个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，碱基序列中不能存在太多的重复序列或者分子倒序等结构。
此外，引物的Tm值应该相近，不应过于接近，以免引物发生二次结合。
另外，荧光标记的引物通常采用双探针（dual-labeled probe）和SYBR Green I染料，二者的优缺点各有不同：双探针对应用的目标突变不敏感，但是对于长序列的目标扩增效果较好；SYBR Green I适用于鉴定多个不同基因的扩增，但是对于PCR产物的目标特异性检测较差。
其次，PCR反应的进行是荧光定量PCR的核心步骤。
反应体系通常包括引物、模板DNA、DNA聚合酶、荧光标记剂和反应缓冲液。
PCR反应过程中，首先是变性，将模板DNA的双链分离；然后是退火，使引物与目标序列结合；接着是延伸，DNA聚合酶在适当的温度下进行链延伸。
PCR反应的循环数通常在25-40之间，具体循环数多少需要根据目标序列的长度和浓度来决定。
PCR反应条件的优化要注意引物浓度、PCR温度和时间。
第三，荧光信号的测定是荧光定量PCR中不可或缺的步骤。
通常，荧光信号的测定可以通过荧光实时扩增仪来进行。
在每一个PCR循环过程中，荧光实时扩增仪会记录下PCR反应管中荧光信号的强度。
随着PCR反应的进行，PCR产物的数量也在逐渐增加，荧光信号的强度也会增加。
荧光信号的强度与PCR产物的数量之间存在着一定的线性关系，利用标准曲线可以将荧光信号的强度转化为起始模板的绝对数量。
罗氏实时荧光定量PCR仪课件
02
罗氏实时荧光定量PCR仪 介绍
仪器的基本结构
仪器外观
操作界面
罗氏实时荧光定量PCR仪外观为长方 体，尺寸适中，便于实验室放置。
仪器配备彩色触摸屏，操作界面友好 ，方便用户进行参数设置和实验操作 。
内部结构
仪器内部包括加热模块、光学检测系 统、电脑控制系统等部分，各部分协 同工作完成PCR扩增和荧光检测。
制定仪器的维护保养计划，按照 计划进行保养，保证仪器的正常
运行和使用寿命。
THANKS
感谢观看
通过比较不同样本之间的基因表达数据，可以筛选出差异表达的基 因，进一步研究其在生物学过程中的作用。
基因表达调控机制研究
通过实时监测基因转录水平的变化，有助于深入了解基因表达的调 控机制，为相关疾病的研究和治疗提供线索。
在病毒检测中的应用
1 2 3
病毒载量测定
利用罗氏实时荧光定量PCR仪，可以快速、准确 地测定病毒载量，为临床诊断和治疗提供依据。
02
根据错误提示查找相关资料或联系技术支持解决。
仪器运行结果不准确
03
检查样品是否符合要求，运行程序是否正确，仪器是否经过校
正等。
仪器的保养与校正
定期清洗仪器内部
根据仪器使用情况定期清洗仪器 内部，包括清洗反应管、更换滤
芯等。
校正仪器
定期邀请专业技术人员对仪器进 行校正，确保仪器准确性。
建立维护保养计划
详细记录实验数据，包括荧光信号的 变化、扩增曲线等，并对数据进行整 理和分析。
实验后处理
仪器清洁与保养
数据审核与报告撰写
实验结束据进行审核，撰写详细的实验报 告，包括实验目的、方法、结果和结论等 。
样品处理
罗氏荧光定量
罗氏荧光定量1. 简介罗氏荧光定量是一种常用的生物化学分析技术，用于测定样品中特定物质的含量。
该技术基于罗氏荧光染料与目标物质之间的特异性结合，通过测量荧光信号的强度来计算目标物质的浓度。
2. 原理罗氏荧光定量的原理基于荧光共振能量转移（FRET）现象。
FRET是一种非辐射能量传递的过程，其中一个荧光染料（受体）吸收能量并将其传递给另一个荧光染料（供体），从而引起供体的荧光发射。
在罗氏荧光定量中，供体和受体分别与目标物质的特定结构域结合。
当目标物质存在时，供体和受体之间的距离会发生改变，从而影响FRET的效率。
通过测量供体的荧光强度变化，可以计算目标物质的浓度。
3. 实验步骤3.1 样品准备首先，需要准备样品，样品可以是生物体、细胞、蛋白质等。
样品应根据实验的要求进行处理和处理，以确保准确测量目标物质的浓度。
3.2 罗氏染料标记接下来，需要将罗氏染料标记在样品中的目标物质上。
这可以通过化学反应或特定的结合方式实现。
标记过程需要确保染料与目标物质之间的特异性结合，并且不影响目标物质的功能和性质。
3.3 荧光测量完成标记后，可以进行荧光测量。
通常使用荧光分光光度计或荧光显微镜来测量样品中的荧光强度。
荧光测量需要选择适当的激发波长和发射波长，并根据实验要求进行多次测量以确保结果的准确性。
3.4 数据处理与分析最后，需要进行数据处理和分析。
根据荧光测量结果，可以绘制荧光强度与目标物质浓度之间的标准曲线。
通过与标准曲线的比较，可以计算样品中目标物质的浓度。
4. 应用领域罗氏荧光定量广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
以下是一些常见的应用领域：4.1 蛋白质定量罗氏荧光定量可用于测定蛋白质样品中特定蛋白质的浓度。
这对于研究蛋白质相互作用、酶促反应和蛋白质表达水平的变化非常有用。
4.2 DNA/RNA定量罗氏荧光定量也可以用于测定DNA或RNA样品中的目标序列的浓度。
这对于分子生物学研究、基因表达分析和疾病诊断非常重要。
罗氏荧光定量
罗氏荧光定量
