荧光定量PCR仪技术原理(罗氏)

PCR与荧光定量PCR区别 荧光定量PCR的检测模式 荧光定量PCR的定量分析 荧光定量PCR的溶解曲线分析
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9
定量PCR原理
染料检测-SYBR Green I
SG SG SG
5’
Emission Excitation
SG SG
3’
3’
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R Q
复性阶段: 单探针与互补模板结合后，报告基团的荧光强度增加
R primer 3‘ Q 3‘-p 5‘
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R
R
5‘ 5‘
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R = Reporter (Fluorescein) Q = Quencher
3‘-p
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8
各种荧光PCR方法的特点

SYBR Green I染料法：通用性好，灵敏度高，只要在普通PCR 反应体系中加入荧光染料，稍优化即可，可通过做溶解曲线来 分析扩增产物的成分；特异性差，模板起始浓度不同，本底信 号也不同，适合进行定性检测。 HybProbe探针：特异性好，扩增效率高，并且可通过做溶解曲 线来分析突变和基因分型；通用性不好。适合定性、定量以及 基因分型（SNP分析）。 TaqMan探针：特异性好，不能做溶解曲线分析；通用性不好， 扩增效率因水解作用受影响，信号的产生不依赖于特定的温度 ，5‘-3’外切酶活力难测定。无法直接进行溶解曲线分析，适合 定性、定量分析。 SimpleProbe探针：特异性好，扩增效率高，荧光强度不高， 适合做溶解曲线来分析点突变和基因分型。
绝对和相对定量困难(相对于看家 不仅可以相对定量，还可以绝 基因的定量复杂) 对定量
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5
Cp(Crossing point) or Ct (Cycler threshold)： Cp值，
指样本在PCR过程中其反应液荧光信号增加到超过其 本底荧光时所需要的循环数。
7
Ct值与起始模板的关系
N=N0×E n，logN=log N0 +nlogE n=Ct
Ct值与起始模板的关系研究表明：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数 存在线性关系。起始拷贝数越多，要达到域值所需得循环数越少，即Ct值越小。
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8
4
主要内容

荧光定量PCR技术原理
罗氏诊断产品（上海）有限公司 广州办事处 应用科学\分子诊断部 应用专员 胡旭霞 Xu_xia.hu@roche.com www.roche-applied-science.com
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1
主要内容

PCR与荧光定量PCR区别 荧光定量PCR的检测模式 荧光定量PCR的定量分析 荧光定量PCR的溶解曲线分析
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PCR 定量方法
绝对定量模式
相对定量模式
外标准 (单色检测)
外标准 含内参照 (双色检测)
校准品校准
外标准 (无校准品)
无扩增效率校正
有扩增效率校正
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10
实时荧光定量PCR的原理公式
N＝N02n=N0(1+E)n logN=
log (copy number)
n
log (copy number)
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Roche Molecular Biochemicals
Diagnostics
LightCycler的定量原理
11
定量的先决条件
EfficiencyStandard = EfficiencySample
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2
1
Target Amplification
No. of Cycles No. Amplicon Copies of Target
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
1 2 3 4 5
2 4 8 16 32 64 1,048,576 1,073,741,824
N： N0： N： E： 扩增产物量; 启始模板量; 循环数; 扩增效率 (0 E1)
log(1+E)n+logN0 -nlog(1+E) +logN
logN0=

Cp =n = －logN0/log(1+E) +logN/log(1+E) (Y=kX+b )
结论：Cp值与模板起始浓度的负对数成线性关系
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绝对定量－标准品的准备

纯度: - 要求不含有核苷，引物及盐等干扰PCR的因素，使用 High Pure PCR Product Purification Kit 或MagNAPure LC

浓度： - 测量260nm的吸光度
- 调整模板工作浓度使得加入体积 2 µl 以减少移液误差 处理: - 使用硅化的试管，防气溶胶的无菌枪头 - 对于低浓度模板可加入沉降核酸(e.g., tRNA, 10 ng/µl) - 分装保存 -20°C (DNA) or -70°C (RNA) Roche Applied Science
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绝对定量（标准曲线）－Summary
•
先决条件
已知的标准品浓度 外标准品与样品有相同的 PCR-扩增效率 • 典型应用的领域: 细菌学，病毒学 • 优点: 动态范围广 (10 -1010 copies) 结果可通过 LightCycler 软件快速分析 检测模式灵活（SYBR Green， 水解探针，杂交探针） • 方法的局限性： 对PCR抑制剂及其他因子对PCR的影响未知



