荧光定量PCR实验数据分析
荧光定量pcr结果分析
如果有标准曲线,按照标准曲线计算。
一般都就是相对量。
则用deltaｄｅlｔａCT方法来计算。
举例如下:ﻫ对照组基因A得CT值为２０, 内参(比如βactiｎ)CT值15。
实验组基因A CＴ值１８,内参CＴ值１4。
ﻫ首先算加样量:ｄｅlｔa ＣT＝15-14=1。
２得1次方就是２、也就就是说实验组得加样量就是对照组得2倍、ﻫ基因A: ｄeｌｔａＣT＝2０—1８=2。
2得2次方就是４、也就就是说基因A得量在实验组就是对照组得4倍。
但就是由于加样量就是2倍,所以４处以2＝2,最后得相对量就是2倍、
ﻫ几点注意:ﻫ１。
必须确定扩增得特异性
２、只有相同目标得CT值才能相减(扩增效率有可能不同)
3。
2得某次方只就是理论值,实际扩增效率低于２、ﻫ4。
最好不用Syber Green
由Cｔ值用2＾—△△Ｃｔ法计算计算表达量差异得原理,可以瞧下面得图片:
ﻫ
ﻫ附件得Exｃel文件就是计算用得,感兴趣也可以瞧瞧由Ct值就是如何一步一步算出2^-△△Ct 得。
荧光定量PCR实验数据分析
荧光定量PCR实验数据分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction）是一种基于PCR技术的实验方法，用于定量检测特定DNA序列的丰度。
荧光定量PCR是一种非常重要的分子生物学技术，在基因表达分析、疾病诊断等领域得到广泛应用。
在进行荧光定量PCR实验后，需要对实验数据进行分析，以获取样品中目标DNA序列的丰度信息。
本文将介绍荧光定量PCR实验数据分析的基本步骤和常见方法。
首先，荧光定量PCR数据的分析通常包括以下几个步骤：1.荧光PCR数据的获取：荧光定量PCR实验过程中，荧光信号会被记录下来。
对于每个样品，会获得一条荧光曲线，曲线上的荧光信号强度与PCR循环次数（Ct值）有关。
2. 荧光曲线的阈值设置：荧光曲线上的信号强度在实验的早期循环中较低，随着PCR循环的进行逐渐增加，直至达到一个稳定的平台。
阈值（threshold）是在这个平台上设置的一个信号强度的固定值，用于确定Ct值。
常用的阈值设置方法包括固定阈值法和导数阈值法。
3.Ct值的计算：Ct值是荧光定量PCR实验中的一个重要指标，表示荧光信号达到阈值的循环次数。
在荧光曲线上，Ct值可以通过与阈值的交点来确定。
Ct值越小，表示目标DNA序列的丰度越高。
4.样品之间的Ct值比较：荧光定量PCR实验中，通常需要同时检测一些内部参考基因（如GAPDH）作为对照，以便进行样品之间的Ct值比较。
内部参考基因应在不同样品中表达稳定，其Ct值应接近。
通过对目标基因的Ct值与内部参考基因的Ct值进行比较，可以计算出样品中目标DNA序列的相对丰度。
5.目标DNA序列的绝对丰度计算：通过构建标准曲线，可以将目标DNA序列的相对丰度转化为绝对丰度。
标准曲线是通过在实验中使用一系列已知浓度的目标DNA序列标准品进行绘制的。
通过测量标准品的Ct值并绘制荧光信号与目标DNA序列浓度的关系曲线，可以通过比较样品的Ct值与标准曲线来计算目标DNA序列的绝对丰度。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。
PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。
在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。
2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。
荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。
因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。
二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。
较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。
3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。
在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。
CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。
4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。
荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。
荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。
5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。
通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。
此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。
荧光定量PCR数据分析