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目录
1.罗氏荧光定量的概述
2.罗氏荧光定量的原理
3.罗氏荧光定量的应用领域
4.罗氏荧光定量的优势与局限性
正文
罗氏荧光定量（Roche Fluorescence Quantification）是一种荧光定量检测技术，广泛应用于生物科学、医学研究和药物研发等领域。
通过对荧光信号的定量检测，可实现对生物分子的数量、活性和其他特性的准确分析。
罗氏荧光定量的原理是基于荧光信号的强度与生物分子的数量成正比。
当荧光标记的生物分子与待测样本中的目标分子结合时，荧光信号的强度会发生变化。
通过检测荧光信号的强度，可以推算出目标分子的数量。
这种方法具有高灵敏度、高特异性和高重复性等优点，有利于实现对生物分子的精确定量。
罗氏荧光定量技术在多个应用领域发挥着重要作用。
在生物科学研究中，该技术可用于检测基因表达、蛋白质表达和细胞因子等生物分子的数量。
在医学研究中，罗氏荧光定量技术可以用于疾病标志物的检测和疾病进展的监测。
在药物研发领域，该技术可用于评估药物的作用机制、药效和毒性等。
尽管罗氏荧光定量技术具有众多优势，但仍存在一定的局限性。
例如，荧光标记的生物分子可能会发生褪色或降解，影响检测结果的准确性。
此外，荧光定量检测受到荧光波长、荧光强度和检测时间等因素的影响，需要进行严格的质量控制和数据处理。
总之，罗氏荧光定量技术是一种具有广泛应用前景的荧光定量检测方法。
荧光定量PCR仪技术原理(罗氏)
5’
10
5
定量PCR原理
染料检测-SYBR Green I
Excitation
5’ 3’
SG SG
Emission
SG SG SG
3’ 5’
Roche Applied Science
11
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
Roche Applied Science
N： N0： N： E： 扩增产物量; 启始模板量; 循环数; 扩增效率 (0 E1)
log(1+E)n+logN0 -nlog(1+E) +logN
logN0=
Cp =n = －logN0/log(1+E) +logN/log(1+E) (Y=kX+b )
பைடு நூலகம்
结论：Cp值与模板起始浓度的负对数成线性关系
31
绝对定量：含内参照和标准品（ 双色检测）
Roche Applied Science
32
16
绝对定量（含内参照和标准品）-Summary
•
先决条件: 标准品是有已知浓度的目的基因 标准品与样本具有相同的PCR扩增效率
• 特别应用领域: Bacteriology, Virology • 优点: 结果可通过 LightCycler Software 3.53软件快速分析 可以质控PCR抑制剂的存在 (可靠的绝对定量值) • 局限性: 动力学范围较低 (approx. 3-5 magnitudes) 须使用双光检测（Hybridization Probe format ） 无法区分影响PCR扩增效率的因子？
荧光定量pcr的原理
荧光定量pcr的原理荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测DNA的技术，它结合了PCR和荧光探针技术，可以快速、高效地定量检测DNA样本。
荧光定量PCR的原理主要包括PCR扩增、荧光信号检测和数据分析三个部分。
首先，PCR扩增是荧光定量PCR的基础。
PCR是一种体外扩增DNA的技术，通过反复的热循环使得DNA序列得以扩增。
在荧光定量PCR中，扩增反应中加入了荧光标记的引物和探针，当PCR反应进行到特定的温度时，探针与目标DNA结合，导致荧光信号的释放。
PCR扩增的循环次数越多，荧光信号累积的越多，从而可以定量检测目标DNA的含量。
其次，荧光信号检测是荧光定量PCR的关键步骤。
在PCR扩增过程中，荧光信号会随着DNA的扩增而不断累积。
荧光信号的检测可以通过实时荧光定量PCR仪器来完成，这些仪器可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号强度，并将其转化为荧光信号曲线。
通过监测荧光信号曲线的变化，可以准确地测定目标DNA的含量。
最后，数据分析是荧光定量PCR的最后一步。
通过实时荧光定量PCR仪器获取的荧光信号曲线，可以通过计算机软件进行数据分析。
软件可以根据标准曲线和样本曲线的荧光信号强度来计算目标DNA的含量，从而实现对目标DNA的定量检测。
总的来说，荧光定量PCR的原理是通过PCR扩增、荧光信号检测和数据分析三个步骤来实现对目标DNA的定量检测。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，被广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变分析等领域。
希望通过本文的介绍，读者能够对荧光定量PCR的原理有一个清晰的了解，并能够在实验中正确应用这一技术。
荧光定量pcr的原理和过程
