荧光定量PCR实验数据分析

检查阴性对照
检查 / 调整基线 检查 / 调整阈值 分析 样品数据
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基线与阈值线的设置

一般情况下选择软件默认的“自动设置”；


特殊情况下或必要时，可以手动设置；
手动设置的原则请查询“Data Analysis on the ABI PRISM® 7700 Sequence Detection
System: Setting Baselines and Thresholds: Guide: Rev A ”，文件号：
若C T相差1，则两个样品的浓度差异为： 两个样品的浓度差异为10倍，则C
差异为：
CT2 - CT1 3.32 lg10 3.32
浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位
浓度增加1倍，CT值减小1个单位
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荧光定量PCR实验常见问题
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病原体核酸检测效果的主要影响因素
导致巨大差别的因素
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分析
• 这些样品在反应的最后阶段才开始扩增，平台期很接近背景。 • 这些样品的扩增曲线出现了指数扩增的区段
• 虽然我们可以认为这些样品是临界阳性，但是对这些样品的定 量结果都是不太准确的。
• 形成这类曲线的原因可能是模板的质量差 (RT / PCR抑制物; 模板浓度低)， 也可能是引物探针的设计问题。 • 试剂原因
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AB荧光定量PCR仪家族
第一、二代 7700 5700 第三、四代 7000 7900 第五代 7300 7500 第六代 stepone /plus
第七代 ViiA 7
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最新型 QuantStudio
荧光定量PCR实验数据分析
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荧光PCR实验结果的分析流程
查验扩增曲线 检查 NTC 检查 阳性对照
正常的扩增曲线
平台期很低
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如何判断它们是真正的扩增？ • 这些曲线都有典型的指数增长期，而且和其他的曲线平行（虽 然比较短）。
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如何判断它们是真正的扩增？ • 同时也具有特征性的三个增长阶段。
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是什么原因造成平台期很低? • 可能是目标模板的浓度太低。
通常如果模板的起始浓度太低, 反应体系会形成大量的引物二 聚体。 − 大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲 线的平台期很低。
对数图
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如何判断它们是否存在扩增？ • 最后，查阅线性图：
−
−
曲线一直没有指数上升的趋势，提示不存在扩增。 轻微的荧光增长可能来源于探针的降解。
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案例3:是否存在扩增？ • 右侧的曲线形状和扩增曲线很相似，但是曲线不光滑。
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如何判断它们是否存在扩增？ • 切换到线性图，可以看到曲线有一定的上升。
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实验结果的考评指标
定性实验：
•是否为显著的“S型”扩增曲线 •扩增曲线的“高度”----表示体现扩增性能的“强度” •阳性对照的Ct值是否在“预期”的位置 ： 过早——污染或加样错误 过晚——存在抑制剂或扩增体系条件不佳 •阴性对照是否报告Ct值 污染、探针特异性差、阈值线设定Leabharlann Baidu低
绝对定量实验：
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两种容易混淆的阴性对照
• 无模板的阴性对照
在反应体系中不加入核酸模板，而以水为替代的对照 目的：监控配制反应体系的试剂是否存在污染。
• 阴性样品的对照
在样品制备过程中，加入已知的阴性样品（或水），并将提取物作为模 板加入反应体系，参与整个实验过程。
目的：监控整个实验操作过程中是否存在污染。
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−
如果使用的试剂背景信号太强，荧光的增长将会很小，导致扩增曲线的 指数增长期会变得很短，或者没有。 荧光信号差的试剂也会有同样的问题。
−
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总结：遵循扩增曲线形态第一，Ct值第二的判读原则。
• 查看MultiComponent Plot：是否有正常的阳性扩增曲线
• 查看扩增曲线的形状：是否有明显扩增阶段（指数增长期）? 指数图下扩增曲线间是否平行?
荧光定量PCR实验数据分
析与常见问题解决
技术支持 黄志
内 容
• Life Technologies 公司定量PCR仪产品概览
• 荧光定量PCR实验数据分析
• 荧光定量PCR实验常见问题的解决
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AB荧光定量PCR仪的发展历史
1995 1997 世界上第一台定量PCR仪--7700型诞生 推出面向医疗系统用户的5700型定量PCR仪
•标准曲线的斜率或扩增效率
•标准曲线的决定系数值：R2
•检测样品是否偏离标准曲线
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•重复样品Ct值的标准差
绝对定量实验效果的评估
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CT值差与模板量差的关系
CT = k lg X0 + b
CT2— CT1= （k lg X02 + b） —（k lg X01 + b） CT2— CT1= k (lg X02 — lg X01 )
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2000
2001 2001
推出7900型384孔定量PCR仪
推出7900型96孔定量PCR仪 推出7000型96孔定量PCR仪
2004
2004
获得定量PCR仪专利－确立AB在业界内的领先地位
第5代定量PCR仪7300\7500型诞生
2007 第6代定量PCR仪StepOne和StepOne Plus问世 2010 第7代定量PCR仪ViiA 7发布 2011 最新荧光定量PCR仪 QuantStudio 12K Flex 发布
−
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案例2:是否存在扩增？
?
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如何判断它们是否存在扩增？
• 首先，和同一反应中的其他扩增曲线相比，这些曲线的形状 不相同。
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如何判断它们是否存在扩增？ • 同时，这些曲线都没有明显的指数增长期。
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如何判断它们是否存在扩增？ • 其次，看Y轴的数值。
−
这些“可疑”曲线的指数增长期范围常常是落在1e-2 的范围内。
CT2— CT1= k lg (X02 /X01 ) lg (X02 /X01 )= (CT2— CT1)/k
CT2 -CT1 X2 10 K X1
X2 CT2 - CT1 k lg X1
当扩增效率为100时，K=-3.32，
T
当扩增效率为100时，K=-3.32，
1 X2 103.32 0.5 X1
4370923 。
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基线的设定