利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量METHODS 25, 402–408 (2001)Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitati ve PCR and the 2－△△CT MethodKenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen¶,1*Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ¶ Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。
2－△△CT方法是实时定量P CR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。
另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。
实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。
实时定量PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
荧光定量PCR的原理方法及结果分析
荧光定量PCR的原理方法及结果分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的检测DNA或RNA含量的方法，通过测定荧光信号的强度来确定起始模板数量的多少。
其原理主要包括引物的选择、PCR反应的进行、荧光信号的测定以及数据分析等步骤。
首先，荧光定量PCR需要选择适当的引物。
引物的设计要求首先能够特异性地与目标序列结合，这样才能保证只有起始模板被扩增。
引物的长度通常在18-24个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，碱基序列中不能存在太多的重复序列或者分子倒序等结构。
此外，引物的Tm值应该相近，不应过于接近，以免引物发生二次结合。
另外，荧光标记的引物通常采用双探针（dual-labeled probe）和SYBR Green I染料，二者的优缺点各有不同：双探针对应用的目标突变不敏感，但是对于长序列的目标扩增效果较好；SYBR Green I适用于鉴定多个不同基因的扩增，但是对于PCR产物的目标特异性检测较差。
其次，PCR反应的进行是荧光定量PCR的核心步骤。
反应体系通常包括引物、模板DNA、DNA聚合酶、荧光标记剂和反应缓冲液。
PCR反应过程中，首先是变性，将模板DNA的双链分离；然后是退火，使引物与目标序列结合；接着是延伸，DNA聚合酶在适当的温度下进行链延伸。
PCR反应的循环数通常在25-40之间，具体循环数多少需要根据目标序列的长度和浓度来决定。
PCR反应条件的优化要注意引物浓度、PCR温度和时间。
第三，荧光信号的测定是荧光定量PCR中不可或缺的步骤。
通常，荧光信号的测定可以通过荧光实时扩增仪来进行。
在每一个PCR循环过程中，荧光实时扩增仪会记录下PCR反应管中荧光信号的强度。
随着PCR反应的进行，PCR产物的数量也在逐渐增加，荧光信号的强度也会增加。
荧光信号的强度与PCR产物的数量之间存在着一定的线性关系，利用标准曲线可以将荧光信号的强度转化为起始模板的绝对数量。
实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析
使用高质量的试剂和仪器
高质量的试剂和仪器是实时荧光定量PCR实验的基础，包括 高质量的DNA聚合酶、高灵敏度的荧光探针、可靠的定量 PCR仪等。
选择经过认证的试剂和仪器，并按照说明书正确使用和维护 ，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
优化PCR反应条件
优化PCR反应条件可以显著提高实验 的重复性和准确性，包括调整模板浓 度、引物浓度、循环数等参数。
通过梯度PCR或条件优化实验，可以 找到最佳的反应条件，使扩增曲线更 符合标准曲线的要求。
严格控制实验操作规范
实验操作规范是保证实时荧光定量PCR数据质量的重要环节，包括实验前的准备 、样本处理、加样、扩增和检测等步骤。
基线漂移
01
总结词
基线漂移是指PCR扩增曲线在起始阶段出现非特异性扩增，导致背景信
号过高。
02
详细描述
基线漂移可能是由于模板污染、酶活性降低或反应条件不适等原因引起
的。高背景信号会掩盖特异性扩增信号，导致检测结果不准确。
03
解决方案
在实验过程中，要严格控制操作环境，避免交叉污染。同时，要定期检
查酶活性，确保其处于最佳状态。此外，可以通过软件对扩增曲线进行
03 实时荧光定量PCR常见问 题分析
扩增效率不一致
总结词
扩增效率不一致会导致数据无法准确反映样本中目标基因 的表达水平。
详细描述
扩增效率不一致通常是由于反应条件、引物设计或试剂质量等 问题导致的。这会导致不同样本间的相对表达量出现偏差，从 而影响实验结果的准确性。
解决方案
在实验过程中，要确保反应条件的一致性，包括温度、时间、 循环数等。同时，要选择质量可靠、设计合理的引物和试剂， 并进行预实验以确定最佳的反应条件。
荧光定量pcr结果分析
如果有标准曲线，按照标准曲线计算。
一般都是相对量。
则用delta delta CT方法来计算。
举例如下：
对照组基因A的CT值为20，内参（比如βactin)CT值15。
实验组基因A CT值18，内参CT值14。
首先算加样量：delta CT=15-14=1。
2的1次方是2。
也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。
基因A: delta CT=20-18=2。
2的2次方是4。