荧光定量pcr的原理和过程荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于PCR技术的改进方法，通过引入荧光探针来实现对PCR反应的实时监测和定量分析。
荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变检测等领域，具有高灵敏度、高特异性、高准确性等优势。
荧光定量PCR的原理基本与传统PCR相同，都是通过不断复制DNA片段来扩增目标序列。
但是，荧光定量PCR在PCR反应体系中加入了特异性的荧光探针，这种探针能够与目标序列特异性结合，并在PCR反应过程中发出荧光信号。
通过实时监测荧光信号的强度，可以准确地定量PCR反应中的目标序列数量。
荧光定量PCR的过程主要包括：样品制备、引物设计、反应体系配置、PCR扩增、荧光信号检测和数据分析等步骤。
首先，样品制备是荧光定量PCR的第一步。
样品可以是DNA、RNA或cDNA等，需要根据实验的目的选择合适的样品类型，并进行样品提取和纯化。
接下来，引物设计是荧光定量PCR的关键步骤之一。
引物是用于扩增目标序列的短DNA片段，通常由两个引物组成：前向引物和反向引物。
引物的设计需要根据目标序列的特点，如长度、GC含量、特异性等进行合理选择，并使用生物信息学工具进行引物序列的合成。
然后，反应体系配置是荧光定量PCR的另一个重要步骤。
反应体系通常包括模板DNA、引物、荧光探针、核苷酸三磷酸（dNTPs）、聚合酶和缓冲液等组分。
其中，荧光探针是荧光定量PCR的关键组分，它通常由荧光染料和荧光信号抑制剂构成。
荧光染料可以与目标序列特异性结合，并在PCR反应过程中发出荧光信号；而荧光信号抑制剂可以抑制未结合的荧光染料发出的背景信号。
接着，进行PCR扩增。
PCR扩增是通过不断循环进行三个温度阶段的反应来扩增目标序列。
首先是变性阶段，将反应体系中的DNA变性为单链DNA；然后是退火阶段，使前向引物和反向引物与目标序列特异性结合；最后是延伸阶段，聚合酶在适当温度下将dNTPs加入到引物结合的DNA链上，从而合成新的DNA链。
罗氏实时荧光定量PCR仪分解课件
实时荧光定量PCR技术的原理
实时荧光定量PCR技术基于PCR扩增 过程中荧光信号的变化进行监测。
荧光信号的强度与DNA片段的扩增量 成正比，因此可以通过实时监测荧光 信号的变化来反映DNA片段的扩增量 。
技术发展面临的挑战与机遇
技术更新换代
临床应用需求
随着新技术的不断涌现，实时荧光定量PCR 技术面临着被替代和淘汰的风险，需要不 断更新和完善。
临床应用对实时荧光定量PCR技术的需求不 断增长，同时也对其准确性和可靠性提出 了更高的要求。
科研领域需求
技术创新与合作
科研领域对实时荧光定量PCR技术的需求也 在不断增加，需要不断提高其检测的灵敏 度和特异性。
记录仪器使用情况
每天记录仪器的使用情况 ，包括样品数量、运行时 间等，以便于跟踪仪器性 能和保养计划。
仪器的定期保养
清洁仪器内部
按照制造商的推荐，定期对仪器 内部进行清洁，确保光学系统和 加热模块等关键部件不受污染。
检查仪器性能
定期对仪器进行校准和性能测试， 确保其准确性和可靠性。
更换消耗品
根据需要，定期更换消耗品，如滤 芯、密封圈等，以确保仪器正常运 行。
常见故障的排除与处理
样品检测异常
如果样品检测结果异常，可能需 要对仪器进行校准或检查样品制
备过程。
仪器无法启动
如果仪器无法启动，可能需要进 行电源检查或联系制造商的技术
支持。
加热模块故障
如果加热模块出现故障，可能需 要更换加热模块或联系制造商的
荧光定量pcr仪工作原理
荧光定量pcr仪工作原理哎呀，说到荧光定量PCR仪，这玩意儿可真是实验室里的大明星。
你别看它就那么小小的一台机器，它可干着大活儿呢。
想当初，我第一次见到这家伙的时候，我还以为它是个什么高级的微波炉呢，结果一问才知道，这玩意儿是用来检测DNA的。
话说回来，这荧光定量PCR仪的原理，其实说起来也不是特别复杂，但要真把它讲得通俗易懂，那可得费点功夫。
首先，你得知道，DNA这玩意儿，就像一本大书，里面记录了所有生命的信息。
而PCR，就是聚合酶链反应，它能让这本大书里的某一页，也就是特定的DNA片段，复制复制再复制，直到我们能看得见它。
荧光定量PCR仪呢，就是在PCR的基础上，加上了荧光这玩意儿。
想象一下，你把DNA片段想象成一张张纸，然后你用荧光笔在这些纸上做标记。
每次复制的时候，这些标记就会发光，而且发光的强度和DNA 的数量成正比。
这样，通过测量发光的强度，我们就能知道有多少DNA 片段被复制出来了。
具体操作起来，那可真是个技术活儿。
首先，你得把样本准备好，然后加入一系列的反应混合物，包括DNA聚合酶、引物和荧光探针。
引物就像是一把钥匙，能精确地找到你想要复制的DNA片段。
荧光探针呢，就像是个小侦探，专门去捕捉那些复制出来的DNA片段。
接下来，就是把这一堆混合物放进PCR仪里，设定好温度和时间，然后就开始循环了。
这个循环，就像是在煮一锅汤，一会儿高温，一会儿低温，让DNA片段不断地复制复制再复制。
每次循环，荧光探针就会捕捉到更多的DNA片段，然后发出更亮的光。
最后，当你看到荧光信号越来越强，那就说明DNA片段越来越多，你的实验也就成功了。
这时候，你就能通过分析这些数据，得到你想要的结果了。