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主要内容

PCR与荧光定量PCR区别 荧光定量PCR的检测模式 荧光定量PCR的定量分析 荧光定量PCR的溶解曲线分析
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LightCycler 在科研方面的应用
定量分析
基因分型（SNP）
产物性质分析
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绝对定量：含内参照和标准品（ 双色检测）
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16
绝对定量（含内参照和标准品）-Summary
•
先决条件: 标准品是有已知浓度的目的基因 标准品与样本具有相同的PCR扩增效率
• 特别应用领域: Bacteriology, Virology • 优点: 结果可通过 LightCycler Software 3.53软件快速分析 可以质控PCR抑制剂的存在 (可靠的绝对定量值) • 局限性: 动力学范围较低 (approx. 3-5 magnitudes) 须使用双光检测（Hybridization Probe format ） 无法区分影响PCR扩增效率的因子？
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PCR 定量原理
绝对定量模式
相对定量模式
外标准 (单色检测)
外标准 含内参照 (双色检测)
校准品校准
外标准 (无校准品)
无扩增效率校正
有扩增效率校正
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LightCycler 双色检测
原理:
2 对杂交探针 第一对探针标记Fluorescein/LC Red 640 第二对探针标记Fluorescein/LC Red 705
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
6 20 30
7 cycle = 128 Amplicon
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3
实 时 荧 光定量PCR技术
指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积
5’
10
5
定量PCR原理
染料检测-SYBR Green I
Excitation
5’ 3’
SG SG
Emission
SG SG SG
3’ 5’
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11
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
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Efficiency depends on:
- 引物 - 片段长度
- 序列(GC)
- 模板纯度
- RT Primer 与 PCR Primer的间距
(RT-Applications)
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定量－扩增效率的影响
n = 30 E = 1.95
N = N0 x (1.95)30 = N0 x 5.0 x 108 2.2-fold difference
26
13
绝对定量－标准曲线制作

使用至少3个点，最好5个点 对于中等浓度和高浓度，每个稀释度需要一个位点 对于在一个局限的检测范围内的定量，使用两次重复甚至三次重复 制备标准曲线时，使用的稀释系列最好每个梯度选一个点 (e.g., 1:10, 1:100, 1:1000, ...)
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12
6
定量PCR原理
探针检测-水解探针
5’ 5’ 3’
Excitation Excitation R
R R
3’ 3’ 5’
R
Q Q Q Q
3’
5’
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杂交探针（HybProbe）
Oligo 1: Fluorescein Transfer
Oligo 2: LC Red 640
E = 1.90 n = 30
N = N0 x (1.90)30 = N0 x 2.3 x 108
N : number of amplified molecules N0 : initial number of molecules
n : number of amplification cycles E : amplification efficiency
优势: 同时检测2个独立的靶目标序列 应用: 多重 PCR，对多个靶目标同时进行突变分析
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30
15
绝对定量：含内参照和标准品（ 双色检测）
标准品
目的基因（标记 LC Red 640） 内参照（标记 LC Red 705）
未知标本 (26)
阴性对照
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24
12
绝对定量－标准品的准备

序列: 尽可能与目的基因序列相同（同样的扩增子/GC含量）以保 证扩增效率相同。

来源 :
-PCR: 质粒 DNA (最好线状) 纯化的PCR产物 Reference DNA (genomic DNA) -一步法RT-PCR: 体外转录 RNA Reference RNA (total RNA, mRNA)
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绝对定量原理（标准曲线）
Target
未知标本
未知标本
log (F2/F1) log (F2/F1)
n
Crossing Point (Cycles) Crossing Point (Cycles)
标准曲线 (外标准或内标准)
标准曲线 (外标准或内标准)
log (F2/F1) log (F2/F1)
Excitation
Emission
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14
7
分子信标（Molecular Beacon Probe）
Excitation Emission
R
Q
Q
Excitation
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Q
高效低成本的新型探针
变性阶段: 单探针游离，报告基团被淬灭
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6
3
qPCR定量前提：Cp值具高度重现性 PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增 期(对数期)，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好， 即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值 是恒定的。
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累实时监测整个PCR进程，以外参或内参为标准，最后 通过标准曲线对起始模板量进行定量分析的方法。
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2
普通PCR和qPCR 区别
普通PCR 在PCR反应的平台期检测， 分析终点产物的量 检测模式为电泳 动力学范围有限 副产物形成不能鉴别 荧光定量PCR 在PCR反应的对数期检测， 分析起始点产物的量 实时监测荧光信号 动力学范围广(100～1010拷贝 /mL ) 有效鉴别非特异扩增和突变