也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。
但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。
几点注意：
1。
必须确定扩增的特异性
2。
只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同）
3。
2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2。
4。
最好不用Syber Green
由Ct值用2^-△△Ct法计算计算表达量差异的原理，可以看下面的图片：
附件的Excel文件是计算用的，感兴趣也可以看看由Ct值是如何一步一步算出2^-△△Ct的。
温馨提示：最好仔细阅读后才下载使用，万分感谢！。
荧光定量pcr数据处理
荧光定量pcr数据处理荧光定量PCR数据处理引言：荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和定量目标DNA序列。
在荧光定量PCR实验中，通过引入荧光探针，可以实时监测PCR反应的进程，并根据荧光信号的强度进行定量分析。
本文将详细介绍荧光定量PCR数据处理的方法和步骤。
一、实验前的准备工作在进行荧光定量PCR实验之前，需要准备好以下材料和设备：1. PCR反应体系的各种试剂和酶：包括模板DNA、引物、荧光探针、dNTPs、聚合酶等。
2. 荧光定量PCR仪：用于实时监测PCR反应的荧光信号。
3. PCR试管和盖膜：用于装载PCR反应体系。
4. 离心机：用于混合和离心PCR反应体系。
二、荧光定量PCR数据的获取在进行荧光定量PCR实验时，荧光定量PCR仪会实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化。
根据PCR反应体系中的荧光信号强度，可以得到一系列荧光强度值。
这些荧光强度值可以用来进行后续的数据处理和分析。
三、荧光定量PCR数据处理的步骤1. 背景信号校正由于荧光定量PCR反应中存在一定的背景信号，需要对荧光强度值进行背景信号校正。
背景信号校正的方法有两种：直接校正和相对校正。
直接校正是通过测量反应体系中不含目标序列的荧光强度值来获得背景信号值，然后将目标序列的荧光强度值减去背景信号值。
相对校正是通过测量反应体系中同时包含目标序列和参考序列的荧光强度值，然后将目标序列的荧光强度值除以参考序列的荧光强度值来获得相对的背景信号校正值。
2. 标准曲线的绘制荧光定量PCR实验中通常会设置一系列已知浓度的标准样品，用于构建标准曲线。
标准曲线是荧光信号强度和DNA分子量（或浓度）之间的关系曲线，根据标准曲线可以定量测定未知样品中目标序列的浓度。
标准曲线的绘制方法一般有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量是通过标准曲线上各个点的荧光强度值和已知浓度值，建立荧光强度和浓度之间的线性关系，从而根据未知样品的荧光强度值推算出其浓度值。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
AB荧光定量PCR仪家族
第一、二代 7700 5700 第三、四代 7000 7900 第五代 7300 7500 第六代 stepone /plus
第七代 ViiA 7
4
最新型 QuantStudio
荧光定量PCR实验数据分析
5
荧光PCR实验结果的分析流程
查验扩增曲线 检查 NTC 检查 阳性对照
15
两种容易混淆的阴性对照
• 无模板的阴性对照
在反应体系中不加入核酸模板，而以水为替代的对照 目的：监控配制反应体系的试剂是否存在污染。
• 阴性样品的对照
在样品制备过程中，加入已知的阴性样品（或水），并将提取物作为模 板加入反应体系，参与整个实验过程。
目的：监控整个实验操作过程中是否存在污染。
16
39
样品采集和储运 导致一般差别的因素
采样部位、保存液、冻融
样品量
核酸抽提
交叉污染、抑制剂、病毒裂解 引物、探针设计/合成质量 核酸的纯度和完整性 预混液的质量
样品量、回收率
核酸定量检测
仪器、循环条件
14
导致异常实验数据的常见原因:
实验污染
反应试剂质量问题
未正确密封而导致的试剂蒸发 错误的荧光染料设置 错误的反应程序设置 使用错误的耗材 荧光污染 仪器硬件问题
35
分析
• 这些样品在反应的最后阶段才开始扩增，平台期很接近背景。 • 这些样品的扩增曲线出现了指数扩增的区段
• 虽然我们可以认为这些样品是临界阳性，但是对这些样品的定 量结果都是不太准确的。
• 形成这类曲线的原因可能是模板的质量差 (RT / PCR抑制物; 模板浓度低)， 也可能是引物探针的设计问题。 • 试剂原因
若C T相差1，则两个样品的浓度差异为： 两个样品的浓度差异为10倍，则C
差异为：
CT2 - CT1 3.32 lg10 3.32
浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位
浓度增加1倍，CT值减小1个单位
12
荧光定量PCR实验常见问题
13
病原体核酸检测效果的主要影响因素
导致巨大差别的因素
−
如果使用的试剂背景信号太强，荧光的增长将会很小，导致扩增曲线的 指数增长期会变得很短，或者没有。 荧光信号差的试剂也会有同样的问题。
−
36
总结：遵循扩增曲线形态第一，Ct值第二的判读原则。
• 查看MultiComponent Plot：是否有正常的阳性扩增曲线
• 查看扩增曲线的形状：是否有明显扩增阶段（指数增长期）? 指数图下扩增曲线间是否平行?