记得有一次，我在实验室里做实验，结果机器出了点问题，荧光信号一直上不去。
我当时那个急啊，心想这可怎么办，我这实验还做不做了。
后来，还是我们实验室的老师傅出手，三下五除二就把问题解决了。
从那以后，我对这荧光定量PCR仪真是又爱又恨，它就像是个调皮的孩子，有时候让你头疼，但有时候又给你带来惊喜。
荧光定量pcr实验原理与应用
荧光定量pcr实验原理与应用荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于PCR技术的一种变种，它利用荧光探针实现对PCR产物的定量检测。
荧光定量PCR结合了PCR扩增和实时荧光检测技术，能够快速、准确地检测目标DNA的含量。
本文将介绍荧光定量PCR的原理及其在科研和临床应用中的重要性。
一、荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的原理基本与常规PCR相似，也包括三个步骤：变性、退火和延伸。
其区别在于，在PCR反应体系中加入了含有荧光素的探针，这些探针与目标DNA序列特异性结合，并在PCR反应中被DNA聚合酶酶切，导致荧光信号的释放。
在PCR反应进行过程中，荧光信号与PCR产物量成正比，通过检测荧光信号的强度，可以实时监测PCR反应的进程，从而实现对目标DNA的定量检测。
荧光定量PCR可以通过不同的荧光探针来检测多个靶标，实现多重PCR检测。
二、荧光定量PCR的应用1. 病原微生物检测：荧光定量PCR广泛应用于病原微生物的检测，包括细菌、病毒、真菌等。
通过荧光定量PCR技术，可以实现对微生物的快速、准确的检测，有助于早期诊断和治疗。
2. 癌症诊断：荧光定量PCR可用于癌症早期筛查和诊断。
通过检测癌基因的表达水平，可以帮助医生判断肿瘤的类型、分级和预后，指导个体化治疗方案。
3. 遗传病检测：荧光定量PCR可用于遗传病的基因检测。
通过对患者DNA样本进行荧光定量PCR分析，可以准确检测遗传突变，帮助家庭规划和遗传咨询。
4. 食品安全监测：荧光定量PCR可以用于食品中致病微生物和转基因成分的检测。
通过对食品样品中目标DNA的定量检测，可以确保食品安全，保障公众健康。
5. 环境微生物监测：荧光定量PCR可用于环境微生物的监测和鉴定。
通过对环境样品中微生物的定量检测，可以了解微生物种类和数量，指导环境保护和生态恢复工作。
荧光定量PCR作为一种高灵敏、高特异性的分子生物学技术，在医学、生物学、食品安全和环境科学等领域发挥着重要作用。
00 荧光定量PCR原理_201311
荧光定量PCR技术原理罗氏诊断产品（上海）有限公司主要内容•荧光定量PCR与普通PCR的区别•荧光定量PCR仪器的选择•绝对定量和相对定量原理2PCR原理3实时荧光定量PCR技术典型PCR扩增曲线•在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线4Ct值与起始模板的关系N=N0×E n，logN=log N0 +nlogE n=CtCt值与起始模板的关系研究表明：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。
起始拷贝数越多，要达到域值所需得循环数越少，即Ct值越小。
5主要内容•荧光定量PCR与普通PCR的区别•荧光定量PCR仪器的选择•绝对定量和相对定量原理7罗氏诊断与PCR技术的渊源•1985 Kary Mullis 发明了PCR技术•1991 Roche公司获得全球PCR专利权•1993 Roche公司的科学家Russell Higuchi发明全球第一台实时定量PCR仪•1993 Kary Mullis 因发明PCR技术而获得诺贝尔化学奖•1995 Roche公司推出COBAS Amplicor™病毒载量分析仪，目前是诊断行业PCR定量的金标准，唯一获得美国FDA认证的定量PCR仪•2001 Roche公司获得Real-time PCR专利和TaqMan技术专利•2007 基因扫描分析功能整合至qPCR平台，科学研究领域大大扩展8•目前，罗氏诊断公司拥有PCR相关专利上千项，占全球PCR专利90%以上。
9qPCR仪三大核心模块1.温控系统：PCR仪2.光学系统：光源及检测设备3.控制系统：计算机及软件实时荧光定量PCR 仪构造原理光源控制系统温控系统光学系统1019982005200920112012The Roche LightCycler ® Story14 年持之以恒的创新LightCycler ® 1536 1,536 samplesLightCycler ® Nano 32 samplesLightCycler ® 48096 or 384 samplesLightCycler ® Carousel 32 samplesLightCycler ® 9696 samples首创卡盘式引入高能氙灯与Therma-Base首创1536超高通量最小最安静的qPCR 仪器白色固态光源独立光纤导光主要内容•罗氏整体解决方案•罗氏与PCR技术的渊源•LightCycler 96的创新设计•温控系统•光学系统•仪器性能•荧光定量PCR技术平台的功能开发1112•广受好评的银质温控模块•温控均一性 Tm: ± 0.2ºC•支持高精度基因分型三好一快 – 温控好银质模块+ 20%LightCycler 96 Smart快速和LC480 一脉相承的银质半导体加热模块40分钟内完成40个循环扩增加热速率: 4.4 °C/sec降温速率: 2.2 °C/sec1315光密度不均一由于存在光程差,激发光从顶部发出到达每孔的强度不一样，中心强度高于边缘，需要加入内参照来校正典型的96孔板式顶部光路系统卤素灯CCD16三好一快 – 光路设计好独立光纤导光，首次彻底消除光学边缘效应**Patent submitted▪ 2 x 96 根独立光纤，各自对应激发与检测▪全新光学系统的特点▪所有样本的光路等长，不存在其他仪器中心亮，两边暗的现象▪激发光直接垂直照射所有样本孔的中心部位，不存在折射角与偏差▪无需被动染料校正 (ROX)▪全新设计带来最高的检测均一性发射光激发光固态光源亮度超过氙灯，兼容所有荧光染料，寿命为10000小时光效 lm/W50 lm/W70 lm/W 85 lm/W100 lm/W150 lm/W氙灯卤钨灯Year蓝色LED 白色固态光源三好一快 – 光路设计好独立光纤导光，首次彻底消除光学边缘效应*白光LED光效高，显色好，寿命长卤钨灯光效低，显色较好，寿命短蓝光LED光效低，显色弱，寿命长综合各项指标，白光LED 是当今实时荧光PCR光源的最佳选择各类光源的性能比较灵活的应用设计–应有尽有最全面的检测模式！！绝对定量梯度PCR相对定量终点法基因分型高分辨率熔解曲线 (HRM)*AT AATT灵活的应用设计–应有尽有细节决定成败！！▪设计紧凑，无需连接电脑▪支持梯度PCR▪试剂耗材开放▪新颖的数据导出方式▪4重PCR，无需颜色补偿16 in.16 in.21 in.22主要内容•荧光定量PCR与普通PCR的区别•荧光定量PCR仪器的选择•绝对定量和相对定量原理23绝对定量的应用•病毒和病原菌定量分析•转基因动植物转基因拷贝数的检测•GMO定量检测24C r o s s i n g P o i n t (C y c l e s )log (copy number)l o g (F 2/F 1)l o g (F 2/F 1)Roc he M ol e c ul ar Bi oc he m i c al sD i a g n o s t i c sLi ght C ycl er 的定量原理标准曲线(外标准或内标准)未知标本C r o s s i n g P o i n t (C y c l e s )l og (copy num ber )nl o g (F 2/F 1)nl o g (F 2/F 1)Tar get3826•序列:尽可能与目的基因序列相同（同样的扩增子/GC 含量），以保证扩增效率相同。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于分子生物学的实验技术，可以对DNA或RNA目标序列进行定量分析。
本文将介绍荧光定量PCR的原理和结果分析，包括实验步骤、PCR曲线的解读以及测定目标序列的相对表达水平等。
一、荧光定量PCR的原理荧光定量PCR技术主要基于PCR的原理，即通过模板DNA的逐渐扩增，来定量分析起始模板DNA或RNA的数量。
在实验中，荧光定量PCR通常使用DNA合成酶来合成目标序列的拷贝，通过在每个扩增周期后测量荧光信号的变化，来定量反应的进程。
1.准备试剂和反应体系：包括引物、合成的目标序列等。
2.PCR反应：在热循环PCR仪中，通过一系列不同温度的循环，使模板DNA的扩增合成逐渐发生。
3.荧光信号检测：通过在每个循环后侦测荧光信号的变化，来定量PCR反应的进程和模板DNA的数量。
4.数据分析：通过荧光信号的变化来计算模板DNA或RNA的相对表达水平。
二、荧光定量PCR结果分析1.PCR曲线的解读在荧光定量PCR反应中，通常会绘制荧光信号与PCR循环数的关系图即PCR曲线。
根据PCR曲线的形状，可以得到以下几个关键结果：(1)阈值循环数（Ct）：阈值循环数是PCR曲线上荧光信号超过背景信号的循环数。
Ct值越小，目标序列的初始模板数量越多。
(2) 扩增效率（Efficiency）：扩增效率可以通过计算PCR曲线斜率的反向值得到，通常表达为百分比。
扩增效率越高，说明PCR反应的有效性越好。
(3)Ct值偏移：Ct值偏移是指实验组与对照组（如阴性对照或基准组）之间的Ct值差异。
Ct值偏移的大小可以用于计算相对表达水平。
2.相对表达水平的测定相对表达水平是指在不同实验条件下，目标序列在不同组织或细胞中的表达量相对比较和定量分析。
常用的计算方法有：(1)∆∆Ct法：通过计算实验组与对照组的相对Ct值差异来获得相对表达水平。
∆∆Ct值越大，目标序列的表达水平差异越明显。
荧光定量pcrlightcycler 480ii 技术参数
荧光定量pcrlightcycler 480ii 技术参数全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：荧光定量PCR技术是一种用于检测DNA或RNA含量的方法，其通过荧光信号的变化来定量检测目标分子的数量。
LightCycler 480II是一款高性能的荧光定量PCR仪器，具有快速、灵敏和高通量的特点，适用于各种科研和临床领域的实验。
