GUS荧光定量分析方法

GUS荧光定量分析方法

一、GUS 粗蛋白的提取

1、取拟南芥组织100mg，用液氮研磨成粉。

2、加入1ml的GUS提取液（pmsf<蛋白抑制剂>），剧烈震荡。

3、12000rpm离心10分钟，收集上清液，得到GUS粗酶提取液。

二、考马斯亮蓝法测定总蛋白含量

按上表加入不同量的BSA标准蛋白溶液，测定OD595的吸光值，并得出曲线方程。

2、样品总蛋白的测定

自定合适的比例的稀释GUS蛋白溶液，要求稀释后的待测样品颜色介于1中的0到6之间。例如：稀释40倍，5ul样品+195ulGus提取液，取40ul +200ulG-250混匀，室温放置2分钟，测定OD595光吸收值，根据标准曲线计算蛋白含量。

三、GUS活性的测定

用终止液将MU储备液B按上表稀释成0-250nM,用荧光计在激发波长为350nm,发射波长455nm下测定他们的荧光强度做出一条标准曲线，并得出曲线方程。

2荧光定量

1）取两支Ep离心管，各加入1.8mL反应终止液，并编号.

2）在Ep管中加入200提取液，加入50uLGUS粗酶提取液，再加入250ul预热的反应液，混匀。立即取出200ul加入到1号管中，此反应为0时的样品，荧光测定时以此为空白，并开始计时。

3）将反应管放入37摄氏度温箱中进行酶反应，60分钟后，取200ul反应液，加入到2号管中混匀，为反应60分钟时的样品，测定荧光值。

主要溶液的配制：

1、GUS提取缓冲液：

1)0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）50mL:

0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）：557mL0.1mol/LNa2HPO4+42.3mL1mol/L NaH2PO4定容到1000mL

(35.814gNaHPO4.12H2O(358.14)定容到1000mL;15.6g NaH2PO4.2H2O（156.01）定容到100Ml)

2) 0.5M Na2EDTA (pH8.0) 2.00mL:

9.31gEDTA加水剧烈搅拌，加入约1g NaOH, 定容到50 mL.

3) 30% 十二烷基肌氨酸钠0.33 mL：1.5g加水定容到50

4）10% Triton X-100 1 mL:

1 mL Triton X-100 加9 mL水混匀

5）β-巯基乙醇0.07-0.10 mL（马琳论文里面有）

6）甲醇 20ml（网上有的文献里有）

蒸馏水定容至100mL。

2、考马斯亮蓝溶液G-250的配制：

100mg考马斯亮蓝溶液G-250 溶于50 mL95%中，加100 mL85%磷酸，定容到1 mL，过滤后保存于4°C，最终试剂0.01%考马斯亮蓝溶液G-250,4.7%（w/v）乙醇,8.5%（w/v）磷酸.

3、标准蛋白溶液：

50mg牛血清白蛋白（BSA），溶于50 mL0.15M的氯化钠中。配制成1 mg/mL的标准蛋白溶液。

4、0.15M的氯化钠溶液

0.876g氯化钠定容到100 mL

5、4-MU储备液A（4-MU 1 mM）：19.8mg4-MU溶于避光保存

4-MU储备液B（4-MU 1 μM）：10μL4-MU储备液A定容到10 mL

6、终止缓冲液（0.2M Na2CO3）

10.6g Na2CO3 溶于500 mL水。

7、GUS反应缓冲液：

25mg4-MUG溶于25 mL提取缓冲液中

1) 1mol/L Na2HPO4溶液：35.814g Na2HPO4溶于100ml水。

2) 1mol/L NaH2PO4 溶液：15.601g NaH2PO4 溶于100ml水。

3) 0.1M 磷酸缓冲液(PH7.0)：1mol/L Na2HPO4取5.77ml，1mol/L NaH2PO4取4.23ml，定容至100ml。

4) 10％SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10g SDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。

5) 0.5 M EDTA (PH8.0)：在80ml水中加入18.61g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调PH至8.0（约需2g左右的固体NaOH），溶解后定容至100ml。

6) GUS酶提取液：0.1M 磷酸缓冲液（PH7.0）取50ml；10% SDS取1ml；0.5M EDTA(PH8.0)取2ml；Triton X-100取100ul；β-巯基乙醇100ul；用水定容至100ml。

7) MUG底物：称8.8mg MUG，溶于10ml GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。

8) 反应终止液（0.2 mol/L Na2CO3 ）：称2.12Na2CO3 ，用水定容到100ml。

9) 考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250 10mg, 95%乙醇5m1, H3PO4 10ml，定容至l00ml，过滤后4℃保存。

10) １mg/ml BSA：20mg BSA，用GUS提取缓冲液定容至20ml。