•标准曲线的斜率或扩增效率
•标准曲线的决定系数值：R2
•检测样品是否偏离标准曲线
10
•重复样品Ct值的标准差
绝对定量实验效果的评估
11
CT值差与模板量差的关系
CT = k lg X0 + b
CT2— CT1= （k lg X02 + b） —（k lg X01 + b） CT2— CT1= k (lg X02 — lg X01 )
对数图
32
如何判断它们是否存在扩增？ • 最后，查阅线性图：
−
−
曲线一直没有指数上升的趋势，提示不存在扩增。 轻微的荧光增长可能来源于探针的降解。
33
案例3:是否存在扩增？ • 右侧的曲线形状和扩增曲线很相似，但是曲线不光滑。
34
如何判断它们是否存在扩增？ • 切换到线性图，可以看到曲线有一定的上升。
正常的扩增曲线
平台期很低
25
如何判断它们是真正的扩增？ • 这些曲线都有典型的指数增长期，而且和其他的曲线平行（虽 然比较短）。
26
如何判断它们是真正的扩增？ • 同时也具有特征性的三个增长阶段。
27
是什么原因造成平台期很低? • 可能是目标模板的浓度太低。
通常如果模板的起始浓度太低, 反应体系会形成大量的引物二 聚体。 − 大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲 线的平台期很低。
9
实验结果的考评指标
定性实验：
•是否为显著的“S型”扩增曲线 •扩增曲线的“高度”----表示体现扩增性能的“强度” •阳性对照的Ct值是否在“预期”的位置 ： 过早——污染或加样错误 过晚——存在抑制剂或扩增体系条件不佳 •阴性对照是否报告Ct值 污染、探针特异性差、阈值线设定过低
绝对定量实验：
检查阴性对照
检查 / 调整基线 检查 / 调整阈值 分析 样品数据
6
基线与阈值线的设置
一般情况下选择软件默认的“自时，可以手动设置；
手动设置的原则请查询“Data Analysis on the ABI PRISM® 7700 Sequence Detection
System: Setting Baselines and Thresholds: Guide: Rev A ”，文件号：
2000
2001 2001
推出7900型384孔定量PCR仪
推出7900型96孔定量PCR仪 推出7000型96孔定量PCR仪
2004
2004
获得定量PCR仪专利－确立AB在业界内的领先地位
第5代定量PCR仪7300\7500型诞生
2007 第6代定量PCR仪StepOne和StepOne Plus问世 2010 第7代定量PCR仪ViiA 7发布 2011 最新荧光定量PCR仪 QuantStudio 12K Flex 发布
荧光定量PCR实验数据分
析与常见问题解决
技术支持 黄志
内 容
• Life Technologies 公司定量PCR仪产品概览
• 荧光定量PCR实验数据分析
• 荧光定量PCR实验常见问题的解决
2
AB荧光定量PCR仪的发展历史
1995 1997 世界上第一台定量PCR仪--7700型诞生 推出面向医疗系统用户的5700型定量PCR仪
故障排除时提供有用信息的软件界面
17
原始荧光组分曲线-v2.0
18
扩增曲线-v2.0
19
标准曲线-v2.0
20
原始多通道荧光信号-v2.0
21
原始多通道荧光信号-v2.0
22
质控报告-V2.0
23
理想的实验结果
可疑的扩增曲线
案例1:是否存在扩增？
• 一些形状和正常的扩增曲线有区别的曲线，该如何判断呢？
• 查看Y轴的数值：扩增曲线最高点的纵坐标值是否符合预期？
• 在同一坐标系下查看阳性对照与可疑样品的扩增曲线：避免误 判阳性。
37
咨询联络方式
• 全国免费技术支持电话： 800 820 8982 或 400 820 8982 • 技术支持邮箱：CNAPMsupport@
38
4370923 。
7
基线的设定
系统背景信号，在扣除背景过程中影响扩增信号的数值，最终影响Ct值。
默认自动分析，比如设定在“3-15”个循环。
手动设置时要避开前期的荧光波动与后期的扩增信号。 必要时可以独立设定制定样品的基线取值范围（V2.0）。
8
阈值线的设定
默认设定为同类扩增基线信号标准差的10倍，反映扩增信号具 有统计学显著的意义。不同扩增子应当独立设定阈值线。 手动设置在“指数扩增期”，避开前期的背景荧光波动与后期 的非指数扩增及阴性对照最高点。 对于绝对定量实验，阈值线设定在使得标准曲线的决定系数值 （R2）接近1，斜率接近-3.32的地方。 对于无标准曲线的实验，阈值线设定在使得重复样品Ct值差异 最小的位置。 阈值线设定在保障灵敏度均为最佳的位置
−
28
案例2:是否存在扩增？
?
29
如何判断它们是否存在扩增？
• 首先，和同一反应中的其他扩增曲线相比，这些曲线的形状 不相同。
30
如何判断它们是否存在扩增？ • 同时，这些曲线都没有明显的指数增长期。
31
如何判断它们是否存在扩增？ • 其次，看Y轴的数值。
−
这些“可疑”曲线的指数增长期范围常常是落在1e-2 的范围内。
CT2— CT1= k lg (X02 /X01 ) lg (X02 /X01 )= (CT2— CT1)/k
CT2 -CT1 X2 10 K X1
X2 CT2 - CT1 k lg X1
当扩增效率为100时，K=-3.32，
T
当扩增效率为100时，K=-3.32，
1 X2 103.32 0.5 X1