LightCycler 480II具有多种技术参数，下面分别介绍：1. 快速反应：LightCycler 480II具有优化的发热和降温速度，整个PCR过程只需要几十分钟就能完成，大大提高了实验效率。
2. 高通量：LightCycler 480II支持96孔和384孔板，可同时进行多个样品的PCR反应，适用于高通量实验。
3. 高灵敏度：LightCycler 480II的检测灵敏度可达到单个分子水平，可以检测到极微量的目标序列。
6. 灵活的控制软件：LightCycler 480II配备了功能强大的数据分析软件，可实现实时监测、自动分析和结果导出，为用户提供便利。
LightCycler 480II是一款功能强大的荧光定量PCR仪器，具有快速、灵敏、高通量和多功能的特点，适用于各种科研和临床领域的实验。
通过合理使用LightCycler 480II，科研人员和临床医生可快速、准确地进行目标序列的定量检测，为科研和诊断提供强有力的支持。
【注：此文章为人工智能助手撰写的作品，仅供参考。
】第二篇示例：荧光定量PCR技术是一种高灵敏度和高特异性的分子生物学技术，可以用于检测和定量DNA或RNA的数量。
荧光定量PCR的原理是通过PCR反应产生的双链DNA结合荧光探针来实现对特定序列的定量检测。
而LightCycler 480 II是罗氏公司推出的一款高端荧光定量PCR仪器，具有高速、高灵敏和高通量的特点，被广泛应用于科研和临床领域。
一、仪器参数1.1 光源：LightCycler 480 II采用的是白色长寿命LED光源，可提供高强度的荧光激发1.2 探测：支持FAM、JOE、ROX、Cy5等多种荧光探针，适用于多通道荧光检测1.3 温度范围：可设定反应温度范围为4-99°C，满足不同引物的PCR检测需求1.4 可视化：配备有高分辨率的液晶触摸屏，实时显示PCR过程和结果，操作简便直观1.5 通量：支持96孔和384孔板，可满足不同规模的实验需求，提高实验效率1.6 数据分析：内置的分析软件可自动生成PCR曲线、计算Ct值和扩增因子，方便数据处理1.7 软件更新：可通过网络连接实现软件升级，保持仪器性能和功能的最新状态二、技术优势2.1 高灵敏度：LightCycler 480 II具有极高的灵敏度，可实现对低拷贝数目标的定量检测，适用于稀有基因的研究2.2 高特异性：荧光探针结合PCR技术，能够区分特异性序列，避免非特异扩增和干扰2.3 高速度：LED光源和快速温度控制系统，可缩短PCR反应时间，提高实验效率2.4 高通量：支持大规模的样本检测和多通道荧光检测，可实现高通量实验2.5 数据可靠性：系统自动调整反应条件，减少人为误差，确保数据的准确性和可靠性2.6 多样性：支持不同引物和探针的应用，适用于各种PCR实验设计和研究需求2.7 自动化：仪器操作简便，支持自动化实验流程，减少人工干预，提高实验一致性三、应用领域3.1 基因表达分析：荧光定量PCR可用于检测基因的表达水平和变化，研究基因功能和调控机制3.2 病原体检测：可以用于检测病原体的种类和数量，诊断传染病和病原体感染3.3 药物筛选：可用于快速筛选药物的效果和剂量，评估药物的毒性和疗效3.4 生物标记物检测：可通过检测生物标记物的浓度和变化，评估疾病风险和预后3.5 遗传研究：可用于研究基因突变和遗传变异，揭示遗传疾病的发病机制和遗传规律3.6 食品安全检测：可用于检测食品中的潜在病原体和有害物质，保障食品安全和质量第三篇示例：LightCycler 480II具有快速的反应时间。
罗氏荧光定量pcr
罗氏荧光定量 PCR 是一种高灵敏度、高精确度的多重荧光定量 PCR 技术，可以用于定量检测 DNA 或 RNA 中的特定序列。
该技术不仅可以用于基础研究，还可以应用于临床诊断和药物研发等领域。
一、基本原理罗氏荧光定量 PCR 基于 PCR 扩增技术，在 PCR 反应过程中，使用荧光标记的探针来定量检测扩增产物的数量。
该技术采用两个荧光染料：SYBR Green 和 TaqMan 探针。
SYBR Green 是一种结合双链 DNA 的荧光染料，可以在 PCR 反应过程中不断累积，并发出荧光信号；而 TaqMan 探针是一种在 PCR 反应过程中被水解释放的荧光探针，可以在特异性结合目标序列后发出荧光信号。
通过测量这些荧光信号的强度，可以确定 PCR 反应产物的数量。
二、实验步骤1. 样品制备首先需要从样品中提取出目标 DNA 或 RNA，常用的提取方法包括酚-氯仿提取法、磁珠法等。
提取后需要进行纯化和定量，确保样品质量和浓度符合要求。
2. PCR 反应将样品DNA 或RNA 与特异性引物、荧光探针和PCR Master Mix 混合，加入 PCR 反应管中，进行 PCR 扩增反应。
PCR 扩增条件需根据具体引物和模板 DNA/RNA 来确定，一般包括以下步骤：(1) 热变性：将反应体系加热至 95℃，使 DNA/RNA 双链分离为单链。
(2) 退火：将反应体系降温至引物的退火温度，使引物与模板DNA/RNA 特异性结合。
(3) 延伸：利用DNA/RNA 聚合酶将引物延伸，合成新的DNA 单链。
(4) 荧光检测：在延伸过程中，荧光探针与目标序列特异性结合，发出荧光信号。