系统背景信号，在扣除背景过程中影响扩增信号的数值，最终影响Ct值。


默认自动分析，比如设定在“3-15”个循环。
手动设置时要避开前期的荧光波动与后期的扩增信号。 必要时可以独立设定制定样品的基线取值范围（V2.0）。
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阈值线的设定

默认设定为同类扩增基线信号标准差的10倍，反映扩增信号具 有统计学显著的意义。不同扩增子应当独立设定阈值线。 手动设置在“指数扩增期”，避开前期的背景荧光波动与后期 的非指数扩增及阴性对照最高点。 对于绝对定量实验，阈值线设定在使得标准曲线的决定系数值 （R2）接近1，斜率接近-3.32的地方。 对于无标准曲线的实验，阈值线设定在使得重复样品Ct值差异 最小的位置。 阈值线设定在保障灵敏度均为最佳的位置
• 查看Y轴的数值：扩增曲线最高点的纵坐标值是否符合预期？
• 在同一坐标系下查看阳性对照与可疑样品的扩增曲线：避免误 判阳性。
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咨询联络方式
• 全国免费技术支持电话： 800 820 8982 或 400 820 8982 • 技术支持邮箱：CNAPMsupport@lifetech.com
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样品采集和储运 导致一般差别的因素
采样部位、保存液、冻融
样品量
核酸抽提
交叉污染、抑制剂、病毒裂解 引物、探针设计/合成质量 核酸的纯度和完整性 预混液的质量
样品量、回收率
核酸定量检测
仪器、循环条件
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导致异常实验数据的常见原因:
实验污染
反应试剂质量问题
未正确密封而导致的试剂蒸发 错误的荧光染料设置 错误的反应程序设置 使用错误的耗材 荧光污染 仪器硬件问题
故障排除时提供有用信息的软件界面
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原始荧光组分曲线-v2.0
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扩增曲线-v2.0
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标准曲线-v2.0
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原始多通道荧光信号-v2.0
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原始多通道荧光信号-v2.0
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质控报告-V2.0
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理想的实验结果
可疑的扩增曲线
案例1:是否存在扩增？
• 一些形状和正常的扩增曲线有区别的曲线，该如何判断呢？