实时荧光定量PCR详细操作步骤

实时荧光定量PCR

组织RNA提取：

一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。

反转录反应

反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。

反转录反应条件如下。

37°C 15 min（反转录反应）

85°C 5 sec（反转录酶的失活反应）

Real Time PCR反应

选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。

1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

全班40人，分为5组，每组做8管。4管做BDNF，4管做18S rRNA。4管BDNF 或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 μl。

2）三步法PCR

首先95°C 作用3 min。

PCR进行35个循环。

步骤温度时间

变性95°C 30 秒

退火58°C 30 秒

延伸72°C 30 秒

融解曲线

温度时间变温速度

95°C 0秒20°C/秒

55°C 15秒20°C/秒95°C 0秒0.1°C/秒