荧光信号的强度与产物数量成正比，可以通过检测荧光信号来定量 PCR 扩增产物。
3. 数据分析利用荧光数据分析软件对荧光信号进行分析，得出 PCR 扩增产物的数量。
根据标准曲线，可以将荧光信号转化为目标序列的数量，从而定量检测样品中的目标 DNA 或 RNA。
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19
PCR 定量方法
绝对定量模式
相对定量模式
外标准 (单色检测)
外标准 含内参照 (双色检测)
校准品校准
外标准 (无校准品)
无扩增效率校正
有扩增效率校正
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20
10
实时荧光定量PCR的原理公式
N＝N02n=N0(1+E)n logN=
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21
绝对定量原理（标准曲线）
Target
未知标本
未知标本
log (F2/F1) log (F2/F1)
n
Crossing Point (Cycles) Crossing Point (Cycles)
标准曲线 (外标准或内标准)
标准曲线 (外标准或内标准)
log (F2/F1) log (F2/F1)
E = 1.90 n = 30
N = N0 x (1.90)30 = N0 x 2.3 x 108
N : number of amplified molecules N0 : initial number of molecules
n : number of amplification cycles E : amplification efficiency
5’
10
5
定量PCR原理
染料检测-SYBR Green I
Excitation
5’ 3’
SG SG
Emission
SG SG SG
3’ 5’
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11
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
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2
1
Target Amplification
No. of Cycles No. Amplicon Copies of Target
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
1 2 3 4 5
2 4 8 16 32 64 1,048,576 1,073,741,824
绝对和相对定量困难(相对于看家 不仅可以相对定量，还可以绝 基因的定量复杂) 对定量
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5
Cp(Crossing point) or Ct (Cycler threshold)： Cp值，
指样本在PCR过程中其反应液荧光信号增加到超过其 本底荧光时所需要的循环数。
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14
PCR 定量原理
绝对定量模式
相对定量模式
外标准 (单色检测)
外标准 含内参照 (双色检测)
校准品校准
外标准 (无校准品)
无扩增效率校正
有扩增效率校正
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LightCycler 双色检测
原理:
2 对杂交探针 第一对探针标记Fluorescein/LC Red 640 第二对探针标记Fluorescein/LC Red 705
Efficiency depends on:
- 引物 - 片段长度
- 序列(GC)
- 模板纯度
- RT Primer 与 PCR Primer的间距
(RT-Applications)
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23
定量－扩增效率的影响
n = 30 E = 1.95
N = N0 x (1.95)30 = N0 x 5.0 x 108 2.2-fold difference
31
绝对定量：含内参照和标准品（ 双色检测）
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32
16
绝对定量（含内参照和标准品）-Summary
•
先决条件: 标准品是有已知浓度的目的基因 标准品与样本具有相同的PCR扩增效率
• 特别应用领域: Bacteriology, Virology • 优点: 结果可通过 LightCycler Software 3.53软件快速分析 可以质控PCR抑制剂的存在 (可靠的绝对定量值) • 局限性: 动力学范围较低 (approx. 3-5 magnitudes) 须使用双光检测（Hybridization Probe format ） 无法区分影响PCR扩增效率的因子？
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25
绝对定量－标准品的准备
纯度: - 要求不含有核苷，引物及盐等干扰PCR的因素，使用 High Pure PCR Product Purification Kit 或MagNAPure LC
浓度： - 测量260nm的吸光度
- 调整模板工作浓度使得加入体积 2 µl 以减少移液误差 处理: - 使用硅化的试管，防气溶胶的无菌枪头 - 对于低浓度模板可加入沉降核酸(e.g., tRNA, 10 ng/µl) - 分装保存 -20°C (DNA) or -70°C (RNA) Roche Appliedry
•
先决条件
已知的标准品浓度 外标准品与样品有相同的 PCR-扩增效率 • 典型应用的领域: 细菌学，病毒学 • 优点: 动态范围广 (10 -1010 copies) 结果可通过 LightCycler 软件快速分析 检测模式灵活（SYBR Green， 水解探针，杂交探针） • 方法的局限性： 对PCR抑制剂及其他因子对PCR的影响未知
PCR与荧光定量PCR区别 荧光定量PCR的检测模式 荧光定量PCR的定量分析 荧光定量PCR的溶解曲线分析
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9
定量PCR原理
染料检测-SYBR Green I
SG SG SG
5’
Emission Excitation
SG SG
3’
3’
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26
13
绝对定量－标准曲线制作
使用至少3个点，最好5个点 对于中等浓度和高浓度，每个稀释度需要一个位点 对于在一个局限的检测范围内的定量，使用两次重复甚至三次重复 制备标准曲线时，使用的稀释系列最好每个梯度选一个点 (e.g., 1:10, 1:100, 1:1000, ...)
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优势: 同时检测2个独立的靶目标序列 应用: 多重 PCR，对多个靶目标同时进行突变分析
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30
15
绝对定量：含内参照和标准品（ 双色检测）
标准品
目的基因（标记 LC Red 640） 内参照（标记 LC Red 705）
未知标本 (26)
阴性对照
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17
主要内容
PCR与荧光定量PCR区别 荧光定量PCR的检测模式 荧光定量PCR的定量分析 荧光定量PCR的溶解曲线分析
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18
9
LightCycler 在科研方面的应用
定量分析
基因分型（SNP）
产物性质分析
log (copy number)
n
log (copy number)
38
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22
Roche Molecular Biochemicals
Diagnostics
LightCycler的定量原理
11
定量的先决条件
EfficiencyStandard = EfficiencySample
7
Ct值与起始模板的关系
N=N0×E n，logN=log N0 +nlogE n=Ct
Ct值与起始模板的关系研究表明：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数 存在线性关系。起始拷贝数越多，要达到域值所需得循环数越少，即Ct值越小。
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8
4
主要内容
N： N0： N： E： 扩增产物量; 启始模板量; 循环数; 扩增效率 (0 E1)
log(1+E)n+logN0 -nlog(1+E) +logN
logN0=
Cp =n = －logN0/log(1+E) +logN/log(1+E) (Y=kX+b )
结论：Cp值与模板起始浓度的负对数成线性关系
荧光定量PCR技术原理
罗氏诊断产品（上海）有限公司 广州办事处 应用科学\分子诊断部 应用专员 胡旭霞 Xu_xia.hu@
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1
主要内容
PCR与荧光定量PCR区别 荧光定量PCR的检测模式 荧光定量PCR的定量分析 荧光定量PCR的溶解曲线分析
12
6
定量PCR原理
探针检测-水解探针
5’ 5’ 3’
Excitation Excitation R
R R
3’ 3’ 5’
R
Q Q Q Q
3’
5’
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13
杂交探针（HybProbe）
Oligo 1: Fluorescein Transfer